содержание   ..  115  116  117   ..

Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири Важнейший этап патогенеза туберкулеза - персистенция возбудителя в фагосомах макрофагов [Авербах М.М. и др., 1982; Литвинов В.И. и др., 1983]. Макрофаги поглощают патоген в очагах воспаления, но часто теряют способность элиминировать его в лизосомах, что в итоге приводит к их массированному размножению и последующему выходу из погибших клеток [MyrvikQ. etal., 1984]. В связи с этим в число генов-кандидатов туберкулеза входят гены, продукты которых участвуют в процессе фагоцитоза микобактерий. Современные характеристики туберкулезной инфекции диктуют необходимость контроля прохождения микобактерии по эндосомально – лизосомальному пути. 1.2 Молекулярные механизмы патогенеза туберкулеза у человека Туберкулез – хроническое инфекционное заболевание, протекающее с внутриклеточным (в макрофагах) паразитированием микобактерий [MyrvikQ. N. etal., 1984]. Несмотря на самую современную химиотерапию, лечение туберкулеза, как правило, бывает длительным и не всегда эффективным. Одной из причин безуспешного лечения данной инфекции по общепринятому мнению является недостаточная эффективность защитных механизмов макроорганизма, в значительной мере генетически обусловленных. Сведения об участии иммунной системы, складывающихся межклеточных взаимодействиях, накопленные за последние десятилетия, изменили (уточнили) представления о патогенезе туберкулеза. Туберкулез чаще всего развивается в результате заражения МБТ, которые выделяет в окружающую среду больной человек. Респираторный тракт, а так же кишечник являются входными воротами инфекции. Таким образом, основной путь проникновения патогена – аэрогенный, но возможен и алиментарный. Определенную роль при аэрогенном заражении играет система мукоцилиарного клиренса, позволяющая вывести попавшие в бронхи частицы пыли, капельки слизи, слюны, мокроты, содержащие микроорганизмы. Аналогичным образом, при алиментарном пути проникновения микобактерий защитную роль играет переваривающая функция желудочно-кишечного тракта. После проникновения патогена в легкие важную роль в защите от инфекции играют альвеолярные макрофаги. Эти клетки непосредственно подавляют рост бактерий, фагоцитируя их, а также они участвуют в реакциях клеточного противотуберкулезного иммунитетах [Авербах М.М. и др., 1982; Литвинов В.И. и др., 1983; MyrvikQ. N. etal., 1984]. Процесс фагоцитоза можно разделить на несколько следующих друг за другом этапов. В первую очередь бактерия прикрепляется к фагоциту, затем следует фаза поглощения микроорганизма, и как следствие ингибиция роста или уничтожение инфекта. Процесс прикрепления микобактерий к фагоцитам осуществляется посредством рецепторов комплемента, маннозных рецепторов и других рецепторов клеточной поверхности макрофага. Взаимодействие между маннозными рецепторами и инфектом происходит при помощи гликопротеина клеточной стенки микобактерий, имеющего маннозный остаток на обращенной во внешнюю среду части молекулы [SchlesingerL. S., 1996]. Мутации генов, белковые продукты которых вовлечены в механизмы иммунологической защиты, определяют степень резистентности к инфекциям. Маннозо-связывающий белок (МВР) является Са-зависимым белком плазмы крови. Выявлено, что у человека этот белок осуществляет функцию активатора системы комплемента, кроме того, он действует непосредственно как опсонин, взаимодействуя с рецепторами макрофагов [HillA.V.S., 1998]. Исследовали взаимосвязь полиморфизма гена МВР с чувствительностью к легочному туберкулезу в Индии. Анализ показал, что с туберкулезом ассоциированы три точечных замены в исследуемом гене [SelvarajP. etal., 1999]. Аналогичное исследование, проведенное в Гамбии, выявило связь полиморфных вариантов данного гена с развитием легочной формы туберкулеза [BellamyR. etal., 2000]. Фагоцитирующая клетка выбрасывает окружающие микроорганизм псевдоподии, которые затем сливаются на периферии, образуя окруженную мембраной вакуоль [Ерохин В.