Научно-методический центр пищевых инфекций методы частной бактериологии

МЕТОДЫ ЧАСТНОЙ БАКТЕРИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Составители:

Д.А. Васильев, А.А. Щербаков,

Л.В.Карпунина С.Н. Золотухин

УДК 619:616

Учебно-методическое пособие по методам частной бактериологии.

Предназначено для студентов факультета ветеринарной медицины специализации ветеринарный врач-бактериолог, врач-ветсанэксперт и студентов факультета биотехнологии специализации технолог.

Составители:

Дмитрий Аркадьевич Васильев, Анатолий Анисимович Щербаков, Лидия Владимировна Карпунина, Сергей Николаевич Золотухин.

Рецензент:

доктор ветеринарных наук, заведующий лабораторией микробиологии ВНИИЗЖ В.С. Русалеев.

Предлагаемое учебно-методическое пособие не может заменить практическую работу в лаборатории кафедры, и это не лабораторный практикум в его классическом понимании, но оно позволит студентам лучше подготовиться к экзаменам как по первому модулю, так и по всему курсу микробиологии. Данное учебно-методическое пособие подготовлено применительно к вузовскому курсу для студентов факультета ветеринарной медицины специализаций ветеринарный врач-бактериолог и ветсанэксперт и для студентов факультета биотехнологии специализации технолог.

Пособие написано заведующим кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ВСЭ Ульяновской ГСХА, д.б.н., профессором Васильевым Д.А., заведующим кафедрой микробиологии и ВСЭ Саратовского ГАУ, д.б.н., профессором Щербаковым А.А, профессором кафедры микробиологии и ВСЭ Саратовского ГАУ, д.б.н., Карпуниной Л.В, руководителем курса микробиологии Ульяновской ГСХА, доцентом, к.в.н., Золотухиным С.Н.

Составители будут признательны получить отзывы, исправления, дополнения по адресу: 432002, Ульяновск–71, а/я 2683, Д.А. Васильеву.

Предисловие

Методы частной бактериологии являются продолжением первой части, «Методы общей бактериологии», изданной кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА в 1998 году. В отличие от первой части, методология данной нацелена на идентификацию конкретного рода или вида микроорганизмов, играющих роль в инфекционной патологии человека и животных, передающихся людям с пищевыми продуктами. В предлагаемой второй части учебного пособия используются методики, приведенные в первой части, но без конкретного описания. Изучавший курс микробиологии уже должен освоить эти методики, и в дальнейшей своей работе по идентификации бактерий, опираясь на них, проводить работу теми методами, что приведены в данной части учебного пособия.

Методический материал, излагаемый в данном учебном пособии, не является каноническим, инструктивным, нормативно-техническим, что позволило составителям продемонстрировать разнообразие схем исследования и методологических приемов, опирающихся на физиологические и биохимические свойства тех или иных микроорганизмов. К тому же нормативно-технические инструкции зачастую не отражают современную тенденцию лавинообразного появления новых таксонов, расширения тестов бактериологического исследования, позволяющих проводить идентификацию микроорганизмов, что обусловлено расширяющимся спектром бактериальных культур, причисляемых к патогенным или условно-патогенным видам, или появлением новых патогенных биовариантов и штаммов.

«…Также наставлю тебя в причинах и знаках болезней...

Бури, предвестницы зим, не чаще бросаются с моря,

Чем нападают на скот болезни: и не одиночек

Губит коварный недруг, но стадо целое сразу, –

Скот и надежду его и все со старшими племя…

Смерти весь род предала животных домашних и диких,

И отравила пруды, и заразой луга напитала…

Целые толпы зараз предает она смерти и в самых

Стойлах груды валит, гниющих в гнусном распаде

Тел, пока их землей не засыплют и в яму не скроют.

Даже нельзя было кож применять и внутренних вымыть

Чистой водою частей, иль пламенем справится с ними.

Также нельзя было стричь изъеденной грязью и хворью

Шерсти, касаться нельзя никому испорченной волны.

Если же кто надевать пытался лихие одежды,

То пупыри у него горячие, с мерзостным потом

Вдруг возникали на членах зловонных, и через немного

Времени хворую плоть священным огнем разъедало…»

ВЕРГИЛИЙ «Сельские поэмы»

(перевод С.Шервинского)

«…отчего происходят болезни, откуда

Может внезапно прийти и повеять поветрием смертным

Мора нежданного мощь, и людей и стада поражая,

Я объясню. Существует немало семян всевозможных,

Из которых одни животворны,

Но и немало таких, что приводят к болезни и смерти,…»

ТИТ ЛУКРЕЦИЙ КАР «О природе вещей»

(перевод Ф. Петровского).

Введение

Заселившие Землю примерно 4 миллиарда лет назад микроорганизмы и в настоящее время являются самой многочисленной группой живых существ, составляя третье царство, которое по предложению Геккеля (1866) имеет собирательное название – протисты . В свою очередь, протисты подразделяются на высшие и низшие. Высшие протисты, клетки, которых сходны с животными и растительными клетками, являются эукариотами . К низшим протистам относятся бактерии (включая и риккетсии) и сине-зеленые водоросли, сильно отличающиеся по строению своих клеток от всех других организмов и имеющие общее название – прокариоты .

По своему химическому составу все живые существа нашей планеты во многом сходны. Их важнейшими компонентами являются ДНК, РНК, белок. Основная физическая единица живого так же универсальна – это клетка. Однако строение клеток прокариот (бактерий и сине-зеленых водорослей), с одной стороны, и клеток животных и растений (в том числе микроскопически малых) – эукариот, с другой стороны, позволяют говорить о весьма существенных различиях между двумя этими группами.

Прокариотов можно рассматривать как реликтовые формы, сохранившиеся с давних времен, а появление эукариотических форм рассматривают как гигантский скачок в эволюции организмов. Однако микроорганизмы, и, в частности, прокариоты, испытывая непрерывное влияние окружающей среды, пожалуй, как ни одна другая форма жизни, постоянно эволюционируют. Заполняя на планете все сколько-нибудь пригодные для жизни экологические ниши, они проходят отбор на выживание, изменяя свои свойства – фенотипические признаки. В свою очередь, измененные прокариоты (в том числе и патогенные для животных и людей) влияют на эволюционные изменения этих животных и человека, являясь одним из факторов естественного отбора. Создание и развитие научно-техно­ло­ги­ческой цивилизации позволяет человеку в какой-то степени влиять на данный фактор эволюционного процесса, сдерживая, а в некоторых случаях и ликвидируя те или иные причины естественного, биологического отбора. Инфекционная микробиология , изучающая микроорганизмы патогенные или условно-патогенные для человека и животных, и является тем инструментом, что позволяет сдерживать или ликвидировать некоторые причины биологического отбора. Одной из задач инфекционной микробиологии является установление наиболее оптимальных схем и методов идентификации бактерий, изучение их биологических свойств, разработка способов быстрого типирования инфекционного агента. Для искомой типизации можно использовать различные способы: серологические (РА, РСК, РНГА, РДП и т.п.), иммуноаналитические (ИФА, РИА, ФИА и т.п.), генетические (ДНК-ДНК гибридизация, ПЦР и др.), но в любом случае первоначальные исследования по выявлению инфекционного агента и его идентификации будут чисто бактериологическими. Опираться эти исследования должны на фенотипические признаки, характерные для того или иного рода, вида, биотипа бактерий. В предлагаемом учебном пособии приводятся наиболее характерные из доступных для исследований бактериологические тесты, а также фенотипические признаки патогенных и условно-патогенных бактерий. Для описания более детальных исследовательских тестов, направленных на изучение таксономического положения бактерий в систематике, их номенклатуры, существует специальная литература.

Бактерии рода Bacillus

Прямые палочки до 10 мкм, с закругленными или обрубленными концами, часто в парах или цепочках. Подвижные (кроме В. anthracis) за счет перитрихиальных жгутиков. Образуют эндоспоры, характеризующиеся повышенным коэффициентом светопреломления, устойчивостью к повреждающим агентам и высоким содержанием дипиколиновой кислоты (5-20% сухой массы). Клетка-спорангий образует одну эндоспору. Род включает 48 видов; некоторые виды — строгие аэробы, другие — факультативные анаэробы. Возможно изменение окрашивания по Граму, но на ранних стадиях роста бактерии грамположительны. Хемогетеротрофы, метаболизм строго дыхательный или дыхательный и бродильный одновременно (редко строго бродильный); большинство видов образуют каталазу. Род Bacillus содержит несколько патогенных для человека видов (табл. 1); типовой вид — Bacillus subtilis.

Таблица 1. Поражения, вызываемые различными видами рода Bacillus

* — один образец для выделения и один для микроскопии.

** — включают язвы роговицы, эндофтальмиты, кератиты, иридоциклиты, панофтальмиты и абсцессы глазницы.

*** — следует определить количественные соотношения с прочими бактериями.

Bacillus anthracis

Возбудитель сибирской язвы у человека и животных. Заболевание известно с глубокой древности, со времен Гиппократа и Гомера, Галена, Цельса и Вергилия болезнь фигурирует под названием «священный огонь» (ignis sacer) или «персидский огонь» (ignis persicus). Русские врачи Колывано-Воскресенских заводов на Алтае А. Эшке (1758) и Н. Ножевщиков (1762) представили в медицинскую коллегию подробные сведения о данном заболевании, включая клинику, эпидемиологию и связь с аналогичной болезнью у животных. В 1766 году Моран доложил о данной болезни в Академии наук в Париже, что является первой научной работой по сибирской язве за рубежом. В 1769 г. Фурнье выделил сибирскую язву в отдельную нозологическую единицу. С.С. Андриевский, изучавший заболевание во время эпидемии на Урале (1786-1788), дал ему название «сибирская язва», а в 1788 г. путем самозаражения доказал единство этиологии сибирской язвы у людей и животных. Возбудитель впервые описали Поллендер, Брауэлл (1849) и Давэн (1850). Чистую культуру возбудителя описал профессор Дерптского русского ветеринарного училища Ф. Брауэль (1857-1858). В своих опытах ему удалось заразить различных животных. Кох (1876) предложил питательные среды для размножения данных микроорганизмов, а в 1881г. Пастер предложил живую вакцину для иммунопрофилактики заболевания. В связи с монополизацией ее производства Пастеровским обществом, Л.С. Ценковский независимо создал отечественную живую вакцину. В 1902 г. Асколи разработал диагностическую реакцию преципитации, широко используемую на практике.

Распространение

Сибирская язва — типичный зооантропоноз; среди животных наиболее восприимчивы травоядные, но отмечены случаи заболевания среди зайцев, кошек и собак; у человека носит выраженный профессиональный характер (сельскохозяйственные рабочие, работники боен, шерстобиты и щеточники). Наиболее интенсивные очаги заболевания находятся в Азии (Турция, Иран, Китай, Монголия, Индия), Южной Африке, Южной Аме­рике (Аргентина) и Австралии; спорадические случаи регистрируют в Европе, России и США. Ежегодно сибирской язвой заболевает около 1 млн. животных и регистрируется около 40 тыс. случаев заболевания у людей.

Животные заражаются при заглатывании спор во время выпаса или при поедании загряз­ненных кормов. У животных преобладают ангинозная, карбункулезная, кишечная и септическая формы заболевания, т.е. возбудитель проникает через микротравмы ротовой полости или стенку кишечника. Больные животные выделяют сибиреязвенные палочки с мочой и испражнениями. Бо­лезнь быстро прогрессирует в течение 2-3 суток, а при молниеносных формах – в течение нескольких часов; летальность достигает 80%. Клинические признаки болезни (судороги, диарея с кровью) проявляются непосредственно перед гибелью животного.

Человек заражается при контакте с инфицированным материалом (уход за больными животными, переработка шерсти, шкур, щетины, кож и костей), либо при употреблении в пищу мяса больных животных. Пути заражения — ингаляция, заглатывание или проник­новение через порезы и ссадины кожи спор Bacillus anthracis. Различают профессиональ­ные (сельскохозяйственные, промышленные) и непрофессиональные (бытовые, случай­ные) группы заболевания. Ежегодно в мире регистрируют 25-100 тыс. случаев заражения.

Значительную эпидемическую опасность представляют скотомогильники, особенно если трупы животных, павших от сибирской язвы, были зарыты без надлежащих предо­сторожностей.

В сельских районах заболеваемость носит сезонный характер, пик заболеваемости прихо­дится на летние месяцы.

Морфология возбудителя

Крупная толстая палочка (5-10´1-2 мкм) с закругленными концами (при образовании цепочек — с обрезанными под прямым углом концами); неподвижна (абсолютный дифференциально-диагностический признак); легко окрашивается по Граму (грамположительна) и анилиновыми красителями. В клиническом материале располагается парами или в виде коротких цепочек, окруженных общей капсулой; на питательных средах образует более длинные цепочки; при этом морфология палочек несколько изменяется — они слегка утолщены на концах и образуют сочленения («бамбуковая трость»). Подобные морфологические изменения еще более явно проявляются при температурной фиксации для окрашивания по Граму. Обработка культур пенициллином приводит к разрушению клеточных стенок и образованию цепочек, состоящих из протопластов («жемчужное ожерелье»). Для защиты от факторов резистентности (фагоцитов, AT) образуют капсулы, наблюдаемые только у бактерий, обитающих в живых организмах либо на средах, содержащих нативную сыворотку (например, среда ГКИ). Капсулы более устойчивы к действию гнилостной микрофлоры, чем микробные тела, и в материале из разложившихся трупов нередко можно обнаружить лишь пустые капсулы («тени» микробов). Для более быстрого обнаружения капсул можно окрасить мазки полихромным метиленовым синим Леффлера (клетки синие, капсулы красно-малиновые). Образуют центрально расположенные эндоспоры, для чего необходимы кислород и определенная температура (12-42°С); в живом организме спор не образуют; также не образуют спор в невскрытых трупах, что обусловлено поглощением свободного кислорода в процессе гниения. Споры отличает высокая устойчивость к внешним воздействиям; в воде они сохраняются до 10 лет, в почве — до 30 лет (возможно и дольше).

