| Федеральное агентство по образованию
Кафедра
В исследовании использовали сыворотку крови, полученную путем центрифугирования крови при 4000 об/мин в течении 30 мин. Забор крови осуществлялся из локтевой вены у спортсменов квалификации мастер спорта и мастер спорта международного класса, вид спорта: легкая атлетика, средний бег и триатлон (n=12). В качестве контрольного материала использовали сыворотку крови студентов и аспирантов ВУЗов города Пензы (n=12).
Каждая группа делилась на две подгруппы – до нагрузки и на субмаксимальной нагрузке. Физическую работу создавали с помощью программируемого тредбана Tunturi 90, начиная со скорости 3,5 м/с, повышая каждые две минуты на 0,5 м/с до скорости, характеризующейся подъемом пульса до 180 ударов в минуту, на которой испытуемый бежал до состояния полного утомления. Пробы крови отбирались из локтевой вены до нагрузки и непосредственно после остановки тредбана.
Концентрацию вещества Р определяли иммуноферментным методом ELISA [42] в сыворотке крови. Для получения сыворотки кровь центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин.
2.2.3 Метод определения активности КПN
Сыворотку крови (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ СоSO4 в 100 мМ трис-НСl буфере, рН=7,6,и преинкубировали 8 мин при 37°С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл кбз-Gly-Arg в вышеуказанном буфере. Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося Arg нингидриновым методом (добавляли 1 мл нингидрина). Далее инкубация 12 мин на кипящей водяной бане. Затем пробы колориметрировали на КФК-2 при λ=590 нм. Активность КПN определяли по отщеплению Arg от кбз-Gly-Arg как Со²+
- активируемую. Активность фермента выражали в нмоль Arg, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли по методу Лоури.
Активность ангиотензинпревращающего фермента определяли по образованию Gly-Arg из кбз-Gly-Gly-Arg при рН=8,2, как активность, ингибируемую каптоприлом. Сыворотку крови (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ трис-НСI буфере,рН=8,2, или 20 мкл буфера и преинкубировали 8 мин при 37°С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл раствора кбз-Gly-Gly-Arg в вышеуказанном буфере. Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося Gly-Arg нингидриновым методом (добавляли 1 мл нингидрина). Далее инкубация 12 мин на кипящей водяной бане. Пробы колориметрировали на КФК-2 при λ=590 нм. Активность ангиотензинпревращающего фермента определяли как разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих каптоприл. Активность фермента выражали в нмоль Gly-Arg, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли по методу Лоури.
Для определения активности лейцинаминопептидазы 90 мкл сыворотки крови смешивали с 10 мкл раствора пуромицина, приготовленного на соответствующем буфере (в случае опытной пробы (I)) и к 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) (в случае опытной пробы (II) и контрольной пробы). Далее проводили преинкубацию 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 100 мкл 310 мкМ раствора лей-b-нафтиламина, приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливали прибавлением 40 мкл 10% раствора ТХУ. В контрольные пробы добавляли 100 мкл субстрата. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2). Измерение флюоресценции образовавшегося b-нафтиламина проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λex
=360 нм и λem
=420 нм в кювете толщиной 1 см. Активность фермента определяли как разность между опытной пробой (I) и контрольной пробой и выражали в мкмоль b-нафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Белок определяли методом Лоури.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные отличия в значениях между опытной и контрольной группами считали достоверными при р <0,05.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБУЖДЕНИЕ
Содержание вещества Р в сыворотке крови спортсменов в покое было на 300% выше, чем у неспортсменов. При физической работе у спортсменов не наблюдалось изменений в его концентрации, в то время как у неспортсменов происходило повышение уровня вещества Р на 60%.
Рис. 1 Влияние максимальной физической нагрузки на уровень вещества Р в крови спортсменов и неспортсменов в норме и при физической работе. Условные обозначения: 
- спортсмены, 
- неспортсмены.
*** - Р < 0,001 по сравнению с физиологическим состоянием, +++ - Р < 0,001 по сравнению с неспортсменами.
Активность пептидил-дипептидазы А, карбоксипептидазы N и лейцинаминопептидазы у спортсменов в физиологическом состоянии была выше, чем у людей, не занимающихся спортом. После анаэробной работы у спортсменов не наблюдалось изменений в активности исследуемых ферментов, в то время как у неспортсменов происходило повышение активности данных пептидгидролаз.
Рис. 2 Влияние максимальной физической нагрузки на активность пептидилдипептидазы А в сыворотке крови спортсменов. Условные обозначения:
- спортсмены,
- неспортсмены.