В., 1974; LeakeE.S., MyrvikQ.N., 1971]. Микобактерии, находящиеся в фагосоме попадают под воздействие целого ряда неблагоприятных факторов, направленных на их уничтожение. К таким факторам можно отнести слияние фагосомы с лизосомами, содержащими литические ферменты [JeckettP. S. etal., 1978]. Так же макрофаг способен производить реактивные радикалы кислорода и азота, играющие, вероятно, основную роль в уничтожении инфекта внутри макрофага [NelsonN., 1999]. Установлено, что "нокаутированные" по гену индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2) мыши не способны противостоять туберкулезной инфекции, у них наблюдался усиленный рост M. tuberculosis в легких, селезенке и печени. Макрофаги этих мышей не производили NO и инфекция распространялась [JackettP. S. etal., 1978; WalkerL., LowrieD. B., 1981]. Если макроорганизм не в состоянии устранить внутриклеточно размножающихся микобактерий, то в результате хронического воспаления в месте освобождения антигенов происходит скопление большого числа макрофагов, которые выделяют фиброгенные факторы и стимулируют образование грануляционной ткани и фиброза. Возникшая гранулома представляет собой попытку организма ограничить распространение персистирующей инфекции. Однако при интенсивном размножении микобактерий в организме человека и малоэффективном фагоцитозе выделяется большое количество токсичных веществ и индуцируется гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), которая способствует выраженному экссудативному компоненту воспаления с развитием казеозного некроза. В процессе разжижения казеозных масс микобактерии получают возможность бурного внеклеточного размножения, что обусловливает прогрессирование туберкулеза [Ройт А., 1991, 2000]. Важнейший этап патогенеза туберкулеза - персистенция возбудителя в фагосомах макрофагов. Макрофаги поглощают патоген в очагах воспаления, но часто теряют способность элиминировать его в лизосомах, что в итоге приводит к их массированному внутриклеточному размножению и последующему выходу из погибших клеток. Получены данные, свидетельствующие о том, что имеются существенные различия в судьбе фагосом, содержащих вирулентные и авирулентные микобактерии, поскольку только первые препятствуют их слиянию с лизосомами [MyrvikQ. etal., 1984; FrenkelG. etal., 1986]. С точки зрения развития новых подходов к лечению туберкулеза очевидна необходимость контроля прохождения микобактерий по эндосомально-лизосомальному пути: от ранней эндосомы - к поздней, от поздней эндосомы – к лизосоме. 1.3 Физиологические функции белковых продуктов генов-кандидатов подверженности туберкулезу, их роль в патогенезе заболевания Белок входит в семейство функционально связанных мембранных белков (к этому семейству относят также Nramp2), ответственных за транспорт двухвалентных катионов, таких как Fe2+ Известно, что ионы металлов являются жизненно важными элементами, участвующими во многих метаболических реакциях, происходящих в каждой живой клетке. Следовательно, недостаток, избыток или отсутствие данных элементов может привести к развитию какого-либо патологического состояния или даже к гибели клетки. Постоянство ионов металлов в организме обеспечивается регуляцией их потребления, хранения и выведения. Для того чтобы поддерживалась необходимая концентрация ионов, каждая клетка обладает определенной системой, обеспечивающей транспорт веществ через мембрану. Сбой этой системы или ее части может повлечь за собой потерю равновесия между выведением и поступлением веществ, что приведет к изменению внутриклеточной концентрации ионов. Недостаточный транспорт ионов может оказаться причиной нехватки жизненно важных метаболических элементов, а чрезмерное их накопление может вызвать токсическое воздействие этих же веществ, ведущее к гибели клетки. Возможно, что антибактериальная