Культуральные свойства

Рост. Bacillus anthracis хорошо растет на обычных питательных средах: бактерии можно даже выращивать на сыром или вареном картофеле, настое соломы, экстрактах злаков и бобовых. Температурный оптимум на агаре 35-36°С, на бульоне 32-33°С, оптимум рН 7,0. На жидких средах растет в виде ватных хлопьев, взвешенных комков, не вызывает помутнения среды. Дает характерный рост при посеве уколом в желатин («перевернутая елочка»); позднее верхний слой желатина разжижается, образуя воронку. На твердых средах образует крупные шероховатые серовато-белые колонии (R-формы) диаметром 2-3 мм, типичными считают характерные волокнистые колонии («голова Медузы» или «львиная грива»), образованные переплетающимися цепочками бактерий. Рост вирулентных штаммов на плотных средах и желатине настолько характерен, что может служить диагностическим признаком. На свернувшейся (30 минут при 80°С) лошадиной сыворотке растет в виде гладких прозрачных S-колоний, тянущихся за петлей.

Потребность в кислороде. Палочка сибирской язвы — аэроб или факультативный анаэроб; в анаэробных условиях (либо при значительном варьировании температурного режима) образует мелкие единичные колонии. При культивировании в микроаэрофильных условиях всегда образует гладкие (S), слизистые (М) или смешанные (SM) колонии.

Спорообразование. Споры Bacillus anthracis овальной формы, размером 0,8-1,0 ´ 1,5 мкм; сильно преломляют свет. Они очень легко образуются на бедных питательных средах, а при свободном доступе кислорода — даже в дистилляте или нефиксированных мазках (последнее следует иметь в виду при работе с вирулентными штаммами). На плотных средах спорообразование идет быстрее, чем на жидких; через 32-48 ч при 37°С оно бывает практически полным. Прекращается полностью при 15°С и 42-43°С. Скорость прорастания зависит от температуры (оптимум 37°С) и возраста спор; молодые споры в оптимальных условиях прорастают за 1-1,5 ч, старые – за 2-10 ч.

Биохимия. Возбудитель образует кислоту без газа на средах с глюкозой, фруктозой, маль­тозой и декстрином. Слабое или отсроченное образование газа наблюдают на средах с гли­церином и салицином (не у всех штаммов). Кислотообразования не находят на средах с арабинозой, рамнозой, маннозой, галактозой, раффинозой, лактозой, инсулином, маннитом, дульцитом, сорбитом и инозитом. Гидролизует крахмал; образует ацетилметилкарбинол и лецитиназу. Bacillus anthracis очень медленно и слабо коагулирует жидкую желточную сре­ду; нередко изоляты вообще лишены такой способности. Положительный результат можно ожидать не ранее 5-7 сут. инкубирования при 37°С; в то же время сапрофитные бациллы разлагают ее за 6-10 ч. В отличие от сапрофитов, палочки сибирской язвы лишены фосфатазы и не разлагают фосфаты, содержащиеся в питательной среде. Молоко свертывают за 3-5 сут.; затем сгусток медленно пептонизируется и разжижается; выделяется аммиак и (в связи с окислением тирозина) накапливается бурый пигмент.

Антигенная структура. Выделяют 3 группы основных антигенов (Аг) Bacillus anthracis, 2 из которых (капсульные Аг и токсин) кодируются плазмидами; отсутствие одной или обеих делает бак­терии авирулентными.

Капсульные Аг заметно отличаются по химической структуре от прочих капсулярных Аг бактерий; представлены полипептидами, соединенными с молекулами D-глутаминовой кислоты. По антигенным свойствам выделяют один серотип. AT к капсульным Аг не проявляют защитное действие.

Соматические Аг представлены полисахаридами клеточной стенки; состоят из D-галактозы и N-ацетилглюкозамина в эквимолярных соотношениях; перекрестно реагируют с AT к капсульному полисахариду пневмококков типа 14; введение Аг вызывает синтез AT, не проявляющих защитное действие.

Токсин обычно образуют in vivo (можно выделить из плевральных и перитонеальных экссудатов зараженных животных); in vitro образование токсина можно индуцировать культивированием на средах, содержащих сыворотку; пик образования приходится на18-20 ч инкубирования.

Токсин имеет сложную структуру: включает протективный Аг (взаимодействует мембранами клеток и опосредует проявление активности других компонентов); летальный фактор (проявляет цитотоксический эффект и вызывает отек легких) и отечный фактор (проявляет эффект кальмодулиннезависимой аденилатциклазы, повышает концентрацию цАМФ, вызывает развитие отеков); эти компоненты по отдельности не способны проявлять токсическое действие. Структуры компонентов токсина представлены белками или липопротеинами; их молекулы термолабильны, серологически дифференцируемы и иммуногенны.

Патогенность Bacillus anthracis прямо зависит от капсуло- и токсинообразования; штаммы, не проявляющие подобные свойства, обычно авирулентны.

Капсула защищает бактерии от действия вне- и внутриклеточных продуктов фагоцитов и препятствует поглощению бактерий; на начальных этапах заболевания капсула — важнейший фактор вирулентности. Способностью к капсулообразованию также обладают некоторые вакцинные штаммы (например, Пастера или второй вакцинный штамм Ценковского).

Токсин опосредует проявление признаков и симптомов сибирской язвы. Аккумуляция токсина в тканях и его воздействие на ЦНС приводят к летальному исходу на фоне легочной недостаточности и гипоксии. Разработаны сибиреязвенные анатоксины, но их структура и механизмы действия изучены не полностью.

Лабораторная диагностика в определенной степени зависит от клинической формы заболевания. Для исследования берут содержимое пустулы, гнойное отделяемое из карбун­кула, кровь, мочу, мокроту, испражнения и рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кусочки органов или целые органы. Все образцы следует помещать в герметичные сосуды и транспортировать закупоренными в опломбированные бок­сы. Анализы предусматривают не только проведение рутинных бактериологических исследований, но и заражение лабораторных животных для оконча­тельного уточнения диагноза.

Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме (рис. 1) с посевом на обычные питательные среды, определением подвижности, окраской по Граму и изучением биохими­ческих особенностей (дифференциально-диагностические признаки Bacillus anthracis и родственных спорообразующих анаэробов представлены в табл. 2 и 3).

Серологические исследования позволяют идентифицировать инфекцию у больных и реконвалесцентов; возбудитель можно выявлять AT, мечеными флюоресцеинами (осо­бенно в смешанных культурах), диффузией в геле, в РСК, РНГА и ИФА.

Кожные пробы (реакция ГЗТ) проводят внутрикожным введением 0,1 мл бактериально­го аллергена (антраксин); применяют для ретроспективной диагностики при эпидемио­логических исследованиях.

Реакция Асколи имеет большое значение, т.к. позволяет идентифицировать возбудитель при отрицательных результатах бактериологических исследований. Однако для прижиз­ненной диагностики она не имеет серьезных преимуществ перед вышеуказанными бакте­риологическими и серологическими методами.

Типирование бактериофагом. Возможно проведение дифференциальной диагности­ки с помощью бактериофагов.

Отличительная особенность возбудителя — высокая чувствительность к пеницил­лину; выращивание на средах, содержащих пенициллин, приводит к проявлению фено­мена «жемчужного ожерелья».

Биологическая проба. Заражение подопытных животных проводят одномоментно с посевом на питательные среды. Материал можно вводить белым мышам (по 0,1-0,2 мл в спину), кроликам и морским свинкам (по 0,2-0,5 мл в область живота). Обычно мыши погибают через 1-2 суток, морские свинки и кролики — через 2-4 суток. Наблюдение продолжают в течение 10 дней. У павших животных обычно исследуют печень, селезенку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца, места введения заразного материала. Делают посевы на питательные среды.

Профилактика

Иммунизация. Для профилактики зоонозов иммунизируют животных живой вакциной, приготовленной из некапсулированного штамма Bacillus anthracis, или протективным Аг.

Таблица 2. Морфология, особенности роста и патогенность В. anthracis и родственных спорообразующих анаэробов

ЭБ — эритроциты барана.

Таблица 3. Метаболические особенности В. anthracis и родственных спорообразующих анаэробов

К — ферментация с образованием кислоты.

Рисунок 1. Принципиальная схема бактериологического выделения

возбудителя си­бирской язвы

Bacillus cereus

Bacillus cereus (от лат. cera — воск, свеча) широко распространена в природе, морфологически сходна с Bacillus anthracis (характерно расположение микробных тел в виде штакетника), но обладает подвижностью, чувствительна к действию g-фага бацилл и гемолизирует эритроциты барана. Вызывает спорадические случаи пищевых отравлений у человека. Температурный оптимум роста 30°С, оптимум рН 7-9,5. На МПА образует «распластанные» колонии с неровными краями; на КА колонии «распластанные», зернистые, с широкой зоной гемолиза, на яичном агаре образует широкую зону преципитации белого цвета (эффект бактериальной лецитиназы), зона быстро растет, и через несколько суток инкубации охватывает всю поверхность чашки. Колонии, выросшие на агаре, имеют характерный восковидный вид. На жидких средах бацилла образует белый хлопьевидный осадок, нежную пленку на поверхности и вызывает помутнение бульона. Следует отметить высокую протеолитическую активность микроорганизма — разжижает желатин в течение 1-4 сут (80% штаммов); все штаммы образуют лецитиназу и ацетилметилкарбинол, расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов — также и сахарозу, глицерин, лактозу, галактозу, инулин, дульцит и декстрин.

Bacillus cereus вызывает два типа пищевых отравлений (гастроэнтеритов); интоксикацию опосредует энтеротоксин, образуемый вегетирующими формами, прорастающими из спор устойчивых к определенным термическим режимам обработки пищевых продуктов (обычно овощей). Бациллы образуют токсины только in vivo, во время прорастания спор.

Первый тип отличает укороченный инкубационный период (около 4-5 ч), характерны изнуряющие диарея и рвота. Заболевание развивается при употреблении пищи, обсемененной большим количеством микроорганизмов. Часты случаи отравлений в связи с употреблением жареного риса, содержащего проросшие споры Bacillus cereus, эти случаи не менее часто ошибочно связывают с отравлениями стафилококковым энтеротоксином. Подобные отравления можно считать токсикозами (или гнилостной инфекцией), связанными не столько с активностью токсина, сколько с действием метаболитов, накапливающихся в пищевых продуктах.

Второй тип отравлений характеризует более продолжительный инкубационный период (около 17 ч); патогенез полностью опосредован действием энтеротоксина, боль­ные жалуются на схваткообразные боли в животе, диарею; этот комплекс симптомов часто и ошибочно принимают за пищевые отравления, вызванные клостридиями.

Патогенез обоих типов отравления в большей или меньшей степени связан с действием энтеротоксина; механизмы его действия остаются до конца не изученными, но его актив­ность не связана со стимуляцией аденилатциклазы.

Предрасполагающие факторы — различные нарушения иммунитета.

Вторичные иммунодефициты, вызванные применением цитостатиков и иммунодепрессантов, а также различными патологическими состояниями, сопровождаемыми иммунодепрессиями (например, острыми лейкозами), могут быть причиной тяжелых, часто фатальных инфекций Bacillus cereus с массированными бактериемиями, эндокардитами и менингитами.

Применение b-лактамных антибиотиков для подавления роста Bacillus cereus мо­жет вызвать бурный рост резистентных штаммов.

Протезы. Вероятность развития непищевых инфекций также велика у лиц с протезиро­ванными органами, катетерами, а также у пациентов с гемодинамическими нарушениями.

Диагностика

Диагностическим признаком считают обнаружение в подозрительных про­дуктах более 10⁵ бактерий в 1 г/мл продукта либо 10² -10³ бактерий в 1 г/мл каловых и рвотных масс или промывных вод.

Прочие виды, имеющие значение

Включают Bacillus subtilis, В. megaterium, В. alvei, В. laterosporus, В. pumilus, В. thuringiensis и В. sphaericus. Два первых вида — широко распространенные сапрофиты, остальные виды — энтомопатогены. Они могут вызвать заболевания человека в составе микробных ассоциатов, особенно у лиц с иммунными расстройствами. Значительная часть героина, продаваемого уличными торговцами, обсемене­на Bacillus sublilis, отсюда тяжелые глазные инфекции и бактериемии у наркоманов. Также следует упомянуть В.stearothermophilus, патогенную для насекомых и применяемую в каче­стве средства биологического воздействия в первую очередь на гусениц чешуекрылых (Lepidiptera). Механизм энтомоцидного действия связан со способностью образовывать белковые кристаллические структуры (гранулы) при спорообразовании, они высвобождаются при про­растании споры и выделяют бактериальные токсины под действием пищеварительных фер­ментов желудочно-кишечного тракта гусеницы.

Питательные среды для культивирования бактерий рода Bacillus

Среда ГКИ (Шляхов, 1973). К раствору Хенкса добавляют 40% (объем/объем) стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56°С 30 мин. Раствор Хенкса можно заменить бульоном Хоттингера (рН 7,2—7,4). Среду используют для обнаруже­ния способности капсулообразования у В. anthracis.

Среда Томова (Шляхов, 1973). В состав среды входят 50 мл пептонного агара (10%-ный раствор агара, 2,5%-ный раствор пептона, 0,5%-ный раствор натрия хлорида), 100 мл сыворотки крови круп­ного рогатого скота, 50 мл куриного белка, 25 мл 0,4% гемина в 0,01 н растворе натрия гидроксида, 25 мл 0,01 н уксусной кислоты. В стерильной колбе смешивают сыворотку крови, белок, подогревают до 50°С и добавляют к расплавленному пептонному агару, имеющему температуру 50°С. Затем добавляют раствор гемина, уксусную кисло­ту, компоненты перемешивают и стерильно разливают в чашки Петри. На данной среде возбудитель сибирской язвы растет в S-или SM-форме. Среда обладает селективными свойствами: растут В.anthracis, В. cereus, не растут В. subtilis, В. megaterium, В. brevis, В. mycoides.

Среда Knisely (1966). К расплавленному питательному агару до­бавляют 40 мг/мл лизоцима, 30 ЕД/мл полимиксина, 300 мг/мл натри­евой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА), 40 мг/мл таллия ацетата. Растворы предварительно стерилизуют фильтрацией. Устанавливают рН 7,35. Через 24-48 ч инкубирования при 37°С В. an­thracis вырастает в виде мелких, гладких колоний. Другие виды бацилл на этой среде обычно не растут.