** - Р < 0,01 по сравнению с физиологическим состоянием,
++ - Р < 0,01 по сравнению с неспортсменами.
Рис. 3 Влияние максимальной физической нагрузки на активность карбоксипептидазы N в сыворотке крови спортсменов. Условные обозначения:
- спортсмены,
- неспортсмены.
** - Р < 0,01 по сравнению с физиологическим состоянием,
++ - Р < 0,01 по сравнению с неспортсменами.
Рис. 3 Влияние максимальной физической нагрузки на активность лейцинаминопептидазы в сыворотке крови спортсменов. Условные обозначения:
- спортсмены,
- неспортсмены.
** - Р < 0,01 по сравнению с физиологическим состоянием,
+++ - Р < 0,001 по сравнению с неспортсменами.
Результаты нашего исследования показывают, что существенную роль в адаптации к физической работе у спортсменов высокой квалификации играет вещество Р, обладающее широким спектром действия – модулирующее болевую чувствительность, повышающее устойчивость к стрессу. Одним из механизмов регуляции уровня вещества Р при физической работе является изменение активности ферментов его обмена. Адаптационные перестройки функционирования пептидергической системы приводят к значительной активизации и стабилизации ее работы – в физиологическом состоянии у спортсменов все ее компоненты работают интенсивнее, чем у неспортсменов, и ее функционирование не изменяется при совершении физической работы у спортсменов высокой квалификации.
Таким образом, пептидергическая система активно вовлечена в адаптивные процессы к физической работе и перестройки в ее функционировании являются одними из тех факторов, от которых зависит спортивный результат.
ВЫВОДЫ
1. Физическая работа вызывает существенные адаптационные изменения в функционировании пептидергической системы. У спортсменов высокой квалификации в физиологическом состоянии по сравнению с неспортсменами все компоненты системы работают интенсивнее.
2. Существенную роль в адаптации к физической работе у спортсменов высокой квалификации играет вещество Р, обладающее широким спектром действия – модулирующее болевую чувствительность, повышающее устойчивость к стрессу.
3. Одним из механизмов регуляции уровня вещества Р при физической работе является изменение активности ферментов его обмена – пептидил-дипептидазы А, карбоксипептидазы N и лейцинаминопептидазы.
Список литературы
1. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Нейропептиды // в кн. “Нейрохимия” под ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В.- М.: Издательство института биомедицинской химии РАМН.-1996.- С.296-333.
2. Бабичев В.Н. Нейроэндокринный контроль процессов пубертации // Усп. совр. биол. – 1994. – 114, № 3. – С. 330-344.
3. Бабичев В.Н., Миронов С.Ф. Нейропептиды мозга и их нейроэндокринные эффекты // Пробл. эндокринол. – 1981. – № 3. – С. 78-85.
4. Блум Ф., Лейзерсон А., Хофстедтер Л. Мозг, разум и поведение / Пер. с англ. - М.: Мир, 1988. - 248 с.
5. Бэйрд Д.Т. Яичник / Гормональная регуляция размножения у млекопитающих. – М.: Мир. – 1987. – С. 118-144.
6. Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Механизм регуляции активности и биологическая роль карбоксипептидазы H – фермента процессинга нейропептидов // Биохимия - 1995. - 60, № 12. - С. 1491-1497.
7. Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Протеолитические ферменты: субклеточная локализация, свойства и участие в обмене нейропептидов // Биохимия. – 1996. - 61, № 5. - С. 771-785.
8. Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Об участии некоторых ферментов нейропептидов в механизмах эмоционального стресса // Физиол. журн.-1995.- т.81.- №5.- С.1025-1028
9. Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Множественность молекулярных форм растворимых карбоксипептидазо-В-подобных ферментов головного мозга кошки // Укр. биохим. журн. – 1993.– 65, № 4. – С. 17-21.
10. Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. О взаимосвязи между активностью карбоксипептидазы Н и ангиотензинпревращающего фермента // Биохимия. – 1995. – 60, N 1. – С. 144-149.
11. Генгин М.Т. Особенности структурно-функциональной организации и физико-химические свойства нелизосомальных пептидгидролаз мозга животных: Автореф. дис. … док. биол. наук. – Пенза, 2002.
12. Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Щетинина Н.В. Активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови крыс в норме и при эмоциональном стрессе // Укр. биохим. журн. – 1994. – 66, № 2. – С. 139-142.