функция Nramp1 заключается в создании неблагоприятной для бактерии окружающей среды внутри фагосомы [GruenheidS. etal., 2000; BartonC.H. etal, 1999]. Во время фагоцитоза микроба макрофаг продуцирует активные кислородные метаболиты, которые являются токсичными для бактерии. Выживание патогена во время кислородозависимой перестройки метаболизма фагоцита обеспечивается микробными ферментами, большинство из которых содержат ионы металлов в своих активных центрах [CellierM. etal., 1994]. В свою очередь истощение запаса ионов металлов в фагосоме, вызванное транспортной деятельностью макрофагального белка ассоциированного с естественной резистентностью, приводит к снижению продукции металлосодержещих ферментов поглощенной бактерией. Следовательно, дефекты продукции или функции Nramp1 могут приводить к нарушению его транспортной функции и, как следствие, к повышению чувствительности к внутриклеточным патогенам, таким как микобактерии (рис. 1) [BartonC.H. etal., 1999]. Опыты, проведенные на инбредных мышах, показали, что уровень естественной резистентности к внутривенному заражению низкими дозами M. bovis (BCG) контролируется одним геном, локализованным в проксимальном регионе мышиной хромосомы 1. Этот локус обозначили как Bcg (также он известен как Lsh или Ity). Два различных фенотипа Bcg были ассоциированны с чувствительностью (Bcg-s) и с резистентностью (Bcg-r) на ранней стадии инфекции, вызванной M. bovis, M. avium, M. lepraemurium, Leishmaniadonovani, Salmonellatyphimurium [BredleyD.J., 1977; ForgetA. etal., 1981]. Ген Хромосомная локализация Название белкового продукта Функция белка NRAMP1 2q35 (600266) Макрофагальный протеин 1, ассоциированный с естественной резистентностью Транспорт двухвалентных ионов металлов, киллинг внутриклеточно расположенных МБТ VDR 12q12-q14 Рецептор к витамину D Связывание с витамином D, активация клеточного иммунитета IL1А, IL1В 2q14(147760) Интерлейкин 1a Активация клеточного иммунного ответа IL12В 5q31.1-q33.1 Интерлейкин 12 b Индукция синтеза IFN-g IFNG 12q14 Интерферон g Активация Т-лимфоцитов, макрофагов TNFА 12р13.2 Фактор некроза опухолей a Индукция формирования гранулемы NOS2 17р13.1-q25 Индуцибельная синтаза оксида азота Цитотоксическое действие MBP 10q11.2-q21 Маннозо-связывающий белок Активация системы комплемента HLA 6p21.3 Главный комплекс гистосовместимости Регуляция силы иммунного ответа IL1RN 2q14.2 Антагонист рецептора к интерлейкину-1 Угнетение провоспалительного эффекта IL12R 19p113.1 Рецептор к интерлейкину 12 Связывание интерлейкина 12 на поверхности клеток-мишеней Интерлейкин 12 имеет 2 цепи, массой 35 kD (р35), кодируемая IL12А и массой 40 kD (р40), кодируемая IL12В. Тогда как IL12р40 главным образом взаимодействует с рецептором IL12b1 на поверхности Т-хелпера, IL12р35 в первую очередь сцепляется с IL12b2. Используя иммунопреципитацию, OppmannB. и соавторы (2000) определили, что IL12В и р19 формируют растворимый комплекс, который они назвали IL23. Анализ установил, что IL23, подобно IL12, связывается с рецептором IL12b1. Не так давно были выявлены цитокины IL18 и IL29 имеющие сходство в функции с IL12 и IL23. Ген NKSF2 (от англ. NaturalKillerCellStimulatoryFactor 2 – альтернативное название IL12) был картирован в дистальной области длинного плеча 5 хромосомы [WarringtonJ.A. etal., 1992]. В дальнейшем при помощи ПЦР анализа ДНК клеток гибридов был определен участок на хромосоме 5q31-33, где локализован IL12В [SieburthD. etal., 1992]. J. AWarrington. и UBengtsson. (1994) используя методы физического картирования, определили порядок расположения и относительное расстояние между 12 генами в 5q31-33 регионе. Ген IL12В был одним из них. Группа исследователей картировала ген IL12в на 11 хромосоме мыши [Noben-TrauthN. etal., 1996]. Используя модель животного, были получены экспериментальные данные о роли гена IL12В в защите от туберкулезной инфекции. Элиминация функции