Лизоцимовая среда (Claus, Berkeley, 1986). Первоначально готовят раствор лизоцима, содержащий 10000 ЕД/мл в дистиллированной воде, и стерилизуют фильтрацией. 1 мл раствора лизоцима смешивают с 99 мл стерильного питательного бульона и разливают по 2,5 мл в пробирки. При изучении бацилл, патогенных для насекомых, 1 мл лизоцимового раствора (0,1%) смешивают с 99 мл полужидкого агара, который готовят следующим образом. В 1 л дистиллированной воды растворя­ют 10 г агара, 3 г Na₂ HPO₄ , по 5 г дрожжевого экстракта и триптона; фильтруют, устанавливают рН 7,3-7,5 и стерилизуют при 121°С 20 минут. Затем стерильно добавляют раствор глюкозы из расчета 2 г/л. Глюкозу предварительно стерилизуют в виде 10%-ного раствора при 115°С 20 минут. Используют для идентификации видов рода Bacillus.

Дифференциально-диагностическая среда. К 100 мл питательного агара, расплавленного и имеющего температуру 45—50°С, добавляют следующие растворы: 0,5 мл полимиксина М сульфата, 0,5 мл невиграмона, 1,0 мл гризеофульвина, 10 мл моющего средства «Про­гресс», 0,1 мл натрия фенолфталеинфосфата. Компоненты перемеши­вают, разливают в чашки Петри. Среда пригодна 1—2 суток при хранении в условиях холодильника. Через 18—24 ч культивирования посевов в крышку чашки Петри вносят 1-2 мл 25%-ного водного раствора аммиака. Чашку выдержи­вают (крышкой вниз) при 20°С 1 минуту и учитывают результат. Коло­нии бактерий с фосфатазной активностью розовеют, остальные колонии, в том числе В. anthracis, остаются бесцветными. Среда обладает селектив­ными свойствами.

Приготовление растворов . Полимиксина М сульфат растворяют в физиологическом растворе с расчетом 10000 ЕД/мл. Невиграмон растворяют в 25%-ном водном растворе аммиака, затем разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентра­ции 100 мкг/мл. Моющее средство «Прогресс» разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 0,1%. Гризеофульвин расти­рают в ступке, растворяют в стерильной дистиллированной воде до кон­центрации 100 мкг/мл. Натрия фенолфталеинфосфат (коммерческий 10%-ный раствор) прогревают на водяной бане при 56°С 30 минут. Среду используют для выделения из загрязненного материала воз­будителя сибирской язвы.

Среда Буза (Шляхов, 1973). К 3%-ному голодному (без пепто­на) агару (рН 7,2-7,4) добавляют 15% дефибринированной крови барана. Используют для культивирования возбудителя сибирской язвы.

Селективный агар для выделения и идентификации В. cereus (Hoibrook, Anderson, 1980). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 10 г маннита, 2 г натрия хлорида, 0,1 г магния сульфата, 2,5 г Na₂ HPO₄ , 0,25 г КН₂ РО₄ , 0,12 г бромтимолового синего, 10 г натрия пирувата, 14 г агара. Стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 минут. К расплавленному и охлажденному до 50°С агару добавляют стерилизованный фильтрацией раствор полимиксина В на дистиллиро­ванной воде из расчета конечного содержания 100 ЕД в 1 мл среды. Ком­поненты перемешивают и среду разливают в чашки Петри. Типичные колонии В. cereus диаметром около 5 мм с характер­ным синеватым оттенком (расщепление маннита), окружены зоной преципитации желточной эмульсии аналогичного цвета. По этим призна­кам В. cereus можно отличить от других бацилл, кроме В. thuringiensis. Изменение желточного компонента в среде вызывают также S. aureus, S. marcescens, P. vulgans, но они имеют другую форму колоний и зону про­светления вокруг них.

Жидкая среда обогащения для выделения В. cereus (Claus, 1955). В 100 мл дистиллированной воды растворяют 10 г KNO₃ , 5 г пепто­на, 3 г мясного экстракта. Устанавливают рН 7,0, стерилизуют при 120°С 15 минут. Исследуемый материал предварительно прогревают при 80°С 10 минут. Через 24 ч инкубирования при 30°С одну бактери­ологическую петлю засевают на питательный агар с желточной эмуль­сией. Культивируют при 37°С для подавления роста В. mycoides.

Бактерии рода Clostridium

К роду Clostridium относятся подвижные палочки (реже неподвижные), величиной 1,5-20,0 мкм, с закругленными, иногда с заостренными концами, часто расположеные в парах или короткими цепочками. Образуют овальные или круглые эндоспоры, придающие клеткам веретенообразную форму (от гр. kloster — вере­тено). С возрастом могут изменять отношение к окрашиванию по Граму, но на ранних стадиях культивирования всегда грамположительны. Большинство видов хемоорганотрофы, но некоторые могут расти хемоавтотрофно или хемолитотрофно; одни виды проявляют сахаролитическую, другие — протеолитическую активность (возможно сочетание этих свойств либо их полное отсутствие). Наиболее характерные признаки — способность вызывать маслянокислое брожение и анаэробный распад углеводов с образованием масляной кислоты и газов (СО₂ водород, иногда метан). Восстанавливают сульфиты до сульфидов. Обычно каталазо­отрица­тельные. Большинство видов — строгие анаэробы; также имеются аэротолерантные виды или отдельные штаммы. Типовой вид — Clostridium butyricum; вызывает маслянокислое брожение углеводов, открытие этой палочки позволило Пастеру (1861) выделить анаэробные микроорганизмы. Термин «клостридии» ввел Трекюль (1863). Род включает виды, обитающие в почве, на дне пресных и соленых водоемов, в кишечнике человека и животных; некоторые виды патогенны, а некоторые нашли применение в промышленном производстве некоторых органических кислот и спиртов. Современная систематика выделяет 5 групп микроорганизмов, разделяемых по расположению спор, способности гидролизовать желатин и особым требованиям для роста. По экологическим свойствам выделяют 3 группы клостридий: возбудители бродильных процессов (с преоб­ладанием сахаролитических свойств); возбудители процессов гниения (с преобладанием протеолитических свойств); патогенные виды (могут быть протеолитическими и сахаролитическими) Последнюю группу составляют возбудители травматических клостридиозов (газовой гангрены, столбняка), возбудители энтеральных клостридиозов и непатогенные виды, вызывающие патологические процессы в ассоциациях с другими патогенными клостридиями. Клостридиозы, как правило, имеют экзогенное происхождение. Число видов в роде достигло 100, из них менее 20 выделяют при различных поражениях животных и человека; их основные идентифицирующие признаки представлены в табл. 4.

Clostridium perfringens — один из основных видов рода. Возбудитель злокачественного отека, инфекционной энтеротоксемии животных, анаэробной дизентерии молодняка сельскохозяйственных животных, пищевых токсикоинфекций человека. По способности образовывать 4 главных токсина (a-, b-, e- и i-) микроорганизмы разделяют на 6 сероваров — А, В, С, D, Е и F (представители последнего, по-видимому, принадлежат к типу С). Основной возбудитель заболеваний человека — Clostridium perfringes типа А (С. welchii); при некротических энтеритах иногда выделяют микроорганизмы типов С и F; возбудители типа D вызывают инфекционные энтеротоксемии. Clostridium perfringens типа А открыли американские патологи Уэлч и Нэталл (1892), в чистой культуре получили Вейон и Жубер (1893), давшие ему название perfringens.

Распространение

Микроорганизмы широко распространены в окружающей среде, их выделя­ют из воды, почвы и сточных вод, часто обитают в кишечнике людей и животных; Clostridium perfringes также способны вегетировать в почве, богатой гумусом. Наиболее часто в почве и испражнениях обнаруживают серотип А. Место постоянного обитания представителей серотипа С, ответственных за пищевые токсикоинфекции у человека, пока не установлено, возбудителей выделяют из мясных и рыбных консервов и органов людей, умерших от «некротического энтерита».

Таблица 4. Идентифицирующие признаки патогенных для человека видов рода Clostridium

Примечание. Споры: ОС — овальные; КС — круглые; С — субтерминальные; ТС — терминальные. Метаболиты: УК — уксусная кислота; МК (иМК) — масляная (изомасляная) кислота; ПК — пропионовая кислота; ВК (иВК) — валериановая (изовалериановая) кислота; иКК — изокапроновая кислота; МолК — молочная кислота. КА — кровяной агар

Морфология и культуральные свойства возбудителя

Вегетативные клетки — крупные, строго грамположительные, жгутиков не имеют, неподвижны (один из немногих неподвижных видов). Классические формы представлены короткими палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0 ´ 1-1,5 мкм). Морфология может варьировать (антибиотики, ионы металлов, радиоактивное облуче­ние), например, in vitro на углеводных безбелковых средах могут образовываться коккобациллярные формы, а на белковых безуглеводных средах — нити с заостренными концами длинной до 145 мкм. In vivo образуют капсулы (единственный капсулообразующий вид среди патогенных клостридий). В течение некоторого времени капсулы сохраняются и при культивировании на средах, содержащих нативный белок, наиболее выражены у вирулентных штаммов, резистентных к фагоцитарным реакциям. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, в старых культурах могут быть грамотрицательными.

Споры Clostridium perfringens крупные, овальные, расположены центрально (у С. perfringens типа А — также субтерминально), клетка-спорангий практически не деформируется. Тер­моустойчивость спор серотипов В и D относительно невысока (погибают при кипячении в течение 15-30 минут), споры типов А и С более устойчивы и выживают при кипячении и даже автоклавировании в течение 1-6 ч. Спорообразование обычно имеет место в почве и кишечнике, in vitro споры можно получить на щелочных средах, богатых белком и не содержащих утилизируемых углеводов (например, на свернувшейся лошадиной сыворотке). Спорообразование стимулирует прогревание при 75°С в течение 10-15 минут.

Тип А. Clostridium perfringens типа А — факультативный анаэроб (в сравнении с другими клостридиями) и относительно толерантен к кратковременным кислородным воздеиствиям, хотя имеются чувствительные штаммы, погибающие при воздействии О₂ на культуру в течение 3 минут. Способен расти в высоких столбиках сред без герметизации вазелином.

Морфология колоний

У Clostridium perfringens типа А значительно варьирует от условий выращивания. На плотных питательных средах обычно образуются S- и R-колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями, в начале роста прозрачные, напоминающие капли росы, позднее становятся мутными, серовато-белыми. R-колонии неправильной формы, бугристые, с неровными шероховатыми краями, в глубине агара напоминают комочки ваты. У некоторых штаммов отмечают слизистые М-колонии, особенно у слизистых вариантов С. perfringens типа А, образующих густую слизь на жидких средах, они напоминают S-колонии с более высоким куполом и слизистой консистенцией; представлены капсулированными клетками. Иногда можно наблюдать смешанные О-колонии.

На агаре Цейсслера через 12-18 ч образует гладкие сероватые колонии с ровными краями и плотным возвышением в центре. Колонии окружены зоной гемолиза, он может быть полным либо частичным. Зона гемолиза может быть двойной: вокруг колоний полный гемолиз (за счет действия гемолизинов), на отдалении — неполный (за счет действия лецитиназы). При контакте с кислородом колонии могут приобретать зеленоватую окраску.

На желточном агаре образует колонии, окруженные зоной перламутрового преципитата (фосфорилхолин), образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы.

Характерный признак колоний Clostridium perfringens типа А — способность менять серова­то-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в аэробных условиях (может служить дифференциально диагностическим признаком).

Колонии в толще питательной среды имеют вид чечевичных зерен, дисков или комочков ваты.

Рост на жидких и полужидких средах, особенно содержащих глюкозу, происходит очень бурно с образованием Н₂ и СО₂ , и обычно заканчивается через 8-12 ч; при стоянии среда постепенно светлеет и образуется обильный осадок, культуры Clostridium perfringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум рН 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5. Первые признаки роста на среде Китта-Тароцци могут проявляться уже через 1-2 ч (особенно при 43°С); последние проявляются появлением пузырьков газа из-под кусочков печени при встряхивании. Помутнение среды и активное газообразование можно наблюдать через 4-8 ч культивирования.

Антигенная структура

Выделяют 6 сероваров (A-F) Clostridium perfringens, различающихся по антигенным свойствам продуцируемых экзотоксинов. Все серовары образуют a-токсин (лецитиназу). Тип А включает много подтипов, идентифицируемых реакциями агглютинации, что облегчает диагностику в случаях пищевых токсикоинфекций и анаэробных раневых инфекций.

Метаболическая активность

Clostridium perfringens расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, раффинозу, маннозу, крахмал, гликоген и инозит; глицерин разлагают не все штаммы, не сбраживает маннит, дульцит; редко ферментирует салицин и инсулин. От прочих клостридий С. perfringens отличает способность восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу, образовывать лецитиназу. Протеолитическая активность слабая; разжижает желатин, не разлагает казеин; только некоторые штаммы медленно разжижают свернувшуюся сыворотку. Интенсивно створаживают молоко с образованием крупноячеистого губчатого сгустка уже через 3 ч (феномен известен как «штормовая реакция»)

Патогенность

Для человека патогенны Clostridium perfringens типов А, С и D; типы В,С, D и Е вызывают аналогичные заболевания у сельскохозяйственных животных (табл. 5).