13. Генгин М.Т., Соловьев В.Б., Сметанин В.А., Пазялова А.А., Симкина О.В., Коновалов А.Н., Кузичкин Д.С., Шашкина Н.К., Генгина Н.М., Субботина К.Б. Влияние атропина на активность ангиотензин-превращающего фермента и карбоксипептидазы N в сыворотке крови крыс // Украинский биохимический журнал. – 2005. – Т. 77, № 6. – С. 78-80.
14. Гомазков О.А. Функциональная биохимия регуляторных пептидов.– М.: Наука. 1993.
15. Гомазков О.А. Энзимологические основы физиологического действия регуляторных пептидов // Биологические науки. – 1986. – № 2. – С. 13-23.
16. Гомазков О.А., Комиссарова Н.В., Петрий О.П., Панфилов А.Д. Возрастные и регионарные изменения ангиотензинпревращающей и кининдеградирующей активности в мозге агрессивных крыс // Бюлл. эксперим. биол. мед. – 1987. – 104, № 7. – С. 18-20.
17. Гомазков О.А., Панфилов А.Д., Комиссарова Н.В., Ростовцев А.П. Влияние длительного потребления этанола на физиологическое состояние и изменения активности пептидаз мозга у мурицидных (агрессивных) крыс // Журн. высш. нервн. деят. – 1992. – 42, № 4. – P. 771-777.
18. Гомазков О.А., Панфилов А.Д., Ростовцев А.П., Комиссарова Н.В., Фомин В.В., Григорьянц О.О. Регионарная активность энкефалин- и ангиотензин II-образующих пептидаз мозга и периферических тканей у крыс с различным влечением к этанолу // Вопр. мед. химии. – 1991. – 37, N 4. – С. 33-37.
19. Гормонотерапия: Пер. с нем. / Под ред. Шамбаха Х., Кнаппе Г., Карола В. – М.: Медицина, 1988, 416 с.
20. Дмитриев А.Д. Биосинтез нейропептидов // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Фармакол. химиотерапевт. средства. – 1982. – 43. – С. 7-49.
21. Држевецкая И.А. Основы физиологии обмена веществ и эндокринной системы. – М.: Высш. шк., 1994, 256 с.
22. Замятнин А.А. Общие функциональные особенности зндогенных регуляторных олигопептидов // Физиол. ж. – 1992. – 78, № 9. – С. 39-49.
23. Звягинцева М.А. Роль пептида дельта-сна в электрической стабильности сердца // Кардиология. - 1988. - №3. - С. 89-91.
24. Корнева Е.А. Регуляторные пептиды как модуляторы защитных функций организма // Физиол. ж. – 1985. – 75, № 5. – С. 656-665.
25. Кост О.А., Ламзина Н.А., Казанская Н.Ф. Микрогетерогенность ангиотензин-превращающего фермента, как фактор регуляции его в организме // Механизмы регуляции клеточной активности: (Ташкент, 18 – 22 сент. 1989 г.): Тез. докл. – Москва, 1989. – С. 40.
26. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Пер. с англ. / Под ред. Гинодмана Л.М. – М.: Мир, 1993.
27. Никишин Н.Н., Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Активность ангиотензинпревращающего фермента в отделах головного мозга крыс, обладающих различной устойчивостью к эмоциональному стрессу в норме и при стрессе // Укр. биохим. журн. – 1994. – 66, № 5. – С. 53-57.
28. Панченко Л.Ф., Брусов О.С., Беляев Н.А. Исследование механизма действия этанола на активность энкефалиназы A мозга крыс // Бюлл. эксперим. биол. мед.– 1984.– 97, № 6.– С. 691-692.
29. Реминяк В.И. Некоторые нейрохимические критерии прогноза эффективности терапии атропиновыми комами больных шизофренией // Тезисы докл. IX Всесоюз. конференции по биох. НС. – 1983. – Ереван.
30. Сахаров И.Ю., Данилов С.М., Духанина Е.А. Получение и молекулярно-кинетические свойства ангиотензинпревращающего фермента из сердца человека // Биохимия. – 1986. – 51, N 11. – С. 1836-1842.
31. Соловьев В.Б., Генгин М.Т. Активность пептидил-дипептидазы А и карбоксипептидазы N в сыворотке крови пациентов с болезнью Альцгеймера // Украинский биохимический журнал. – 2007. – Т. 79, № 6. – С. 103-105.
32. Судаков К. В. Олигопептиды в механизмах устойчивости к эмоциональному стрессу//Патол. физиология и эксперим. терапия.-1989.-Вып. 1.-С.3-11.
33. Сухоруков В.С., Тарабрин С.Б. Роль пролактина в регуляции функций мужской гонады // Усп. совр. биол. – 1993. – 113, № 3. – С. 366-376.