IL12в у "нокаутированных" мышей (IL12р40-/-) при условии их инфицирования вирулентным штаммом М. tuberculosis приводила к распространенной туберкулезной инфекции и гибели животного. Однако мыши с генотипом IL12р35-/- не проявляли повышенной чувствительности к туберкулезу. Данное наблюдение наводит на мысль о значительной роли субъединицы р40 интерлейкина-12 в развитии резистентности к туберкулезу [CooperA. M. etal., 2002]. Генетический дефицит IL12 или IL12R приводит к частичной или полной недостаточности выработки IFN-g. Как правило, вакцина BCG и непатогенные микобактерии не вызывают у человека заболевания, однако известны случаи, когда они приводили к развитию тяжелой распространенной инфекции. Так было описано несколько пациентов с генетическим дефектом выработки IL12р40 и IL12р70 (комплекс судъединиц р40 и р70), большинство из которых страдали от диссеминированной инфекции М. bovisBCG. Недавно был обнаружен мононуклеотидный полиморфизм гена IL12В в 3`-UTR, обусловленный заменой А на С [CervinoA.C.L. etal., 2000]. Эта информация дает возможность оценить роль изменчивости гена IL12В в формировании полигенной подверженности к туберкулезу. Если рассмотреть патогенез туберкулеза, возникает множество привлекательных кандидатов на роль "причинного" гена. Одним из таких генов, предположительно влияющих на исход отношений между человеком и микобактерией, является ген рецептора к витамину Д (VDR) [UitterlindenA.G. etal., 2004]. Витамин Д – это группа родственных стероидов, одним из важнейших среди которых является так называемый Д3 Активизированные макрофаги в свою очередь также способны к образованию кальцитриола. При туберкулезе этот локально продуцируемый кальцитриол может активизировать "проглатывание" и элиминацию МБТ макрофагами и минимизировать тканевую деструкцию [DaviesP.D.O., 1985; CadranelJ. etal., 1988]. Исследования invitro показали, что метаболиты витамина Д могут усиливать способность моноцитов человека ограничивать размножение внутриклеточно расположенных микобактерий туберкулеза. В то время как добавление одного рекомбинантного человеческого IFN-g к пулированным моноцитам человека не оказывало влияния на их туберкулостатическую активность, введение в данную систему дополнительно кальцитриола приводило к полной остановке роста микобактерий [RookG.A.W. etal., 1986; DenisM., 1991]. Все перечисленные эффекты холекальциферола осуществляются посредством специальных рецепторов, которые присутствуют во многих клетках и органах, в том числе в лимфоцитах периферической крови и моноцитах [GriffinM.D. etal., 2003]. Такая широкая распространенность рецепторов к витамину Д говорит о том, что данный стероид и его метаболиты регулируют деятельность многих систем организма. Локализация гена кодирующего рецептор к витамину Д определена у человека на хромосоме 12q12-q14 [LabudaM., 1991]. Известны его полиморфные варианты, наиболее часто из которых исследуются три полиморфизма: F/f, T/t, B/b. Обозначение и название этих полиморфных маркеров произошло от первых букв рестриктаз, используемых для их детекции в ПДРФ-анализе (FokI, TagI, BsmI). Результаты исследования, проведенного в Западной Африке (Гамбия) методом случай – контроль, выявили статистически значимую ассоциацию tt генотипа VDR гена с резистентностью к легочному туберкулезу [BellamyR., 2000]. Подобная работа была проведена в Китае, результаты которой показали наличие ассоциации ff генотипа VDR гена с подверженностью к ТБ [LiuW. etal., 2004]. Однако в популяции Перу статистически значимой ассоциации различных полиморфизмов гена VDR с туберкулезом найдено не было [RothD. E. еtal., 2004]. В другом исследовании было показано, что большую роль в предрасположенности к ТБ играют гаплотипы гена VDR [BornmanL. etal., 2004]. В Лондоне была проведена работа, в результате которой исследователи определили наличие связи между дефицитом холекальциферола в организме человека