Таблица 5. Заболевания, вызываемые С. perfringens

Токсины и клинические проявления

Токсины. Clostridium perfringens образует как минимум 12 идентифицированных токсинов (ферментов) и энтеротоксин; у гиалуронидазы и дезоксирибонуклеазы (m- и n- токсины) токсичность не доказана; b-, g-, h-, d-, e‑, q- и i-токсины обладают летальным свой­ством, но их биохимическая активность изучена недостаточно, и только a-, k- и l-токсины – ферменты с выраженным токсическим действием. Мишени для действия основных токсинов — биологические мембраны в различных тканях, в основе поражения находятся ферментативные процессы, катализирующие гидролитическое расщепление и нарушение клеточной проницаемости с последующим отеком. Последний сопровождается снижени­ем окислительно-восстановительного потенциала в клетках, активацией эндогенных протеаз, приводящих к аутолизу тканей, характерному для газовой гангрены.

a-Токсин (лецитиназа С) проявляет дерматонекротизирующее, гемолитическое и летальное (убивает лабораторных животных при внутривенном введении) действие, опосредованное лецитиназной (фосфолипазной) активностью (разлагает лецитин на фосфорилхолин и глицериды), продуцируют все типы Clostridium perfringens, но наиболее интенсивно тип А.

b-Токсин вызывает некроз тканей и оказывает летальное действие на морских свинок-альбиносов, гемолитического действия не оказывает, активность in vivo реализуется в развитии некротических энтеритов, основные продуценты — типы В и С.

d-Токсин проявляет гемолитическую активность в отношении эритроцитов барана, но не в отношении эритроцитов кролика или лошади, оказывает летальное действие на лабо­раторных животных, основные продуценты — типы В и С.

q-Токсин оказывает гемолитическое (кислород-чувствительное), дерматонекротизирующее и летальное действие, разрушает эритроциты барана и лошади, а также (незначительно) мыши, основной продуцент — Clostridium perfringens типа С, типы А, В, D и Е образуют его в меньших количествах.

e- и i-токсины оказывают летальное и дерматонекротизирующее действие, протоксины, выявляемые в фильтратах культур, активируются трипсином. e-токсин продуцируют типы В и D, i-токсин — штаммы типа Е.

k-токсин (коллагеназа и желатиназа) разрушает ретикулярную ткань мышц и коллагеновые волокна соединительной ткани, активно усиливает цистеин в присутствии Fe²⁺ , оказывает летальное и некротизирующее действие, продуценты — типы А, С, Е и некоторые штаммы типа D.

l-токсин (протеиназа) расщепляет денатурированный коллаген и желатин, во многом действует подобно фибринолизину, как и e-токсин, секретируется в форме протоксина, активируемого трипсином. Проявляет активность экзоэнзима, обусловливающего некротические свойства.

g-и h-токсины оказывают летальное действие на лабораторных животных; их биохимическая природа остается неизвестной.

m- и n-токсины по своей химической природе — гиалуронидаза и дезоксирибонуклеаза, m-токсин ответствен за повышение проницаемости тканей, n-токсин расщепляет нуклеиновые кислоты, тем самым нарушая реакции белкового синтеза. Фильтраты микробных культур Clostridium perfringens могут содержать также различные токсические вещества (например, фибринолизин и гиалуронидазу).

Энтеротоксин образуют Clostridium perfringens типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции, по своей природе он термолабильный протеин, продуцируемый при споруляции бактерий в толстой кишке, его практически не образуют лабораторные культуры, и он быстро разрушается при термической обработке пищевых продуктов, что значительно затрудняет его биохимическое изучение и идентификацию; вызывает рвоту и диарею, оказывает летальное действие, а также обусловливает появление эритематозной кожной сыпи у лабораторных животных. Диарея развивается вслед­ствие потери воды и электролитов за счет дилатации и повышения проницаемости капилляров.

Газовая гангрена развивается при попадании Clostridium perfringens на раневые поверхности, где бактерии активно размножаются в условиях пониженного содержания кислорода. Микроорганизмы, а чаще их споры, могут быть занесены в раны из внешней среды, а также с кожи или из ЖКТ пациента Для поражений характерны некроз тканей и образование газа с гнилостным запахом. Обильное образование газа характерно преиму­щественно для анаэробных раневых инфекций, вызванных данным микроорганизмом, из­вестным также как палочка газовой гангрены. Характерная особенность гистологи­ческих препаратов, полученных из очагов поражения — практически полное отсутствие фагоцитов в очаге некротических поражений.

Пищевые токсикоинфекции, вызванные серотипами А и С, приобретают все боль­шую значимость и представляют актуальную проблему для здравоохранения боль­шинства стран мира.

Clostridium perfringens типа А вызывает преимущественно токсикоинфекции легкой и средней тяжести, инкубационный период составляет 6-24 ч; заболевания развиваются остро, с ощущениями боли в животе, рвотой (иногда с кровью) и диареей (до 20 раз в сутки), общие нарушения проявляются слабостью, головокружениями, повышение тем­пературы наблюдают редко. Симптомы исчезают в последующие 12-24 ч. Летальные исходы наблюдают редко, обычно у ослабленных пациентов — пожилых лиц, хрони­ческих больных и детей с нарушениями питания. Следует помнить о способности микроорганизмов проникать в кровоток и вызывать тяжелый анаэробный сепсис.

Более тяжело протекает некротический энтерит, вызванный штаммами серотипа С. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента в течение 12-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серотипа А, и обусловле­ны действием b-токсина, подобные пациенты нередко попадают на операционный стол с диагнозом «кишечная непроходимость», смертность достигает 35%. Заболевание регистрируют достаточно редко; большое число случаев наблюдали в Германии после второй мировой войны (в 1945-1948 гг. — 1056 случаев), а в настоящее время пе­риодически отмечают в Новой Гвинее, что связано с особенностями национальной кухни.

Термоустойчивость спор. Даже внутри серотипа А она может меняться в зависи­мости от штамма.

При варке мяса некоторые споры погибают в течение нескольких минут, тогда как другие выдерживают кипячение в течение часа и дольше (особенности штамма). Споры, находящиеся в жировой ткани, выживают на протяжении длительного времени (до 6 часов).

Повышение температуры до 75°С стимулирует прорастание спор, температурный оптимум для роста в вареном мясе 43°С, в оптимальных условиях дочерние популя­ции образуются в течение 12-13 минут.

Лабораторная диагностика

В соответствии с методическими указаниями по лабораторной диагностике (1979) предусмотрено обнаружение и идентификация токсина в содержимом тонкого кишечника в реакции нейтрализации на белых мышах. Параллельно проводится выделение и идентификация возбудителя по тинкториальным, культуральным и токсигенным свойствам, изучение ферментативных свойств не предусмотрено. Используются лабораторные животные.

Выделение проводят по общепринятой схеме (рис. 2). При смешанных инфекциях можно прогреть исследуемый материал и выделить Clostridium perfringens из термоустойчивых спор, внесенных в питательную среду, с последующим развернутым анализом.

Идентификация микроорганизма осуществляется набором стандартных тестов — подвижность, серологические реакции и др.; Clostridium perfingens также можно идентифицировать по росту на яичном агаре: колонии С. perfringens окружены опалесцирующим белым «преципитатом», появляющимся под действием a-токсина (лецитиназы С); образо­вание зон преципитации можно ингибировать, наслоив на половину чашки специфическую антисыворотку одновременно с посевом тест-культуры.

Рисунок 2. Схема бактериологического исследования на Clostridium perfringens

Столбнячная палочка

Clostridium tetani вызывает столбняк — тяжелое заболевание, опосредованное нейротоксическим действием бактериального экзотоксина (тетаноспазмина), ведущее проявление — судорожный синдром, включающий болезненные сокращения мышц (тетанус) и длительное напряжение мышц (мышечная ригидность). Характерными проявлениями последнего считаются опистотонус (тетанический спазм, при котором позвоночник и конечности согнуты, больной лежит на спине и опирается на затылок и пятки) и risus sardonicus (risus caninus) — подобие оскала, вызванного спазмом мышц головы. Возбудитель столбняка практически одновременно открыли Монастырский (1883) и Николайер (1884), в чистой культуре впервые выделен Китазато (1889).

Распространение

Микроорганизмы встречаются повсеместно, но точных статистических данных об их распространении нет, так как во многих странах болезнь не подлежит обязательной регистрации. Тем не менее, ежегодная смертность от столбняка превышает 100 000 человек.

Естественный резервуар и источник инфекции — почва, хотя многие исследователи бопее склонны считать резервуаром инфекции толстую кишку сельскохозяйственных и диких животных. Входные ворота инфекции — бытовые и производственные травмы, причем наибо­лее часто поверхностные, когда больной не обращается за медицинской помощью.

Повышенную заболеваемость отмечают в регионах с теплым климатом, создающим усло­вия не только для длительного сохранения спор в почве, но и для их прорастания и размножения вегетативных форм.

Заболеваемость значительно возрастает во время военных действий у раненых; основ­ная группа риска в мирное время — работники сельского хозяйства (составляют 80-86% заболевших).

Морфология возбудителя

Вегетативные клетки. Бактерии представляют собой грамположительные палоч­ки с закругленными концами длиной 4-8 мкм и толщиной 0,3-0,8 мкм (в молодых куль­турах иногда образуют нитевидные клетки), располагаются одиночно или цепочками, подвижны (содержат 20 и более жгутиков, расположенных по периферии клетки), но в старых культурах (30 сут. и более) преобладают неподвижные формы. Облигатные (строгие) анаэробы, отличаются высокой чувствительностью к О₂ ; у бактерий отсут­ствуют цитохромы, цитохромоксидаза, пероксидаза и каталаза.

Споры круглые, реже овальные, расположены терминально, их диаметр в 2-3 раза превышает толщину бактерий, вследствие чего спорангий имеет форму теннисной ракет­ки или барабанной палочки. Их отличает высокая устойчивость к химическим и физичес­ким воздействиям, в частности, они выживают в течение 8-10 ч в 1% растворе сулемы и 5% растворе фенола, а также выдерживают кипячение в течение 0,5-1 ч. Спорообразование начинается на 2-3 сутки; на 4-6 сутки роста на жидкой среде вегетативные клетки разру­шаются, и в среде остаются почти одни споры.

Морфология колоний. На МПА и желатине в строго анаэробных условиях возбуди­тель растет медленно и образует тонкие прозрачные колонии с ровными или шероховаты­ми краями, рост колоний характерный — сначала на поверхности среды появляется се­точка, образованная сливающимися колониями с отростками. Растет в виде прозрачных или серовато-желтых шероховатых (R) и гладких (S) колоний. При посеве стол­биком в полужидкий агар через 24-48 ч формирует колонии в виде чечевичек (R-форма) или пушинок с плотным коричневым центром (S-форма).

Антигенная структура

У Clostridium tetani выявляют О- и Н-Аг. По жгутиковым Аг выделяют 10 сероваров, все серовары продуцируют идентичные по своим антигенным свойствам тетаноспазмин и тетанолизин.

Биохимия

Основные продукты метаболизма — уксусная, масляная, пропионовая кислоты, этанол. Большинство штаммов не обладает сахаролитической активностью, но выделено несколько штаммов, ферментирующих глюкозу. Clostridium tetani проявляет слабые протеолитические свойства; медленно расщепляет белки и пептоны до аминокислот (последние разлагаются до угольной кислоты, водорода, аммиака, летучих кислот и индола); для роста необходимы аргинин, гистидин, тирозин, валин, изолейцин, лейцин и триптофан. Бактерии образуют желатиназу и рениноподобный фермент, опосредующий появление затемненных зон вокруг колоний С. tetani на молочном агаре.

Патогенность

Патогенность Clostridium tetani обусловлена способностью образовывать тетаноспазмин и тетанолизин: действие этих токсинов на организм, в особенности тетаноспазмина, вызывает столбняк у человека и животных.

Тетаноспазмин — полипептид; M_r 150 000 Д; действует дистанционно, т.к. бактерии редко покидают пределы раны. Считают антигенно однородным, хотя обнаружено 4 груп­пы детерминант, но их структура и локализация плохо изучены. Токсин фиксируется на поверхности отростков нервных клеток, проникает в них (за счет лигандопосредованного эндоцитоза) и посредством ретроградного аксонного транспорта попадает в ЦНС. Меха­низм действия связан с подавлением высвобождения тормозных нейромедиаторов (в ча­стности, глицина и g-аминомасляной кислоты) в синапсах (токсин связывается с синаптическими белками синаптобревином и целльбревином).

Первоначально токсин действует на периферические нервы, вызывая местные тетанические сокращения мышц. Токсин появляется в культурах на 2 сутки, достигая пика образования к 5-7 дню. Разрушается при длительном хранении в термостате, под действием света и кислорода.

Для получения токсина in vitro бактерии можно выращивать на мясных средах, напри­мер бульоне Мартена с пептоном, среде Мюллера с настоем бычьего сердца и пепто­ном из триптического гидролизата казеина; в отечественной практике наибольшее распространение получила среда из кислотного гидролизата казеина, экстракта пше­ничных отрубей и дрожжевого экстракта (в среду можно добавлять рыбную муку).

Тетанолизин (тетаногемолизин) Clostridium tetani обладает гемолитическим, кардиотоксическим и летальным свойствами, в патогенезе заболевания играет менее важную роль; максимальноe накопление токсина в культуре наблюдают уже через 20-30 ч, процессы его образования не связаны с синтезом тетаноспазмина.

Клинические проявления

Легкая форма (локальный столбняк) характеризуется периодическими спазмами в пораженной области.

Мозговые поражения включают поражения черепных нервов (наиболее часто — VII); характерны тонические спазмы мышц головы и глотки.

Генерализованный столбняк — наиболее часто встречаемая форма с характерными мышечными спазмами; из других проявлений можно отметить тахикардию, аритмии, менингит, гипокальциемию.

Иммунитет

Естественный иммунитет к столбняку отсутствует. В отношении постинфекционного иммунитета существуют противоречивые данные: некоторые авторы считают, что он не формируется, тогда как другие выявляли антитоксин в сыворотках переболевших лиц в концентрациях 0,001-1,5 АЕ/мл.

Иммунопрофилактика. Со времен Беринга и Китазато известно, что введение в организм обезвреженного токсина создает выраженный иммунитет к столбняку. Позднее Рамон разработал метод его получения; его высокую эффективность подтвердили единичные случаи столбняка в войсках союзников во время второй мировой войны. Иммуногенные свойства анатоксина увеличивает его сорбция на гидроокиси алюминия. В настоящее время столбнячный анатоксин применяют для активной иммунопрофилактики столбняка, первичною вакцинацию проводят детям в возрасте с 5-6 месяцев до 5 лет (курс включает 3 инъекции с интервалом 30-40 суток); при заболевании применяют столбнячный анти­токсин – гипериммунную человеческою антисыворотку (курс — 2 инъекции, в тяжелых случаях — 3 инъекции дробно).

Лабораторная диагностика

Возбудитель обычно обнаруживают в месте проникновения в организм больного. Поэтому наиболее рационально исследование различного материала, взятого в месте ранения. В тех случаях, когда входные ворота неизвестны, следует тщатель­но осмотреть больного для выявления ссадин, царапин, катаральных и воспалительных процессов, необходимо обратить внимание на старые рубцы после ранения, т.к. возбудитель может долго в них сохраняться; в некоторых случаях исследуют слизь из носа, бронхов, глотки, налет с миндалин, а также выделения из влагалища и матки (при послеродовом столбняке или аборте). При бактериологическом исследовании трупов также принимают во внимание возможность генерализации инфекции. Для анализа забирают кровь (10 мл) и кусочки печени и селезенки (20-30 г).

Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме (рис. 3) Исследованию подлежит материал от больного или трупа, перевязочный и шовный хирургический материал, а также почва, пыль и воздух.