34. Теппермен Дж., Теппермен У. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс: Пер. с англ. / Под ред. Ажипа Я.И. – М.: Мир, 1989.
35. Федоров Б. М. Стресс и система кровообращения. -М.: Медицина, 1991. - 320с
36. Хрусталева Н.А. Выделение, очистка, некоторые физико-химические свойства лейцинаминопептидазы миелина и диагностическое значение этого фермента при демиелинизирующих заболеваниях // Автореф. канд. дис. – Москва. – 1987.
37. Юматов Е.А. Пептидно-нейромедиаторные механизмы устойчивости к эмоциональному стрессу // Стресс и психологическая патология. - М.: Московский НИИ психиатрии, 1983. - С. 7-12.
38. Юматов Е.А., Гехт К., Скоцеляс Ю.Г. Субстанция Р как фактор устойчивости к эмоциональному стрессу // Журн. выс. нервн. деятельности.-1984.-34.-4.-С.771-777.
39. Azaryan A.V., Hook V.Y.H. Distinct properties of prohormone thiol protease (Ptp) compared to cathepsin B, cathepsin L, and cathepsin H - evidence for Ptp as a novel cysteine protease // Arch. Biochem. Biophys. – 1994. – 314, N 1. – P. 171‑177.
40. Azaryan A.V., Hook V.Y.H. Unique cleavage specificity of prohormone thiol protease related to proenkephalin processing // FEBS Lett. – 1994. – 341, N 2-3. – P. 197-202.
41. Barnes K., Turner A.J., Kenny A.J. Membrane localization of endopeptidase-24.11 and peptidyl dipeptidase A (angiotensin converting enzyme) in the pig brain: a study using subcellular fractionation and electron microscopic immunocytochemistry // J. Neurochem. – 1992. – 58, N 6. – P. 2088-2096.
42. Bouassida A. et al. // J. of Sports Science and Med. 2006, V 5, P. 172 – 181
43. Clemens D.L., Okamura T., Inagami T. Subcellular localization of angiotensin-converting enzyme in cultured neuroblastoma cells // J. Neurochem. – 1986. – 47, N 6. – P. 1837-1842.
44. Chesselet M.F., Hook V.Y. Carboxypeptidase H-like immunoreactivity in the striatum of cats and monkeys // Regul. Pept. – 1988. – 20, N 2. – P. 151-159.
45. Davidson H.W., Hutton J.C. The insulin-secretory-granule carboxypeptidase H: Purification and demonstration of involvement in proinsulin processing // Biochem. J. – 1987. – 245, N 2. – P. 575-582.
46. Demmer W., Brand K. A dipeptidyl carboxypeptidase in brain synaptic membranes active in the metabolism of enkephalin containing peptides // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1983. – 114, N 2. – P. 804-812.
47. Devi L. Tissue distribution of a dynorphin-processing endopeptidase // Endocrinology. – 1993. – 132, N 3. – P. 1139-1144.
48. Dupont A.. Sabord P., Merand G. el al. Age-related changes in central nervous system eukephalins substance P // Life Sci. - 1981. - Vol. 29. - №22. - P. 2317-2322.
49. Edwards C.R., Padfield P.L. Angiotensin-converting enzyme inhibitors: past, present and bright future // Lancet. – 1985. – 8419. – P. 30-34.
50. Erdos E.G., Skidgel R.A. Angiotensin-I-converting enzyme // Lab. Inuest. – 1987. – 56, – N 4. – P. 345-348.
51. Fraticante L.I., Rotrosen I., Siekiorski I., Fracer H., Gershon S. Enkephalin inactivation by N-terminal tyrosine cleavage: purification and partial characterisation of a highly specific enzyme from human brain // Life Sci. – 1980. – 26, N 20. – P. 1697-1706.
52. Fricker L.D., Plummer T.H., Snyder S.H. Enkephalin convertase: potent, selective and irreversible inhibitors // Biochem. and Biophys. Res. Commun. – 1983. – 11, N 3. – P. 994-1000.
53. Fricker L.D., Snyder S.H. Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1982. – 79. – P. 3886-3890.
54. Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephaline-synthesizing carboxypeptidase // J. Biol. Chem. – 1983. – 258, N 18. – P. 10950-10955.
55. Gainer H., Russel J.T., Loh Y.P. The enzymology and intracellular organization of peptide precursor processing: the secretory vesicle hypothesis // Neuroendocrinology. - 1985. – 40, N 1. – P. 171-184.1992. – 131, N 3.
