Главная      Лекции     Лекции (разные) - часть 9

 

поиск по сайту           правообладателям

 

 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  261  262  263   ..

 

 

работа

работа

Московский Государственный Университет

им. М. В. Ломоносова.

Факультет биоинженерии и биоинформатики

Щербинин Дмитрий Сергеевич

Компьютерная аннотация
стрептомицинового оперона бактерий

Научный руководитель:

Рассохин Т. И.

Москва

2003 г.

Аннотация

Стрептомицин - антибиотик, образующийся в процессе жизнедеятельности лучистых грибов Streptomyces globisporus streptomycini или других родственных микроорганизмов.

Стрептомицин обладает широким спектром антимикробного действия. Антибиотик активен в отношении микобактерий туберкулеза, а также большинства грамм-отрицательных бактерий (кишечная палочка, палочка Фридлендера, палочка инфлюэнцы, возбудители чумы, туляремии, бруцеллеза) и некоторых грамм-положительных (стафилококки) микроорганизмов; менее активен в отношении стрептококков, пневмококков. Не действует на анаэробы и риккетсии. Действует стрептомицин бактерицидно. Эффект связан с подавлением синтеза белка на рибосомах. Наиболее серьёзным препятствием при лечении туберкулёза - возросшая первичная (исходная) лекарственная устойчивость возбудителей заболевания: в 3 и более раза по сравнению с 60-ми годами; инфицирование населения микобактериями, приобретшими резистентность в процессе лечения. [1]

Введение

В структуру стрептомицинового оперона E. coli входят гены рибосомных белков малой субчастицы S12 (rpsL) и S7 (rpsG), транляционных факторов EF-G и EF-Tu. Белок S7 является регуляторным белком стрептомицинового оперона. При отсутствии свободной рРНК в клетках E.coli белок S7 связывается с межцистронным участком S12-S7 и ингибирует синтез белков стрептомицинового оперона [2-4] (Рис. 1). Длина межцистронного фрагмента между стоп-кодоном белка S12 и старт-кодоном белка S7 – около 100 нуклеотидов.

Рис. 1. Модель вторичной структуры межцистронного фрагмента S12-S7 E . coli .

Фенотипическая устойчивость E. coli к антибиотику стрептомицину обеспечивается мутациями в гене белка S12. Поскольку стрептомицин является важным терапевтическим агентом в медицине и ветеринарии, изучение регуляции синтеза белков стрептомицинового оперона и филогенетический анализ известных бактериальных оперонов является актуальной проблемой. При общей высокой степени гомологии между рибосомными белками в различных организмах размеры и нуклеотидный состав межцистронной области, ответственной в E. coli за регуляцию экспрессии генов оперона отличаются. Выявление общих закономерностей и установление основных регуляторных районов в стрептомициновых оперонах необходимо для полного понимания процесса регуляции и разработки новых терапевтических агентов.

Цель данной работы – определить, является ли такой механизм аутогенной регуляции белком S7 собственного синтеза уникальным для E . coli , или же существуют бактерии со схожим механизмом.

Материалы и методы

1. Построение выравнивания всех известных рибосомных белков S7 эубактерий, определение позиции старт-кодона.

В системе SRS (http://srs.ebi.ac.uk) найдены нуклеотидные последовательности изученных эубактерий*:

Actinobacteria ; Aquificiales; Cyanobacteria; Cytophagales; Spirochagales; Chlamydiales; Thermotogales; Thermus (Deinococculus); CFB(Green sulfur); Green non-sulfur;

Pasteurellaceae; Salmonella ; Pseudomonas ; Emterobacteriaceae ; Rhodospirillaceae; Sphingomonadaceae; Rhodobacter ; Rhizobiaceae ; Ricketsiales ; Caulobacter; Bordetella;

Neisseria ; Burkholderia; Bacillus ; Clostridium ; Staphylococcus ; Heliobacterium; Mollicutes ; Streptococcus ; Enterococcus .

Жирным шрифтом выделены найденные и использованные в работе геномы бактерий.

a) Для поиска был выбран банк EMBL.

b) В окне “Organism name” были поочерёдно введены названия соответствующих групп эубактерий (см. список бактерий)

с) В окне “Features: Gene” было введено rpsG,

d) В другом, таком же окне было введено rpsL (для того, чтобы в найденных последовательностях был не только ген белка S7, но и S12)

Записаны позиции (начало и конец) гена rpsG, учитывая, что среди найденных последовательностей могут быть как прямые (rpsL расположен до rpsG), так и комплементарные (rpsL расположен после rpsG). Для построения комплементарных последовательностей использована программа Revseq из пакета EMBOSS.

2. Экстракция нуклеотидных последовательностей области слева от старт-кодона белка S7, построение выравнивания полученных межцистронных фрагментов.

При помощи программы CutseQ из найденных последовательностей был выделен участок, отстоящий от начала rpsG на 200 нуклеотидов (т.к. близкие к str оперону E . с oli участки могут находиться как между генами S7 и S12 белков, так и в конце гена rpsL).