Рисунок 3. Схема бактериологической идентификации Clostridium tetani

Биологическая проба. При исследовании материала от больного или трупа параллельно бактериологическому анализу проводят обнаружение столбнячного анатоксина в биологической пробе на мышах. Для этого материал измельчают, добавляют двойной объем физиологического раствора, инкубируют в течение часа при комнатной температуре, фильтруют, часть фильтрата смешивают с противостолбнячной сывороткой из расчета 0,5 мл (200 АЕ/мл) сыворотки на 1 мл экстракта и инкубируют 40 минут. Затем одной группе животных вводят экстракт без предварительной инкубации с сывороткой, а дру­гой группе — проинкубированную смесь, при наличии Clostridium tetani у животных первой группы развиваются симптомы столбняка.

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum — возбудитель ботулизма, тяжелой, часто фатально заканчива­ющейся пищевой токсикоинфекции. В России первое клинико-эпидемиологическое описание ботулизма привел Зенгбуш (1818); возбудитель открыл ван Эрменген (1869).

Распространение

Clostridium botulinum широко распространены в почве. Заболевание реги­стрируют повсеместно, исключая районы вечной мерзлоты. Наиболее часто заболевания вызывают типы А и В, тип G первично выявлен в Аргентине, а тип Е более распространен в регионах, включающих большие естественные водоемы, — Северной Японии, области Вели­ких озер (США, Канада), Швеции, Дании, Британской Колумбии (Канада), РФ, где бактерии настолько обильно колонизируют придонный ил, что отмечаются случаи заражения рыб. Пе­риодическое пересыхание водоемов стимулирует рост Clostridium botulinum. Для профилак­тики интоксикаций продуктами промышленного производства при консервировании мяса широко применяют нитриты; в этом плане наибольшую опасность представляют мясные, рыбные и овощные консервы домашнего приготовления.

Естественный резервуар и источник инфекции — почва и различные животные.

Морфология возбудителя

Вегетативные клетки — палочки с закругленными концами размером 4-8´0,6-0,8 мкм, подвижны (перитрихи). При неблагоприятных условиях образуют эндоспоры, расположенные терминально и субтерминально. Строгие анаэробы; молодые культуры окрашива­ются грамположительно, 4-5-суточные — грамотрицательно. Оптимум рН для роста 7,3-7,6, для прорастания спор 6,0-7,2.

Морфология колоний. На кровяном ага­ре с глюкозой образуют очень мелкие серо­ватые или мутные желтоватые колонии линзообразной формы (на различных средах у одного и того же штамма могут варьировать). Вокруг колонии образуются зоны гемолиза различной ширины. На печеночном агаре образуют полиморфные звездчатые колонии, на желатине — сероватые, окруженные зоной разжиженного желатина. На столбике агара можно обнаружить диссоциаты, R-формы име­ют форму чечевичных зерен, S-формы — пушинок. Хорошо растут на жидких средах (обычно на бульоне Тароцци, бульонах из гидролизатов казеина, мяса или рыбы) при условии предварительного удаления О₂ из среды кипячением в течение 15-20 мин с быстрым охлаждением. Вызывают помутнение среды и газооб­разование, иногда имеется запах прогорк­лого масла, но этот признак непостоянен.

Антигенный состав

Серологическая иден­тификация Clostridium botulinum основана на выявлении токсинов, по их структуре бактерии разделяют на 8 сероваров — А, В С_{1( a )} , С_{2( b )} , D, Е, F и G. Антигенная структура бактерий остается малоизученной, показано наличие жгутиковых, группоспецифических (Н) и соматических, типоспецифических (О) Аг, не проявляющих токсических свойств. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна для бактерий типов А, В, С и D 35°С, для бактерий типов Е и F 28-30°С

Биохимические свойства

Все типы Clostridium botulinum образуют желатиназу, лецитиназу и Н₂ S, проявляют широкий спектр сахаролитической активности (бактерии типов А, В, Е и F ферментируют глюкозу, левулезу, фруктозу, мальтозу и сахарозу типов С и D — глюкозу и мальтозу, тип G инертен к углеводам). Clostridium botulinum типов А и В облада­ют выраженными протеолитическими свойствами, разлагают свернувшийся яичный белок и гидролизуют желатин По биохимическим свойствам выделяют 4 группы.

Бактерии I группы проявляют выраженные протеолитические свойства, гидролизуют желатин и эскулин, ферментируют глюкозу и мальтозу, проявляют липазную активность на яичном агаре.

Бактерии II группы проявляют сахаролитическую активность, но лишены протеолитической.

Бактерии III группы проявляют липазную активность и гидролизуют желатин.

Бактерии IV группы гидролизуют желатин, но, в отличие от прочих возбудителей ботулизма не проявляют сахаролитических свойств и липазной активности, что послужило основанием для предложения выделить их в отдельный вид —Clostridium argentiense.

Патогенность

Патогенность Clostridium botulinum различна для различных видов млекопитающих; забо­левания человека вызывают бактерии типов А, В, Е и F; Clostridium botulinum типов С и D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана.

Клинические проявления преимущественно обусловлены действием нейротоксина (т.к. в условиях организма размножение вегетативных форм Clostridium botulinum зат­руднено) и включают:

· классическую пищевую токсикоинфекцию, более распространен­ную под названием «ботулизм»;

· раневой ботулизм (возникает при загрязнении некротизированных тканей почвой);

· ботулизм новорожденных (у детей от 3 до 20 недель), характерны генерализованная гипотония и амиотрофия, развивается при заглатывании спор с последующим развитием вегетативных форм (в США ежегодно регистрируют око­ло 70 случаев);

· неопределенно классифицируемый ботулизм (у детей старше одного года и взрослых), не связанный с указанными факторами риска (пища, рана).

Фармакокинетическая активность токсинов различных типов Clostridium botulinum практически одинакова: все они сорбируются на клетках слизистой оболочки кишечника, проникают в кровь (где их можно выявить серологически) и в периферические нервные окончания. Фармакологическое действие включает связывание Н-цепи токсина с мембраной, поглощение токсина и формирование пор в синаптических пузырьках (каждую пору фор­мируют 4 молекулы токсина), что приводит к блокированию слияния синаптических пу­зырьков с мембраной; мишень для действия — интегральные синаптические белки. В частности, токсины серотипов В, D и F расщепляют синаптобревин, А и Е — SNAP-25, С — синтаксин, D и F — целлюбревин. Избирательно поражают a-моторные нейроны пере­дних рогов спинного мозга, что обусловливает характерные параличи мышц. Токсины термолабильны, но для полной инактивации требуется кипячение в течение 20 минут.

Клинические проявления. Временной интервал между попаданием токсина в орга­низм и появлением первых признаков ботулизма обычно не превышает 24 ч, но может варьировать от 4-6 до 96 ч и более. Проявления зависят от природы продукта, ставшего причиной отравления, количества токсина, поступившего в организм, и состояния боль­ного. Первые, но непостоянные признаки — расстройства ЖКТ (тошнота, рвота, боли в животе). Часто больные жалуются на сухость во рту или гиперсаливацию. Одновремен­но развиваются головная боль и нервно-паралитические явления — нарушение гло­тания, дисфагия и офтальмоплегический синдром; часто наступают односторонний или двусторонний блефароптоз и анизокория — результат поражения сфинктера зрачка. Циркуляция токсина в кровотоке приводит к уменьшению притока крови к правому пред­сердию. Кроме поражения ЦНС, ботулотоксин вызывает периферические поражения не­рвно-мышечной передачи, проявляющиеся сначала вялостью движений или полной ади­намией с последующим развитием парезов и/или параличей глазных, глоточных и гортанных мышц, а также мышц шеи и конечностей.

Довольно часто случаи детского ботулизма связаны с кормлением детей медом. Первый такой случай зарегистрирован в 1943г.; симптоматика раневого ботулизма аналогична таковой при пищевом отравлении и обусловлена действием токсина, выде­ляемого бактериями в ране.

Токсин Clostridium botulinum — белок, оказывающий нейротоксическое действие. В зависимости от типа возбудителя, идентифицируемого по антигенной структуре токсина, M_r может варьировать от 60 до 150 кД. Представлен Zn²⁺ -зависимыми эндопептидазами, при протеолизе разлагается на 2 связанных дисульфидной связью фрагмента (L- и Н-цепи). Механизм биологической активности реализуется через связывание Н-цепи с мембраной, проникновение токсина в клетку, формирование пор в пузырьках (каждую пору формиру­ют 4 молекулы токсина), что приводит к блокированию слияния синаптических пузырь­ков с мембраной. Токсин разрушается при кипячении, легко кристаллизуется в белый хлопьевидный порошок. Токсины всех типов также оказывают гемолизирующее действие.

Иммунитет

Чувствительность к ботулиническому токсину у различных животных (в том числе одного вида) подвержена резким колебаниям. Абсолютно резистентные виды неизве­стны, но всеядные животные обладают меньшей чувствительностью. Динамика заболевания не сопровождается выработкой значимых титров AT, что связано с незначительной (с точки зрения иммуногенных свойств) дозой токсина, вызвавшей поражение. Перенесенное заболевание не оставляет антитоксического иммунитета. У выздоровевших пациентов в сыворотке определяют AT к токсинам и микробным клеткам, что свидетельствует о комплексном харак­тере иммунного ответа, направленного как на связывание токсина, так и на элиминацию возбудителя. Следовательно, ботулизм можно рассматривать не только как интоксикацию, но и как токсикоинфекцию (конечно, не отрицая ведущей роли токсина в патогенезе заболевания).

Лабораторная диагностика

Выделение возбудителя проводят по общепринятой схеме (рис. 4). Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал, полученный от больного, секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5-10 мл и разводят 3-4% раствором цитрата натрия в соотношении 2:1, промывные воды из желудка забирают в объеме 50-100 мл, кал — 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде.

Кровь исследуют только на наличие токсина с помощью биологической пробы на мышах (вводят 2 мл) или морских свинках (вводят 5-8 мл). Испражнения исследуют только на наличие возбудителя посевом на питательные среды, весь остальной материал — на наличие токсина и возбудителя. Банки с консервами выдерживают в термостате 10-12 суток, стерильно отбирают 50-100 г, растирают и центрифугируют, в надосадочной жидкости определяют токсин, в осадке — возбудитель. Мясо и рыбу обрабатывают спиртом и забирают пробы из внутренних частей (пробы рыбы рекомендуют брать от хребта и внут­ренних органов). Пробы изучают аналогично исследованиям консервированных продуктов.

Рисунок 4. Принципиальная схема бактериологического выделения Clostridium botulinum

Clostridium novyi

Clostridium novyi (Clstridium oedematiens типа А) — как и Clostridium perfringes – основной возбудитель анаэробной раневой инфекции, также известной как газовая гангре­на, газовый или злокачественный отек, инфекционного некротического гепатита овец. Впервые раневая госпитальная гангрена была описа­на Паре в 1562 г, через 3 столетия Вельпо (1839) опубликовал свои наблюдения над подобным заболеванием, названным им «травматическая эмфизема». Полное описание клинической карти­ны и течения разлитых форм газовой инфекции, наблюдаемых им во время Севастопольской и Кавказской кампаний, дал Н.И. Пирогов. Позднее Веинберг и Сэган (1891) установи­ли, что открытая ими бацилла злокачественного отека (Clostridium oedematiens типа А) способна вызывать инфекции у человека; возбудитель позднее (1894) был охарактеризован Нови и получил его имя. В годы второй мировой войны инфекции, вызванные Clostridium novyi, составляли 42% случаев гангрены. Микроорганизм широко распространен в природе, может быть выделен из почвы, осадочных отложений, а также из органов ЖКТ здоровых животных.

Морфология и культуральные свойства

Вегетативные клетки. Крупные или слегка изогнутые подвижные грамположительные палочки размером 4-10´1-2мкм; перитрихи (20-25 жгутиков). Обладают выраженным полиморфизмом (некоторые штаммы образуют короткие цепочки или нити); при старении теряют способность окрашиваться по Грaму, но хорошо красятся анилиновыми красителями. В молодых культурах похожи на Clostridium perfringens, но отличаются подвижностью. Облигатный анаэроб (при пересевах колонии, выросшие на поверхности питательных сред, следует как можно меньше держать на воздухе). Молодые клетки хорошо окраши­ваются основными анилиновыми красителями, бактерии из старых культур могут изменять отношение к окраске по Граму.

Споры овальные, расположены центрально или субтерминально. На мясных и казеиновых средах спорообразование наблюдают на 2-6 сутки. Лучше всего споры образуются на средах, бедных утилизируемыми углеводами и другими питательными веществами. На обогащенных средах спорообразование менее обильное и более медленное. Устойчивы к нагреванию (выживают при кипячении в тече­ние 1-2 ч), в костях животных сохраняются до 10 лет.

Морфология колоний. На плотных средах в анаэростате уже через 48 ч образуют круглые сочные сероватые полупрозрачные колонии, иногда с зернистой поверхностью и неровными краями. Различают несколько типов бактерий. Бактерии типов А, В и С имеют тенденцию к образованию дочерних и подвижных колоний. На кровяном агаре возбудитель склонен образовывать шероховатые колонии, у бактерий типов А, В и С они окружены зоной гемолиза. Бактерии типа D эритроциты не разрушают. Колонии типов А и В, выросшие на кровяном агаре с бензидином, быстро чернеют на воздухе (за счет образования Н₂ О₂ ). В глубине агара образуются колонии, напоминающие линзы, комочки ваты, снежные хлопья и т. д., часто окрашены в желтоватый или коричневатый цвет. На жидких средах колонии растут сравнительно медленно и вызывают сдвиг рН в кислую сторону (за счет образования органических кислот и Н₂ S). На мясо-пептонных бульонах с 0,5% глюкозы или 3% декстрина при 37°С происходит равномерное помутнение среды, затем образуется рыхлый осадок.

Антигенная структура

Серологическая идентификация основана на выявлении соматических Аг; у штаммов типов А, В и D антигенная структура представлена 2 одинаковыми соматическими Аг, находящимися в различных соотношениях, антисыворотки к штаммам типа В могут иногда перекрестно реагировать с Аг других типов.