и активным туберкулезом. Наряду с этим, авторы продемонстрировали отрицательное влияние комбинации генотипов ТТ и Tt, а так же генотипа ff с недостатком витамина Д на резистентность к ТБ [WilkinsonR.J. etal., 2000]. В другом исследовании было показано, что генотип ttVDRгена ассоциирован с подверженностью к легочному туберкулезу у женщин, а, в свою очередь, ТТ генотип – с резистентностью к ТБ у женщин [SelvarajP. etal., 2000]. Таким образом, витамин Д, действуя через рецепторы и модулируя функцию макрофагов, может повышать противотуберкулезную защиту человека. Данное утверждение отчасти объясняет тот факт, что заболеваемость туберкулезом выше в течение холодных сезонов года, когда кожный синтез кальцитриола от экспозиции солнца понижен и серологический уровень витамина Д более низкий [ChanT.Y., 2000]. Однако известно, что действие продукта экспрессии гена рецептора витамина D оказывает умеренное влияние на полную чувствительность к туберкулезу [HillA.V.S., 2001]. К тому же, роль кальцитриола в антибактериальном иммунитете не однозначна, поскольку он наряду с активизацией макрофагов проявляет такие эффекты, как угнетение пролиферации лимфоцитов, снижение продукции иммуноглобулина и синтеза цитокинов [BellamyR., HillA.V.S., 1998; WilkinsonR. J. etal., 2000]. В целом, можно отметить, что в настоящее время имеется достаточно разрозненная информация о генетических основах подверженности к туберкулезу, а так же, видимо, общее количество генов, в той или иной мере влияющих на развитие этого инфекционного заболевания, гораздо выше. Таким образом, поиск новых генов-кандидатов туберкулеза, а так же изучение полиморфизма известных генов-кандидатов в популяциях различного этнического состава и их вклада в общую подверженность к заболеванию представляется на сегодняшний день важной задачей, решение которой позволит определить новые подходы к более эффективному лечению и профилактике ТБ. 2. Материал и методы исследования 2.1 Обследованные группы населения Настоящее исследование включало три аспекта: анализ популяционной распространенности полиморфизма генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL1RN и IL12В, оценку их патогенетической значимости в отношении туберкулеза, а также влияние исследуемых генов на патогенетически важные параметры заболевания. В соответствии с этим, первую часть работы выполнили на материале популяционной выборки здоровых жителей г. Томска (140 человек). Вторая и третья часть исследования проведена на материале выборки больных туберкулезом (304 человека) и их семей (42 семьи, 109 человек), живущих в г. Томске и Томской области. Работа выполнена на базе ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава и ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Набор материала для исследования осуществлялся в Областной Томской клинической туберкулезной больнице, Детском легочно-туберкулезном отделении Железнодорожной больницы, Областной детской туберкулезной больнице, а также Областном противотуберкулезном диспансере, в соответствии с этическими нормами с обязательным получением согласия испытуемых. 2.1.1 Характеристика контрольной выборки В качестве контрольной группы использовалась популяционная выборка, сформированная для настоящего исследования на основе ДНК–банка ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Все лица, вошедшие в эту группу, были русскими. Основным критерием отбора образцов было отсутствие родства между индивидами. В данную выборку вошли индивиды никогда не болевшие туберкулезом по анамнестическим данным (140 человек), средний возраст которых составил 61,8±19,4 лет. Частично ее составили индивиды (118 человек) не родственные между собой и не имеющие по результатам клинического и параклинического обследования легочной патологии. Остальная часть контрольной группы (22 человека) включала пациентов, которым первоначально ошибочно был выставлен диагноз туберкулеза, но затем при более детальном обследовании данное заболевание было исключено. Таким образом, этих индивидов можно считать здоровыми от ТБ. 2.1.2 Характеристика выборки больных туберкулезом Исследованная выборка больных туберкулезом была сформирована из индивидов, не родственных между собой. Выборка была однородной как по расовой принадлежности, так и по этническому происхождению, средний возраст составил 30,6±15,4 года. Все пациенты были русскими; женщин – 99 (32,6%), средний возраст которых составил 26,3 ±14,6 года, мужчин –205 (67,4%), средний возраст – 32,8 ±15,4 лет. Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопии мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких для определения формы заболевания и распространенности специфического процесса (общепринятые методы). Обследованные пациенты имели следующие клинические формы туберкулеза: у 43 человек был диагностирован первичный туберкулез (у 35 – туберкулез внутригрудных лимфоузлов, у 3 – первичный туберкулезный комплекс, у 2 – плеврит туберкулезной этиологии первичного периода, у 2 – гематогенно-диссеминированный туберкулез легких), 150 пациентам был поставлен диагноз инфильтративного туберкулеза легких, 65 – диссеминированный туберкулез легких, 27 пациентам – очаговый туберкулез, у пятерых обследованных индивидов развилась казеозная пневмония, у 4 – фиброзно–кавернозный туберкулез легких, такому же количеству больных был выставлен диагноз туберкуломы легких, 3 пациентам – туберкулез почек, 2 – туберкулез бронха, 1 – плеврит туберкулезной этиологии. 2.1.3 Характеристика семейной выборки пробандов, больных туберкулезом Исследованная семейная выборка была зарегистрирована по пробандам – больным туберкулезом, находившихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях г. Томска в период с 2000 по 2004 г. Всего было обследовано 42 семьи (109 человек), в том числе 25, зарегистрированных по пробандам – детям в возрасте от 1 года до 15 лет. Семнадцать семей было выбрано по взрослым пробандам в возрасте от 17 до 48 лет (табл. 3). Таблица 3 Структура семейного материала выборки изученной по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN Популяция Количество пациентов с ТБ Количество здоровых лиц Исследованные полиморфизмы Ассоциации с ТБ Авторы Гамбия 410 417 5’(CA)n, INT4, D543N, 3’UTR INT4, 3’UTR Bellamy R. et al., 1998 Корея 192 192 D543N, 3’UTR 3’UTR Ryu S. et al., 2000 Япония 267 202 (GT)n, INT4, D543N, 3’UTR D543N, (GT)n Gao P.S.etal., 2000 Гвинея 44 семьи - 5’(CA)n, INT4, INT4 Cervinoetal., 2000 Дания 104 176 5’(CA)n, INT4, D543N, 3’UTR - Soborg C.etal., 2002 Морокко 116 семей - 274С/Т, INT4, 1465-85G/A, D543N, 3’UTR, (GT)n - Baghdadi J. et al., 2003 Россия (Башкор-тостан) 108 195 D543N, 3’UTR 3’UTR Имангулова М.М. и др., 2004 Россия (Тува) 238 263 274С/Т, INT4, 1465-85G/A, D543N, 1465-85G/A Рудко А.А. и др., 2004 Китай 120 240 INT4, D543N, 3’UTR D543N, 3’UTR Liu W. et al., 2004 Выборка Количество детей в семье Всего 1 2 3 4 5 Полные семьи (изучены оба родителя и дети) 19(57) 0 0 0 1(7) 20(64) Неполные семьи (изучен один родитель и дети) 16(32) 1(3) 0 0 0 17(35) Нет данных о родителях 0 5(10) 0 0 0 5(10) Примечание. В скобках указано количество индивидов. Часть пробандов–детей составили мальчики (n=10), а девочек было в 1,5 раза больше (n=15). Средний возраст пробандов–детей разного пола достоверно не различался (7,2 года у мальчиков и 7,5 лет у девочек). Среди взрослых пробандов было 7 женщин (средний возраст – 19,8 лет) и 10 мужчин (средний возраст – 23,9 лет). Всем пробандам был поставлен диагноз туберкулеза, причем первичный и вторичный генез заболевания встречался с одинаковой частотой. Среди обследованных родственников пробандов первой степени родства было 28 лиц мужского пола, из них 8 человек болели туберкулезом, и 39 -женского, из них с туберкулезом 14. 