Используя программу Alibee

(http://www.genebee.msu.su/serv ices/malign_reduced.html), построено выравнивания полученных участков (межцистронный фрагмент + часть rpsL)

3. Систематизация, сортировка и аннотация найденных межцистронных фрагментов.

С помощью программы GeneDoc были построены выравнивания межцистронных областей семейств бактерий в сравнении с межцистронным фрагментом E . coli .

4. Построение филогенетического дерева эубактерий.

Исходя из полученных выравниваний белков S7 и межцистронных областей бактерий построены филогенетические деревья эубактерий. Для выполнения данной задачи была использована программа, расположенная на сайте http://www.genebee.msu.su/services/phtree_reduced.html

Результаты и обсуждение

В системе SRS (http://srs.ebi.ac.uk) найдены все известные геномы эубактерий. Найденные последовательности были систематизированы и унифицированы по ориентации.

При помощи программы Alibee (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html) было построено общее выравнивание всех найденных последовательностей генов белка S7, а также участков между генами S12 и S7. При помощи этой же программы было построено филогенетическое дерево бактерий (Рис. 2, 3).

При помощи программы GeneDoc были проанализированы полученные выравнивания нуклеотидных последовательностей участков S12 - S7 белков бактерий, относящихся к одной филогенетической группе и последовательность такого же участка генома E. coli. Выравнивание позволяет найти у изучаемых последовательностей участки, гомологичные фрагменту стрептомицинового оперона E. coli.


Рис. 2. Филогенетическое дерево эубактерий, построенное по белку S7

Рис. 3. Филогенетическое дерево эубактерий, построенное по межцистронному фрагменту S12-S7.

В филогенетическом дереве, построенном по белку S7, бактерии располагаются в соответствии с их родственными связями. По построенному же по межцистронным участкам видно, что бактерии можно зразделились на 2 группы:

1) Представители, имеющие соответствующие участки, близкие к E . с oli .

2) Бактерии, проявляющие значительную вариабельность данных межцистронных участков.

Найденные и использованные в работе геномы бактерии

MLB1790G-

Mycobacterium leprae

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.

MLEPRTN7-

Mycobacterium leprae

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.

MTV040-

Mycobacterium tuberculosis H37Rv

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium;

Mycobacterium tuberculosis complex; Mycobacterium tuberculosis.

MSRPSLG-

Mycobacterium smegmatis

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium.

SRU60191-

Streptomyces roseosporus

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales;

Streptomycineae; Streptomycetaceae; Streptomyces.

AE014733-

Bifidobacterium longum NCC2705

Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales;

Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium; Bifidobacterium longum.

AE009147-

Agrobacterium tumefaciens str. C58 (U. Washington)

Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae;

Rhizobium; Agrobacterium tumefaciens; Agrobacterium tumefaciens str. C58.

AY099291-

Rhodobacter capsulatus

Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales;

Rhodobacteraceae; Rhodobacter.

AE014017-

Buchnera aphidicola str. Bp (Baizongia pistaciae)

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Buchnera; Buchnera aphidicola;

Buchnera aphidicola (Baizongia pistaciae).

AP001119-

Buchnera aphidicola str. APS (Acyrthosiphon pisum)

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Buchnera; Buchnera aphidicola;

Buchnera aphidicola (Acyrthosiphon pisum).

AE014125-

Buchnera aphidicola str. Sg (Schizaphis graminum)

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Buchnera; Buchnera aphidicola;

Buchnera aphidicola (Schizaphis graminum).

AE005558-

Escherichia coli O157:H7 EDL933

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Escherichia; Escherichia coli.

AE015345-

Shigella flexneri 2a str. 301

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Shigella; Shigella flexneri; Shigella flexneri 2a.

AE016767-

Escherichia coli CFT073

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Escherichia; Escherichia coli.

AE008858-

Salmonella typhimurium LT2

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Salmonella; Salmonella typhimurium.

AE016848-

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Salmonella; Salmonella enterica;

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi.

AL627281-

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Salmonella; Salmonella enterica.

ECAE410-

Escherichia coli K12

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Escherichia; Escherichia coli.

NMA1Z2491-

Neisseria meningitidis Z2491

Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae;

Neisseria; Neisseria meningitidis; Neisseria meningitidis serogroup A.

AE004842-

Pseudomonas aeruginosa PAO1

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales;

Pseudomonadaceae; Pseudomonas; Pseudomonas aeruginosa.

AE016858-

Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales;

Pseudomonadaceae; Pseudomonas; Pseudomonas syringae;

Pseudomonas syringae pv. tomato.

AE016775-

Pseudomonas putida KT2440

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales;

Pseudomonadaceae; Pseudomonas; Pseudomonas putida.

AE016852-

Tropheryma whipplei str. Twist

Bacteria; Actinobacteria; Tropheryma; Tropheryma whipplei.