Биохимические свойства

Бактерии типов А, В и С ферментируют глюкозу, фруктозу и мальтозу, а тип D — только глюкозу, глицерин разлагают все микроорганизмы (кроме не­скольких штаммов типа В). Показано наличие у бактерий типа А глицерокиназы, α-амилазы и α-глюкозидазы, что указывает на способность разлагать полисахариды путем гидролиза и фосфорилирования. Протеолитические свойства у Clostridium novyi выражены сравнительно слабо, все штаммы разлагают желатин, свертывают молоко (медленно), но не разлагают свернувшийся яичный белок (исключая несколько штаммов), бактерии типа D образуют индол и H₂ S.

Патогенность

Clostridium novyi типов А и В вызывают газовую гангрену у человека и животных (наиболее частый возбудитель — тип А). Бактерии вырабатывают 8 токсинов, определяющих их патогенность (табл. 6). g-токсин (фосфолипаза) и b-токсин (некротическая, гемолитическая лецитиназа С) не тождественны одноименным токсинам Clostridium perfringens. a-токсин – термолабильный, некротизирующий токсин (его продуцируют культуры типа А и В), кроме того, Clostridium novyi образует гиалуронидазу, идентичную m-токсину С. perfringens. Культуры патогенны для многих лабораторных животных (мыши, морские свинки, кролики, крысы). У морских свинок на месте инъекции образуется желатинозный, студенистый отек. У 50% штаммов культуральная жидкость токсична для мышей.

Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика включает серологическую идентификацию Аг возбудителя и AT к ним в различных биологических жидкостях организма и выделение культуры возбудителя (аналогично бактериологическому исследованию на наличие Clostridium perfringens), что в случае Clostridium novyi представляет определенные трудности. Дифференциальную диагностику от прочих клостридий, вызывающих анаэробные инфекции, проводят оценкой сахаролитических, протеолитических и некоторых других биохимических свойств (табл. 7).

Таблица 6. Токсины, вырабатываемые различными типами Clostridium novyi

Таблица 7. Признаки некоторых патогенных клостридий

КГ — ферментация с образованием кислоты и газа.

Прочие возбудители анаэробной раневой инфекции

Помимо Clostridium perfrigens и Clostridium novyi, патологические процессы у человека и животных могут вызывать и другие клостридии. Исторически многообразие форм анаэробных поражений привело к тому, что к началу первой мировой войны имелось 71 наименование, обозначающее анаэробную инфекцию, за время вой­ны их дополнили 20 названиями, а к концу войны — еще 16. В 1861 г. Пастер описал «септичес­кий вибрион», а со времени выделения культуры совместно с Жубером (1977) Vibrion septique длительное время оставался единственным идентифицированным патогенным микробом, с дей­ствием которого связывали многие заболевания. Дальнейшая история открытия возбудителей анаэробных инфекций включает выделение сапрофитов С.pulrificus (Биншток, 1883) и Clostridium sporogenes (И. И. Мечников, 1908), а в 1915 г. Вейнберг и Сэгэн выделяют C.fallax, «бациллу злокачественного отека» Clostridium oedematiens (1915) и «тканерасплавляющую» бацил­лу Clostridium histolyticum (1917). Характерная особенность микроорганизмов — способность проявлять патогенное свойство в условиях смешанных раневых инфекций. Все они грамположительные анаэробы (но некоторые относительно толерантны к O₂ ), образуют споры, форма которых варьирует от круглой до цилиндрической. Принцип выделения возбудителей напомина­ет таковой при выделении культуры С. perfringens.

Clostridium histolyticum

Подвижная палочка (также встречаются неподвижные изоляты) раз­мером 3-5´0,5-0,8 мкм; грамположительна, но в старых культурах может быть грамотрицательной. В мазках часто образует пары или короткие цепочки, иногода единичные бактерии. Очень подвижна в молодых культурах, клетки из старых культур неподвижны (также известны изначально неподвижные штаммы). Почти на всех средах быстро образует субтерминальные споры («игольное ушко») с трехслойной оболоч­кой, не деформирующие клетку. Строгий анаэроб, растет при давлении 3-15 мм рт.ст. (оптимум 8 мм рт.ст.), но обладает аэротолерантностью, оставаясь жизнеспособной в аэроб­ных условиях в течение 10 ч. В аэробных условиях растет плохо и не образует спор и образует колонии меньшего размера. В анаэробных условиях на кровяном агаре образует прозрачные выпуклые колонии диаметром 0,5-1 мм, окруженные тонкой зоной гемолиза. При продолжительном отборе можно полу­чить штаммы, формирующие колонии в виде головы Медузы. В толще агара неподвижные штаммы образуют «пушинки» с уплотненным центром, подвижные — чечевицеобразные колонии или колонии с протуберанцем. Вызывают сплошное помутнение жидких сред с протеолизом кусочков мяса и печени на дне. Через 2 сут среда становится прозрачной, а на дне образуется осадок. рН почти не меняется; запах отсутствует. Инертны к углеводам (к ферментации без образования кислоты способны лишь некоторые штаммы); не образуют индол, но вырабатывают в больших количествах сероводород. Проявляют выраженные протеолитические свойства — разлагают желатин, свернувшуюся сыворотку, яичный белок и коллаген (табл. 7). Продуцируют 5 серологически идентифицируемых токсинов: a-токсин (основной токсин), оказывающий летальное и некротическое действие; b-токсин (коллагеназа), расщепляющий азоколл и желатин; g-токсин (протеиназа), активируемый восстановителями и не разрушающий нативный коллаген, но расщепляющий азоколл, желатин и казеин; d-токсин (эластаза), проявляющий аналогичную активность; e-токсин, проявляющий О₂ -зависимую гемолитическую активность (лабилен к кислороду, в антигенном отношении близок к стрептолизину О). У животных Clostridium histolyticum – один из возбудителей злокачественного отека (газовой гангрены), обычно в ассоциации с прочими анаэробами. Clostridium histolyticum патогенны для лабораторных животных. Морские свинки при внутримышечной иньекции свежей вирулентной культуры, выращеной на мясной среде, погибают в период от нескольких часов до нескольких дней. В зоне инъекции наблюдается расплавление мышц, газа не образуется, гнилостного распада нет.

В соответствии с действующей инструкцией при лабораторной диагностике злокачественного отека проводится микрокопическое исследование, подкожное заражение морских свинок изучаемым материалом в область брюшных мышц, изучение тинкториальных и культуральных свойств выделенной культуры.

Clostridium septicum (палочка Гона-Сакса)

Возбудитель злокачественного отека, брадзота овец. Обнаруживается в почве, кишечном тракте домашних животных, при соответствующей патологии животных и человека. Полиморфные подвижные палочки размером 4-5´0,8 мкм; в тканях способны образовывать нити длиной до 500 мкм. В культурах клетки могут быть яйцевидные, веретеновидные, образуют цепочки. При контакте с О₂ теряют подвижность, но не так быстро, как С. oedematiens. Через 24 ч культивирования образуют субтерминальные споры. Строгие анаэробы; растут при давлении 8-15 мм рт.ст. (выдержи­вают до 25 мм рт.ст.). Остаются жизнеспособными при доступе О₂ в течение 10 ч. На поверхности твердых сред образуют блестящие полупрозрачные колонии (диаметром до 4 мм) с неровными краями (имеют тенденцию к ползучему росту). На агаре Цейсслера через 48 ч палочки образуют сплошной нежный налет, окруженный зоной гемолиза. В столбике 1% агара формируют колонии с отходящими переплетающимися нитями, на 2% агаре колонии имеют вид дисков, иногда с протуберанцем. Ферментируют некоторые углеводы и не раз­лагают (практически все штаммы) сахарозу (что используют для дифференциальной ди­агностики с С.chavoei); протеолитическая активность выражена умеренно (см. табл. 7). На среде Китта-Тароцци дает обильный рост; газообразование вариабельное; через 2 суток образует осадок. Продуцируется 4 экзотоксина: a-токсин, основной фактор патогенности, проявляющий летальную, некротизирующую и гемолитическую активность; b-токсин, обладающий свойствами ДНКазы; g-токсин (гиалуронидаза); d-токсин, проявляющий свойства О₂ -лабильного гемолизина. При дифференциации от Clostridium chavoei используют следующие тесты: гемагглютинация эритроцитов барана, гемолиз эритроцитов курицы (Матвеев, Быченко 1973).

Clostridium chavoei

Возбудитель эмфизиматозного карбункула крупного рогатого скота и овец. Бактериальные клетки отличаются полиморфизмом, особенно в живой ткани, могут иметь форму лимона, груши, в мазках чистой культуры - прямые или слегка изогнутые палочки, одиночные, пары, реже короткие цепочки. По своим биологическим и антигенным свойствам мало отличается от Clostridium septicum, некоторые авторы рассматривают его как подвид С.septicum: С.septicum тип А и С. chavoei тип В. Однако каждый из этих микроорганизмов полностью нейтрализует только гомологичная сыворотка, а при дифференциальной диагностике этих микроорганизмов необходимо учитывать отсутствие полной перекрестной нейтрализации токсинов, слабую терморезистентность у С. septicum и высокую у С. chavoei, длительный инкубационный период при инфекции, вызванной первым микроорганизмом, и практически полное его отсутствие при заболеваниях, вызванных С. chavoei, способность С. septicum агглютинировать эритроциты барана и лизировать эритроциты кур. Молоко створаживает за 3-6 суток; казеин и свернув­шуюся сыворотку не разжижает; желатин не гидролизует. На кровяном агаре, среде Цейсслера образует характерные слабо выпуклые колонии в виде перламутровой пуговицы или с изрезанными краями – напоминающие виноградные листья, нежного фиолетового цвета; на средах с кровью дает a-гемолиз. На среде Китта-Тароцци характерен обильный рост, споры образует через 24 ч, колонии не имеют неприятного запаха, но старые культуры могут иметь запах прогорклого масла. Строгий анаэроб. Температурный оптимум 36-37°С. Слабо растет при 25°С и не растет при 45°С. В соответствии с методическими указаниями по диагностике эмкара, исследования включают изучение тинкториальных и культуральных свойств выделенного микроорганизма (без изучения биохимических свойств) и определение ее патогенности для морской свинки. Характерным изменением у морских свинок, зараженных подкожно в области брюшных мышц является наличие гемморагического выпота или точечных кровоизлияний на месте инъекции. Кожа от пораженных мышц отделяется с трудом, мышцы темно–красного цвета. В подкожной клетчатке обнаруживают небольшое количество пузырьков газа.

Clostridium sporogenes

Ассоциируется с возбудителем злокачественного отека. Выделяется из почвы, фекалий овец, собак и при патологических состояниях человека и животных. Подвижные палочки размером 3-6´0,5 мкм; проявляют выраженныные протеолитические свойства и биохимически инертны в отношении большинства углеводов (табл. 7). Температурный оптимум 30 – 40°С. Анаэроб. На кровяном агаре формирует колонии неправельной формы с ризоидными краями, серого цвета, выпуклые, обычно с зоной гемолиза. В агаре столбиком рост напоминает комочки ваты с плотным центром. При смешанных анаэробных инфекциях увеличивают вирулентность Clostridium perfringens и Clostridium septicum; при попадании жизнеспособных спор в мышцы способны вызывать гнойные процессы. Палочка не образует токсинов, участвующих в патогенезе анаэробной раневой инфекции.

Clostridium sordellii

Выделена Сорделли от больного газовой гангреной в Буэнос-Айресе; (1922). Один из возбудителей злокачественного отека. Обнаруживают в почве и при патологических состояниях человека и животных. Подвижная палочка размером 2-4´0,6-1 мкм; факультативный анаэроб; на плотных питательных средах уже через 24-48 ч образует выпуклые сероватые колонии с неровными краями. На агаре с эритроцитами лошади дает узкую зону гемолиза, а на шоколадном агаре образует узкую зону просветления (за счет протеолиза). На агаре с куриным желтком, молоком и лактозой формирует зону опалесценции вокруг колоний. На жидких мясных средах дает интенсивный рост, часто с образованием слизи. Ферментирует многие углеводы, но не лактозу и сахарозу, проявляет выраженные протеолитические свойства (табл. 7). Виру­лентные штаммы продуцируют высоколетальный некротизирующий токсин, напоминающий a-токсин Clostridium novyi; также образует лецитиназу С, серологически сходную с лецитиназой С. perfringens типа А, но проявляющую меньшую активность; продуцирует гемолизин типа q-токсина С. perfringens типа А и d-токсина Clostridium novyi и Clostridium septicum.

Clostridium fallax

Впервые выделена Прево из почвы тропических районов Африки. Один из возбудителей газовой гангрены. Под­вижная прямая палочка (в молодых культурах) с закругленными концами, 2-5´0,5 мкм; строгий анаэроб, температурный оптимум 37°С; на повер­хности агара через 24-48 ч образует мелкие плоские прозрачные колонии с неровными краями, по мере старения колонии становятся матовыми; в агаре с высоким столбиком образует чечевицеобразные колонии, на кровяном агаре дает узкую полоску гемолиза. Ферментирует углеводы; проявля­ет умеренную протеолитическую активность (табл. 7), свертывает молоко с образовани­ем кислоты. Не образует индола и не восстанавливает нитраты. По мнению ряда авто­ров, способна вырабатывать летальный токсин, серологически не идентифицированный до настоящего времени. Свежевыделенные штаммы вирулентны для морских свинок и мышей, вызывают серозно- фибринозный отек и некроз мышц. При пассаже вирулентность штаммов быстро теряется.

Clostridium bifermentans

По морфологии и биохимическим свойствам похожа на Clostridium sordellii, дифференциальная диагностика основана на серологической идентификации агглю­тининов спор; образует лецитиназу С. Иногда вызывает газовую гангрену у человека; вмес­те с Clostridium novyi, С.septicum, С.histolyticum и С.perfringens типа А (продуцирующими a-токсин) относится к так называемым гистотоксическим клостридиям. Неподвижная палочка размером 4-8´1-1,5 мкм, в молодом возрасте грамположительная; в мазках располагается цепочками. Быстро образует центральные или субтерминальные споры, не деформирующие клетку. На агаре Цейсслера обусловливает нежный рост, напоминающий рост С. oedematiens. На средах с кровью дает a-гемолиз; проявляет лецитиназную активность (лецитиназа С). Разжижает свернувшуюся сыворотку, гидролизует желатин, ферментирует глюкозу, левуле­зу и мальтозу. На среде Китта-Тароцци газ не образуется, через 24 ч культивирования появляется осадок. Рост сопровождается гнилостным запахом.