56. Gibson A.M., Biggins J.A., Lauffart B., Mantle D., McDermott J.R. Human brain leucyl aminopeptidase: Isolation, characterization and specificity against some neuropeptides // Neuropeptides. – 1991. – 19, N 3. – P. 163-168.
57. Jukic D. Neurokinin receptors antagonists: old and new. // Life Sci. 1991, Vol. 49, P. 1463.
58. Hook V.Y. Carboxypeptidase B-like activity for the processing of enkephalin precursors in the membrane component of bovine adrenomedullary chromaffin granules // Neuropeptides. – 1984. – 4, N 2. – P. 117-126.
59. Hook V.Y.H., LaGamma E.F. Product inhibit of carboxypeptidase H // J. Biol. Chem. – 1987. – 262, N 26. – P. 12583-12588.
60. Hooper N.M. Angiotensin converting enzyme: implications from molecular biology for its physiological functions // Int. J. Biochem. – 1991. – 23, N 7/8. – P. 641-647.
61. Hooper N.M., Turner A.J. Charasterization of angiotensin-converting enzyme from pig brain // Biochem. Soc. Trans. – 1986. – 14, N 6. – P. 1249-1250.
62. Hughes J. (ed.). Centrally Acting Peptides, University Park Press, 1978. Iversen S.D., Iversen L.L. Behavioral pharmacology, Oxford University Press, second
63. Krause J. // PNAS USA 1987, Vol. 84, P. 881.
64. L.D. Peptide processing exopeptidases: amino- and carboxypeptidases involved with peptide biosynthesis // Peptide biosynthesis and processing (Fricker L.D. ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1991. – P. 199-230.
65. Loh Y.P., Birch N.P., Castro M.G. Pro-opiomelanocortin and pro-vasopressin converting enzyme in pituitary secretory vesicles // Biochimie. – 1988. – 70, N 1. – P. 11-16.
66. Loh Y.P., Parish D.C., Tuteja R. Purification and charasterization of a paired basic residue-specific pro-opiomelanocortin converting enzyme from bovine pituitary intermediate lobe secretory vesicles // J. Biol. Chem. – 1985. – 260, N 12.
67. Lynch D.R., Venable J.C., Snyder S.H. Enkephalin convertase in the heart: similar disposition to atrial natriuretic factor // Endocrinology.– 122, N 6.– P. 2683-2691.
68. Maggi C. , Manzini S. Tachykmin Receptor Antagonists. // Drugs and the Lung 1994, 507-520.
69. Nawa H. // Nature 1983, Vol. 306, Р. 32.
70. Norenberg U., Richter D. Processing of the oxytocin precursor: isolation of an exopeptidase from neurosecretory granules of bovine pituitaries // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1988. – 156, N 2. – P. 898-904.
71. Rouille Y., Chauvet J., Acher R. Partial conversion of vasopressinyl-Gly-Lys-Arg into pharmacologically active vasopressin through secretory granule carboxypeptidase E and alpha-amidating processing enzymes // Biochem. Int. – 1992. – 26, N 4. – P.739-746.
72. Schnebli H.P., Phillipps M.A., Barclay R.K. Isolation and characterization of an enkephalin-degrading aminopeptidase from rat brain // Biochim. Biophys. Acta. – 1979. – 569, N 1. – P. 89-98.
73. Seidah N.G., Chretien M. Proprotein and prohormone convertases of the subtilisin family - recent developments and future perspectives // Trends Endocrinol. Met. – 1992. – 3, N 4. – P. 133-140.
74. Shimamura M., Hazato T., Iwaguchi T. A new aminopeptidase in monkey cerebral membrane fraction: hydrolysis of enkephalin // Brain Res. – 1988. – 445. – P. 350-353.
75. Skidgel R.A., Erdos E.G. The broad substrate specificity of human angiotensin I converting enzyme // Clin. Exp. Hypertens. – 1987. – A9, N 2/3. – P. 243-259.
76. Smyth D.G., Maruthainar K., Darby N.J., Fricker L.D. Catalysis of slow C terminal processing reactions by carboxypeptidase H // J. Neurochem. – 1989. – 53, N 2. – P. 489-493.
77. Steiner D.F. The biosynthesis of biologically active peptides: a perspective // Peptide Biosynthesis and Processing (Fricker L.D., ed.).– CRC Press, Boca Raton, Florida, 1991.– P. 1-16.
78. Supattapone S., Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of a membrane-bound enkephalin-forming carboxypeptidase, «enkephalin convertase» // Neurochem. – 1984. – 42, N 4. – P. 1017-1023.
содержание ..
188
189
190 ..
|