BX251412-

Tropheryma whipplei TW08/27

Bacteria; Actinobacteria; Tropheryma; Tropheryma whipplei.

AP001507-

Bacillus halodurans

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.

BSD127-

Bacillus subtilis

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.

AE016947-

Enterococcus faecalis V583

Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Enterococcaceae; Enterococcus;

Enterococcus faecalis.

AP003130-

Staphylococcus aureus subsp. aureus N315

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Staphylococcus; Staphylococcus aureus;

Staphylococcus aureus subsp. aureus.

AP003359-

Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Staphylococcus; Staphylococcus aureus;

Staphylococcus aureus subsp. aureus.

AP004823-

Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Staphylococcus; Staphylococcus aureus;

Staphylococcus aureus subsp. aureus.

AE006493-

Streptococcus pyogenes M1 GAS

Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus;

Streptococcus pyogenes.

AE009973-

Streptococcus pyogenes MGAS8232

Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus;

Streptococcus pyogenes.

AE014140-

Streptococcus pyogenes MGAS315

Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus;

Streptococcus pyogenes.

AE014272-

Streptococcus agalactiae 2603V/R

Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus;

Streptococcus agalactiae; Streptococcus agalactiae serogroup V.

SAG766853-

Streptococcus agalactiae NEM316

Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus;

Streptococcus agalactiae; Streptococcus agalactiae serogroup III.

AE008406-

Streptococcus pneumoniae R6

Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus;

Streptococcus pneumoniae.

AP003194-

Clostridium perfringens str. 13

Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae;

Clostridium; Clostridium perfringens.

MPAE58-

Mycoplasma pneumoniae

Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; Mycoplasmataceae; Mycoplasma.

AE002340-

Chlamydia muridarum

Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae; Chlamydia.

AE016994-

Chlamydophila caviae GPIC

Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae; Chlamydophila;

Chlamydophila caviae.

AE008584-

Rickettsia conorii

Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales;

Rickettsiaceae; Rickettsieae; Rickettsia; spotted fever group.

RP02603-

Rickettsia prowazekii

Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales;

Rickettsiaceae; Rickettsieae; Rickettsia; typhus group.

BSUB0001-

Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; Bacillus subtilis;

Bacillus subtilis subsp. subtilis.

AB017508-

Bacillus halodurans

Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus.

Далее приведены выравнивания фрагментов с наибольшей степенью гомологии. В участках геномов остальных групп бактерий расхождение с E . с oli значительно больше.


Рис. 4 . Выравнивание межцистронных фрагментов S7-S12 из геномов, наиболее схожих с аналогичным участком генома E . coli . Фрагменты заканчиваются перед старт-кодоном белка S7.


Рис. 5. Выравнивание групп бактерий, наиболее схожих с E . coli по составу межцистронных фрагментов:

a) Enterobacteriaceae (в эту группу входит E . coli )

Фрагменты заканчиваются перед старт-кодоном белка S7.


Рис. 5. Выравнивание групп бактерий, наиболее схожих с E . coli по составу межцистронных фрагментов:

б) Salmonella

Фрагменты заканчиваются перед старт-кодоном белка S7.

По данным проведенного анализа можно предположить, что у бактерий семейства Enterobacteriaceae и Salmonella механизм аутогенной регуляции белком S7 собственного синтеза подобен E . coli , т.е. межцистронный фрагмент S12-S7 связывается с белком S7. Высокая степень гомологии соответствующих участков геномов бактерий группы Enterobacteriaceae связана только с генетической близостью данных представителей, и не доказывает, что механизм соответствующей регуляции других организмов идентичен E . с oli .

Например, почти полное отсутствие межцистронного участка у бактерий группы Bacillus свидетельствует о возможности другого механизма регуляции. Косвенное подтверждение этой возможности было получены биохимическими методами [1]

Выводы

1. Не смотря на высокую степень гомологии белков S7 эубактерий, межцистронные фрагменты S12-S7 str оперона демонстрируют значительную вариабельность.

2. Наиболее близкие к str оперону E . с oli участки имеются у членов семейства Enterobacteriaceae , к которым относится E. coli , и у Salmonella . Можно предположить, что механизм аутогенной регуляции белком S7 собственного синтеза у E . coli также присутствует и у бактерий семейства Salmonella .

3. Практически полное отсутствие межцистронной области S12-S7 в str оперонах бактерий группы Bacillus свидетельствует об отличном от E . coli механизме регуляции.

Список литературы

[1] Miyamoto, A., Usui, M., Yamasaki, N., Yamada, N., Kuwano, E., Tanaka, I. and Kimura, M. (1999) Eur J Biochem 266, 591-8.

[2] Saito, K., Mattheakis, L.C. and Nomura, M. (1994) J Mol Biol 235, 111-24.

[3] Saito, K. and Nomura, M. (1994) J Mol Biol 235, 125-39.

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  261  262  263   ..