Clostridium difficile

Среди прочих патогенных клостридий следует упомянуть открытую Холлом и О'Тулом (1935) Clostridium difficile. Возбудитель вызывает псевдомембранозный энтероколит на фоне нерациональной терапии антибиотиками (клиндамицином, ампициллином и цефалоспоринами) и цитостатиками, вызывающими глубокий дисбаланс микрофлоры и колонизацию ки­шечника С.difficile. Бактерии продуцируют 2 вида экзотоксина — токсин А (энтеротоксин) с M_r 44 000-50 000 Д (оказывает диареегенное и летальное действие, стимулирует гуанилатциклазу) и токсин В (цитотоксин) с M_r 47 000 Д (оказывает летальное действие, значи­тельно превосходящее действие токсина А, нарушает функции мембран с потерей К⁺ и фибронектина, ингибирует синтез белка). Проявляет высокую резистентность к антибиотикам широкого спектра действия, что создает предпосылки для обширной колонизации кишечни­ка и секреции больших доз токсинов, вызывающих изменения кишечной стенки; чувстви­тельна к действию ванкомицина. Носительство С. difficile особенно распространено у ново­рожденных (до 50%), но именно у них наблюдают самый низкий уровень поражений. По мере развития нормальной микрофлоры (6-12 месяцев) число носителей уменьшается и среди взрослых лиц не превышает 3%. Следует помнить, что псевдомембранозный колит — сугу­бо госпитальная инфекция, доминирующая среди прочих госпитальных кишечных пораже­ний, превышая в 2-3 раза число инфекций, вызванных сальмонеллами. Среди новорожден­ных возможна контактная передача от ребенка ребенку или с руками персонала (при пеленании, кормлении и купании одними и теми же руками); среди взрослых доминируют контактно-бытовые пути госпитального распространения.

Антибиотиковый энтероколит характеризуется профузными водянистыми диареями; у 50% пациентов выявляют лейкоциты в кале и лейкоцитоз. Больные жалуются на коликообразные боли в животе, температура тела может достигать 39°С и выше.

Псевдомембранозный энтероколит характеризуется образованием и выделением с калом пленчатого материала — структур, представленных фибрином и слизью.

Питательные среды для культивирования клостридий

Среда Китта-Тароцци. Мясо или печень крупного рогатого ско­та нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным объемом МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4—7,6) и 30 минут кипятят. Затем среду фильтруют, печень (мясо) промывают водопроводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой. По 3—4 кусочка мяса (пече­ни) помещают в пробирку, наливают 7—8 мл бульона, покрывают сло­ем вазелинового масла и стерилизуют при 120°С 20 минут. Перед ис­пользованием среду регенерируют (кипятят с последующим охлажде­нием).

Кровяной агар с глюкозой. К 3%-ному МПА (рН 7,2—7,4), расп­лавленному и охлажденному до 50°С, добавляют до 1—2% стериль­ного раствора глюкозы, 15—20% свежей дефибринированной крови ба­рана или лошади. Разливают по чашкам Петри, подсушивают 20—30 минут в термостате. Культивирование проводят в анаэростате.

Полужидкий агар для строгих анаэробов (Тароцци). В бульон Мартена (рН 7,2-7,4) с 0,3-0,5% глюкозы добавляют 0,1% агара. Среду разливают по 9 мл в стерильные пробирки с кусочками варе­ного мяса, печени или фарша, стерилизуют при 120°С 30 минут. Сре­ду можно использовать, не заливая поверхность вазелиновым маслом.

Агар для трубок Виньял-Вейона. В бульоне Мартена (рН 7,4) раст­воряют 2% агара, 0,1% глюкозы. Среду разливают в узкие тонкостен­ные пробирки и стерилизуют дробно, текучим паром в течение 3 дней.

Бульон Вейнберга для анаэробов. 1 кг бычьего сердца пропуска­ют через мясорубку, добавляют к фаршу 1 л воды, нагревают до ки­пения, охлаждают, снимают жир. Смешивают 400 г печени, 400 г сви­ных желудков, 40 г соляной кислоты, 4 л воды, подогретой до 50°С, и выдерживают при этой температуре 18-24 ч. Затем подогревают до 100°С, жидкость сливают, фильтруют, добавляют 0,2% двуоснов­ного фосфорнокислого натрия и устанавливают рН 7,4. Смешивают 1 л мясной воды из сердца быка и 2 л полученного пептона, устанав­ливают рН 7,8—8,2 и стерилизуют при 120°С 30 минут. Бульон разли­вают по пробиркам с кусочками вареной печени, наливают стериль­ное вазелиновое масло слоем 0,5 см и вновь стерилизуют при 120° С 30 минут. Перед посевом к бульону добавляют стерильный раствор глю­козы до 0,5%.

Среда Виллиса и Хоббе. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 г лактозы, 1,3 мл 1%-ного раствора нейтрального крас­ного. Стерилизуют при 115°С 15 минут, охлаждают до 50°С и добавля­ют 15 мл стерильной желточной суспензии (смешивают поровну ку­риный желток и физиологический раствор) и 60 мл стерильного обез­жиренного молока.

Железо-сульфитный агар (Вильсон, Блер, 1924). К 100 мл 3%-ного МПА (рН 7,4) с 1% глюкозы при температуре 60°С добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернокислого натрия (Na₂ SO₃ ) и 1 мл 8%-ного раствора хлористого железа (FeCl₃ ), приготовленного на сте­рильной дистиллированной воде. Раствор Na₂ SO₃ предварительно сте­рилизуют 1 ч текучим паром. Затем среду, не стерилизуя, разливают по чашкам Петри. Сернистокислый натрий можно заменить серноватистокислым натрием (Na₂ S₂ O₃ ), а хлористое железо—сернокислым (FeSO₄ ). При восстановлении Na₂ SO₃ сульфат натрия соединяется с хлорным железом и образуется черный осадок сернистого железа (FeS). Этой способностью обладают анаэробы и некоторые аэробные бактерии, вследствие чего колонии таких микроорганизмов окраши­ваются в черный цвет. С. perfringens, обладающий большой скоростью роста, изменяет цвет среды через 1-2 ч культивирования. Другие анаэ­робы формируют зеленовато-черные колонии через 6-7 ч.

Железо-сульфитное молоко (Робинзон, Стоваль, 1937). К 100 мл обезжиренного молока добавляют 10 мл 20%-ного раствора сернистокислого натрия и 1 мл 8%-ного хлористого железа. Среду готовят непосредственно перед использованием и разливают по пробиркам. На данной среде С. perfringens можно обнаружить в смеси со стрепто­кокками, которые на других средах способны заметно тормозить его рост.

Бензидино-кровяной агар (Гордон, Мак Леод, 1940). К 3%-ному МПА (рН 6,4) с 1% глюкозы, подогретому до температуры 50°С, добавляют бензидин до концентрации 9% и 10% стерильной дефиб­ринированной крови барана. Компоненты перемешивают до приобре­тения средой шоколадного оттенка, разливают по чашкам Петри и подсушивают 4-5 ч в термостате. Засеянные чашки выдерживают в анаэробных условиях в термостате 12-24 ч, а затем переносят в аэроб­ные условия. Колонии С. novyi окрашиваются в черный цвет за 15-30 минут. Раствор бензидина готовят следующим образом: к 50 мл дистил­лированной воды добавляют 0,25 г основного бензидина, 0,3 мл 1% HCl и нагревают до растворения. Раствор пригоден для употребления в течение 2 недель.

Желточно-кровяной агар (Шапина-Вегина, 1962). К 2,5%-ному МПА добавляют 10% дефибринированной крови барана, 10% желточ­ной взвеси. Среда предназначена для выявления С. novyi. Через 16 ч выращивания колонии окружены непрозрачной зоной гемолиза с на­личием на поверхности среды вокруг колоний непрозрачной пленки с жемчужным блеском. Другие бактерии (аэробы, анаэробы), как правило, не дают одновременно перламутрового слоя и зоны редукции.

Полусинтетическая среда (Bonnel, Burgian, Raby, 1959). Исполь­зуют для культивирования и быстрой селекции анаэробных бактерий. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г пептона, 5 г дрож­жевого экстракта, 2,5 г натрия хлорида, 1,3 г агар-агара и подщелачи­вают Na₂ CO₃ . Смесь автоклавируют при 120° С в течение 15 минут, фильт­руют и добавляют 5,5 г глюкозы, 0,5 г гидросульфита натрия (пред­варительно растворенные в небольшом количестве воды), устанавли­вают рН 7,1. Добавляют 0,001 г резазурина и встряхивают смесь в те­чение нескольких минут. Среду разливают в пробирки по 15 мл, сте­рилизуют при 110°С 30 минут, охлаждают под холодной водой. При росте анаэробов среда окрашивается в нижней части пробирки, факуль­тативных анаэробов — весь столбик среды. Среду используют 3 недели при хранении в условиях комнатной тем­пературы.

Перфрингенс-агар (O.P.S.P.-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г триптона, 5 г дрож­жевого экстракта, 5 г соевого пептона, 7 г печеночного экстракта, 1 г железа аммонийно-цитратного, 1 г натрия метабисульфита, 1,5 г трис-буфера, 10 г агара, устанавливают рН 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121 С 15 минут, затем охлаждают до 50°С, вносят до­бавки (стерильно), обеспечивающие среде селективные свойства, и разливают по чашкам Петри. Добавка «А» содержит 100 мл натрия судьфадиазина, добавка «В» — 0,5 г олеандомицина фосфата и 10000 ЕД полимиксина В сульфата. Среда состоит из 100 мкг/мл натрия сульфадиазина, 0,5 мкг/мл олеандомицина фосфата и 10 ЕД полимиксина В сульфата. Данный состав обеспечивает селективные свойства, опти­мальные для изоляции С. perfringens.

Натрия метабисульфат и железо аммонийно-цитратное являются индикаторами редукции сульфита, что влияет на формирование ко­лоний возбудителя черного цвета диаметром 2-4 мм. Рост других сульфатредуцирующих бактерий (сальмонеллы, протей, цитробактер, ста­филококки, бациллы) ингибируется. На среде могут расти энтерокок­ки, но их колонии по внешнему виду отличаются от колоний С. perfringens.

Анаэробный агар Шадпера (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптического соевого бульона, 5 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г декст­розы, 0,4 г цистеина гидрохлорида, 0,01 г гемина, 0,75 г трис-буфера, 13,5 г агара. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 минут.

С селективными добавками среду используют для выделения клостридий, бактероидов, флавобактерий, лактобацилл, стрептококков (ана­эробных) из проб фекалий и кишечного тракта.

Для изоляции клостридий и бактероидов к 1000 мл основного анаэробного агара добавляют 10 г порошка плаценты и 0,002 г неомицина. С целью выделения флавобактерий в 1000 м³ вносят 7 мл 0,5%-ного тиротрицина в этаноле. Для анаэробных лактобацилл и стрепто­кокков в 1000 мл вносят 10 г натрия хлорида и 0,002 г неомицина. Посевы инкубируют при 37°С в анаэробных условиях.

Основной перфрингенс-агар (пропись фирмы «Дифко», 1982). Среда используется для изготовления TSC- или SFP-агара при предва­рительной идентификации и подсчете С. perfringens.

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют триптозы—15 г, соевого пептона — 5 г, мясного экстракта (сухого) — 5 г, дрожжево­го экстракта — 5 г, натрия метабисульфита — 1 г, железа аммонийно-цитратного — 1 г, агара — 14 г. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют при 121°С 10 минут. Затем среду охлаждают до 50°С и вносят соот­ветствующие селективные добавки.

Триптозо-сульфитный циклосериновый агар (TSC-агар). В основ­ной перфрингенс-агар вносят D-циклосерин из расчета 400 мг/л и 50 мл/л желточной эмульсии. Компоненты перемешивают и готовую среду разливают в чашки Петри.

Перфрингенс-агар Шахиди—Фергусона (SFP-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В основной перфрингенс-агар вносят следующие анти­биотики: 12 мг/л канамицин-сульфат, 30000 ЕД/л полимиксин В сульфа­та и 50 мл/л желточной эмульсии. Готовую среду разливают в чашки Пет­ри. На обеих указанных средах вокруг черных колоний С. perfringens образуется опалесцирующая зона, указывающая на лецитиназную ак­тивность микроорганизма.

Анаэробный бульон Шадлера (пропись фирмы «Дифко», 1982). По составу среда аналогична анаэробному агару Шадлера, но из нее исключен агар. Используют для выращивания патогенных анаэробов, для определения антибиотикоустойчивости анаэробов методом разве­дений с выражением результата в виде МИК.

Тиогликолевый бульон (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г L-цистина, 2,5 г натрия хлорида, 5,5 г декстрозы, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г пан­креатического перевара казеина, 0,5 г натрия тиогликолята. Устанав­ливают рН 7,1, разливают по емкостям и стерилизуют при 121°С 15 минут. Перед использованием среду кипятят и охлаждают.

Рекомендуется для контроля на контаминацию различных мате­риалов анаэробными бактериями.

Анаэробный агар Уилкинс-Чангрена (пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г трипто­на, 10 г желатинового пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г декст­розы, 5 г натрия хлорида, 1 г L-аргинина, 1 г натрия пирувата, 0,0005 г менадиона, 0,005 г гемина, 10 г агара. Устанавливают рН 7,1, стерили­зуют при 121°С 15 минут.

Среда рекомендуется для изоляции анаэробных микроорганиз­мов из клинических материалов, является стандартной для опреде­ления анткбиотикочувствительности анаэробных бактерий. При иск­лючении агара среда может быть использована как питательный бульон.

Обогащенный клостридиальный агар (RCM-агар, пропись фирмы «Дифко», 1982). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 3 г дрожжевого экстракта, 10 г мясного экстракта, 10 г пептона, 5 г декст­розы, 1 г растворимого крахмала, 5 г натрия хлорида, 3 г натрия аце­тата, 0,5 г цистеина гидрохлорида, 15 г агара. Устанавливают рН 6,8, стерилизуют при 121°С 15 минут.

Среда рекомендуется для исследования кишечной микрофлоры. Perry et al. (1955) использовали ее для изучения рубцовых стрепто­кокков, Bornes, Goldberg (1962), внеся в состав хлортетрациклина гидрохлорид или натрия азид, применяли среду для исследования фецес кур. С добавками крови она пригодна для обнаружения в фецес животных и людей лактобацилл, с добавками крови и неомицина — бактероидов.

Грамположительные, аэробные и факультативные кокки.

К данной группе отнесены достаточно различающиеся роды микроорганизмов, собранные для удобства в одну группу на основании двух общих признаков — сферическая форма тела и положительная окраска по Граму. Эти микроорганизмы не образуют спор, подавляющее большинство их не обладает подвижностью. Роды распадаются на подгруппы – аэробные, факультативно анаэробные и строго анаэробные. Другими удобными признаками для разделения родов служат расположение клеток и каталазная активность. Каталазоположительные кокки дифференцируют с помощью бензидиновой пробы, положительной у цитохромсодержащих микроорганизмов

Таблица 8. Отличительные признаки патогенных кокков

* – Подавляющее большинство видов

Микроорганизмы рода Staphylococcus

Микроорганизмы данного рода представлены примерно 30 видами, которые по фенотипическим признакам условно подразделяются на 4 группы. Cтафилококки — клетки сферические, повсеместно распространенные микроорганизмы, некоторые виды вызывают инфекционные заболевания у человека и животных.

Первых представителей рода выделил в 1880 Л. Пастер из гноя фурункула, в 1881 г. А. Огстон дал ему название Staphylococcus. В 1884 из очагов гнойных поражений человека Ф. Розенбах выделил виды S. albus, S. aureus. Данные микроорганизмы в основном ассоциированы с кожными покровами и слизистыми оболочками теплокровных. Но их выделяют и из пищевых продуктов и воды, что обусловливает пищевые токсикозы и токсикоинфекции.

Род образуют неподвижные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, располагающиеся в мазках одиночно, парами или гроздьями, что обусловлено способностью делиться во взаимно перпендикулярных плоскостях. Стафилококки неподвижны; факультативные анаэробы; хемоорганотрофы с окислительным и ферментативным метаболизмом, каталазоположительны; содержат цитохромы, но обычно оксидазоотрицательны, чувствительны к действию лизостафина, но не лизоцима (Schleifer, Kloos), это обусловлено лабильностью пентаглициновых мостиков, соединяющих мурамовую кислоту и тетрапептиды в пептидогликанах клеточной стенки.

Растут на средах содержащих до10% NaCI, температурный оптимум роста — 30-37°С; предпочтительна слабощелочная реакция среды. На плотных средах образуют мутные круглые ровные колонии кремового, желтого или оранжевого цвета. Цвет колоний обусловлен наличием липохромного пигмента, его образование происходит только в присутствии кислорода и наиболее выражено на средах, содержащих кровь, углеводы или молоко. Вызывают характерное разжижение желатина с образованием воронки, заполненной жидкостью (на 4-5 сут.) На жидких средах дают равномерное помутнение, а затем рыхлый осадок, превращающийся в тягучую массу. Восстанавливают нитраты, образуют Н₂ S, разлагают глюкозу, ксилозу, сахарозу, мальто­зу, глицерин, маннит с выделением кислоты; уреаза-положительны; крахмал не гидролизуют; индол не образуют. Видоспецифичными Аг являются тейхоевые кислоты; для S.aureus – рибиттейхоевые, для S.еpidermidis — глицеринтейхоевые; у S.saprophyticus выявляют оба типа кислот. Типовой вид — S. aureus. Стафилококки хорошо переносят высушивание, сохраняя вирулентность; погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10-12 ч. Довольно устойчивы к нагреванию — при 70-80°С погибают за 20-30 минут, при 150°С — за 10 минут; сухой жар убивает их за 2 ч. Менее устойчивы к действию дезинфектантов, но резистентны к воздействию чистого этанола. 14 из 27 известных видов обнаружены на коже и слизистых оболочках (S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis, S. haemolyticus, S. warneri, S. capitis, S. saccharolyticus, S. auricularis, S. simulans, S. cohni, S. xylosus, S. lugdunenis и S. schleiferi); большинство из них лучше растет в аэробных условиях (исключая S.saccharolyticus, предпочитающих анаэробные условия). По наличию коагулазы все стафилококки разделяют на две группы; среди патогенных видов коагулаза-положителен лишь S. aureus. остальные виды называют коагулаза-отрицательными. Основные поражения вызывают S. aureus, S. epidermidis и S. saprophyticus.

Staphylococcus aureus

Распространение. Золотистый стафилококк распространен повсеместно и часто входит в состав нормальной микрофлоры макроорганизма. Микроорганизм выделяют у 15-30% клинически здоровых взрослых людей. В большинстве случаев носительство ограничено несколькими неделями или месяцами; хроническое носительство типично для персонала медицинских учреждений; пациентов, страдающих атопическими дерматитами, а также регулярно использующих инъекции различных препаратов (наркоманы, больные сахарным диабетом, лица с повторными гемодиализами и др.). Подавляющее число инфекций носит эндогенный характер, механизм инфицирования обычно связан с переносом возбудителя из участков колонизации на травматизированную поверхность (например, кожные покровы); существенную роль играют также тесные контакты с носителями и лицами, страдающими стафилококковыми поражениями.

Патогенез поражений

Факторами патогенности являются микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты и токсические субстанции.

Микрокапсула защищает бактерии от комплемент-опосредованного поглощения полиморфноядерными фагоцитами, способствует адгезии микроорганизмов и их распространению по тканям. При выращивании in vitro обычно не образуется.

Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций: усиливают синтез ИЛ-1 макрофагами, активируют систему комплемента и являются мощными хемоаттрактантами для нейтрофилов. Тейхоевые кислоты запускают комплементарный каскад по альтернативному пути, активируют свертывающую и калликреин-кининовую системы, а также облегчают адгезию к эпителиальным поверхностям. Белок А (агглютиноген А) неспецифически связывает Fc-фрагменты молекул IgG (что активирует компоненты комплемента по классическому и альтернативному пути) и усиливает активность естественных киллеров. Активация комплемента приводит к проявлению различных местных и системных реакции, например анафилаксии, феномена Артюса, угнетению активности фагоцитов и т.д.

Ферменты проявляют разнонаправленное действие: каталаза защищает бактерии от действия О₂ -зависимых микробицидных механизмов фагоцитов; b-лактамаза разрушает молекулы b-лактамных антибиотиков; липазы облегчают адгезию и проникновение в ткани. Коагулаза, существующая в 3 антигенных формах, вызывает свертывание сыворотки; сам фермент не взаимодействует с фибриногеном, а образует тромбиноподобное вещество, предположительно взаимодействующее с протромбином.

Гемолизины. Выделяют 4 антигенных типа гемолизинов, вызывающих полный гемолиз кровяных сред; золотистые стафилококки способны одновременно синтезировать несколько подобных продуктов.

a-Гемолизин (a-токсин) наиболее часто выявляют у бактерий, выделенных из клини­ческих образцов; неактивен в отношении эритроцитов человека, но быстро лизирует эритроциты барана. При введении подопытным животным вызывает кожные некроти­ческие реакции и гибель животных после внутривенного введения.

b-Гемолизин (сфингомиелиназа) оказывает умеренное действие на эритроциты чело­века, выявляют у 20% изолятов. Проявляет выраженные свойства холодового гемолизина (максимальная активность проявляется при низких температурах).

g-Гемолизин — двухкомпонентный гемолизин с умеренной активностью в отноше­нии эритроцитов человека, поскольку один из компонентов инактивируют содержа­щие серу полимеры, присутствующие в агаре, то эффект этого гемолизина на кровя­ных средах обычно не проявляется.

d-Гемолизин — агрегат низкомолекулярных соединений, проявляющих детергентные свойства, последние обусловливают цитотоксичность широкого спектра.

Токсины. Наибольшее значение имеют: эксфолиатины А и В, обусловливающие раз­витие синдрома «ошпаренной кожи»; токсин синдрома токсического шока (TSST-1), ответственный за развитие специфического симптомокомплекса (предположительно за счет стимулирования выделения фактора некроза опухолей); d-токсин (лейкоцидин), ингибирующий всасывание воды и активирующий образование цАМФ (что имеет значе­ние при стафилококковых диареях), а также оказывающий цитотоксическое действие на полиморфноядерные лейкоциты, энтеротоксины A-F, ответственные за развитие пищевых интоксикаций (энтеротоксины В и С также приводят к развитию синдрома токсического шока).

Лабораторная диагностика

Включает выделение возбудителя из образцов.

Рост. Через 24 ч S.аureus образует гладкие выпуклые мутные колонии обычно желтоватого цвета около 4 мм в диаметре (бактерии вырабатывают желтый пигмент, и цвет колонии варьирует от белого до оранжевого); наиболее интенсивно пигмент образуется на агаре, дополненном 10% снятого молока. На кровяном агаре они окружены зоной полно­го гемолиза.

Рисунок 5. Принципиальная схема выделения стафилококков

Иногда, особенно на бедных средах, лишенных необходимых ростовых фак­торов (гемин, тиамин, пантотенат и др.), может формировать карликовые G-колонии (ме­нее 1% изолятов), лишенные зон гемолиза и часто растущие в виде сателлитных колоний вокруг других бактерий в смешанных культурах. Также следует помнить о способности стафилококков образовывать полиморфные L-формы, для возврата к исходным формам проводят посев на тиогликолевую среду Хорошо растут на бульоне, образуя сначала равномерное помутнение, а затем рыхлый хлопьевидный осадок. Дают весьма характер­ный рост на желатине: через 24-28 ч (наряду с обильным ростом по уколу) можно наблюдать начальное разжижение среды, а на 4-5 сутки образуется направленная вниз воронка, наполненная жидкостью.

Дифференцировка. Применяют коагулазный тест на наличие свертывающего фактора, положительный для 95% изолятов (желательно исследовать наличие свободного и связанного с клетками фермента), а также определяют способность ферментировать маннит; исследуют способность синтезировать термостабильную ДНКазу и агглютинировать частицы латекса или сенсибилизированные эритроциты барана. Последний тест позволяет выявлять белок А и свертывающий фак­тор, либо оба продукта. Следует помнить о возможных ложноположительных результатах при наличии S. epidermidis и микрококков, а также ложноотрицательных, обычных для метициллин (оксациллин) резистентных штаммов S. aureus (MRSA). В редких случаях инфекций, вызванных S. intermedius (обычно после укусов собак), также выделяют коагулаза-положительные стафилококки, отличающиеся от S. aureus способностью синтезировать пироглютамил-b-нафтиламидаминопептидазу

Серологические исследования (например, идентификация AT к тейхоевым кислотам) не имеют принципиального значения, а результаты часто носят противоречивый харак­тер. До настоящего времени реагенты для идентификации TSST-1 и AT к нему остаются недоступными.

Идентификация с помощью типовых бактериофагов. Метод типирования пато­генных стафилококков бактериофагами достаточно широко применяют в клинической эпидемиологии. Для фаготипирования используют стандартный набор из 20 бактериофа­гов, разделенных на 4 группы: 1-я группа включает фаги 29, 52, 52А, 79, 80, 2-я — 3А, 3С, 55, 71, 3-я — 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А, 84, 85, 4-я — 42D. С помощью соответству­ющих бактериофагов удается типировать 60-80% изолятов: установлены особые штаммы (например, фаготипов 80 и 77), наиболее часто выделяемые при вспышках.

При проведения лечения необходимо исследование чувствительности возбудителя к различном антибиотикам Значительная часть изолятов продуцирует b-лактамазу, либо ее синтез инду­цируют b-лактамные антибиотики; исследование проводят методом Кирби-Бауэра или се­рийных разведений. Важное значение имеет типирование штаммов бактериофагами (22 фага стандартного набора) либо изучение плазмидного профиля S. aureus, обеспечивающего устойчивость к антибиотикам.

Большие (2´10⁷ Д) плазмиды кодируют образование b-лактамаз и резистентность к эритромицину. Мелкие (3´10⁶ Д) плазмиды кодируют резистентность к тетрациклинам и хлорамфениколу (левомицетину)

В отличие от грамотрицательных бактерий, образование золотистым стафилококком b-лактамаз и хлорамфениколтрансфераз - индуцибельный процесс, т.е. они образуются только в присутствии антибиотиков.

S. epidermidis

Распространение. Наиболее часто колонизирует гладкую кожу и поверхность слизистых обо­лочек; микроорганизм характеризуется слабой вирулентностью, подавляющее большинство инфекций носит нозокомиальный характер, их чаще наблюдают у пациентов с пониженной резистентностью. Типичными для эпидермального стафилококка считают пораже­ния, обусловленные инфицированием различных устройств (протезов, катетеров, дренажей) либо гематогенным диссеминированием возбудителя после хирургических вмешательств. Важнейшими факторами вирулентности считают гидрофобные свойства поверхности, облегчающие адгезию к субстратам, и поверхностный полисахаридный слизистый слой, предохраняющий бактерию от действия микробицидных и цитотоксических защитных механизмов. Подобно поражениям, вызываемым S. aureus, важное патогенетическое значение имеют компоненты клеточной стенки S. epidermidis, стимулирующие развитие воспалительных реакций и оказывающие многостороннее действие на ткани. Диагностика поражений включает выделение возбудителя по стандартной схеме.

Микроорганизм не проявляет гемолитическую активность и на кровяном агаре образует беловатые гладкие выпуклые колонии. Основным методом дифференцировки от S. aureus считают определение коагулазной активности.

Выделенный коагулазоотрицательный стафилококк следует дифференцировать от микрокок­ков, чаще образующих желтые негемолизирующие колонии, и от прочих стафи­лококков, выделяемых из мочи (например, S. saprophyticus, S. cohni, S. lenthus, S. sciuri и S. xylosus) по нечувствительности к новобиоцину, к которому S. epidermidis чувствителен.

S. saprophyticus

Колонизирует кожные покровы гениталий и слизистую оболочку уретры; укреплению и росту на эпителии мочевыводящих путей способствуют олигосахаридные поверхностные рецепторы, а также способность к выделению ферментативного комплекса, подавляющего рост прочих бактерий. Выделение проводят по стандартной схеме, идентификацию — по чувствительности к новобиоцину, бацитрацину (чувствителен) и некоторым особенностям физиологии и метаболизма (табл. 9).

Питательные среды для культивирования стафилококков

Для выделения культур стафилококков обычно используют 5%-ный кровяной агар (кровь овцы, кролика, крупного рогатого скота). При исследовании образцов, содержащих постороннюю микрофлору, целесообразно использовать селективные среды.

Таблица 9. Дифференциальные признаки стафилококков, имеющих основное медицинское значение