2.2 Методы исследования 2.2.1 Клинико-лабораторные методы исследования Клинико – эпидемиологический анализ больных туберкулезом включал: возраст начала заболевания, социальную категорию, вредные привычки (курение, злоупотребление алкоголем, употребление наркотиков), сопутствующую патологию, наличие контакта с туберкулезным больным, а также данные о туберкулезе у родственников больного. Анализу подвергались выраженность клинических проявлений (жалобы, объективный статус больного), результаты лабораторных и инструментальных методов исследования (микроскопия и посев мокроты на МБТ, чувствительность к противотуберкулезным препаратам, рентгенологическое исследование легких, общий анализ крови) на момент начала заболевания. Для решения задачи по оптимизации и стандартизации сбора информации о больном ТБ была разработана специальная карта "Унифицированный носитель информации", содержащая блоки, охватывающие сведения о жалобах больного, эпидемиологическом анамнезе, анамнезе заболевания, объективном статусе, результатах лабораторного и инструментального обследования. В дальнейшем на основании сведений из этих карт была создана электронная база данных в формате MicrosoftExcel. 2.2.2 Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов Всего было изучено 9 полиморфных вариантов пяти генов – кандидатов подверженности туберкулезу. Исследовали 4 полиморфных варианта гена NRAMP1: 469+14G/C (INT4) – трансверсия гуанина на цитозин в 4 интроне, С274Т – консервативная замена в 3 экзоне, 1465-85 G/A – транзиция в 13 интроне и D543N – неконсервативная замена цитозина на аденин в 15 экзоне; два полиморфизма VDR гена: B/b, F/f; полиморфный вариант IL1B гена в 5 экзоне +3953А1/А2; VNTR полиморфизм гена IL1RN, расположенный во 2 интроне. Также выборки генотипировали по полиморфизму гена IL12В, обусловленному трансверсией аденина на цитозин в 3`-UTR области (табл. 4). Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис Т. и др., 1984; LahiriD. etal., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20° С до проведения эксперимента. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.5). Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10´ буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е. а. Taq ДНК-полимеразы ("Сибэнзим", "Медиген", Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа "Эппендорф", наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах "MJRеsearch" (США) и "БИС 108" (Россия-Новосибирск). Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94°С в течении 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60°С (1мин.), элонгации цепи при 72°С (40 сек.) и денатурации при 94°С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 3 минут. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл.5) при оптимальной для фермента температуре в течении 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10´ буфера для рестрикции, поставляемого фирмой – производителем ("Сибэнзим", Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Продукты рестрикции фракционировали в 3% агарозном геле при напряжении 120 В в течении 30 минут. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолетовом свете. Таблица 4Структура материала популяционных выборок г. Томска и Томской области, изученных по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN Ген Полиморфизм Выборка больных туберкулезом Выборка здоровых индивидов NRAMP1 469+14G/C 279 137 D543N 278 139 1465-85G/A 279 135 274C/T 299 116 IL12B 1188А/С 279 129 VDR B/b 293 108 F/f 298 113 IL1B +3953A1/A2 301 139 IL1RN VNTR 299 140 Таблица 5 Характеристики исследованных полиморфизмов Ген Полимор-физм Структура праймеров tо отжига прай-меров, о С Фермент рестрик-ции Продукты гидролиза, п. н. Литература Аллель «дикого» типа Мутантный аллель NRAMP1 274C/T 5’-tgccaccatccctatacccag –3’ 5’-tctcgaaagtgtcccactcag –3’ 60 Mnl I 167;37;12 bp 102;65;37;12 bp Liu J. et al., 1995 469+14G/C 5’-tctctggctgaaggctctcc –3’ 5’-tgtgctatcagttgagcctc – 3’ 60 Apa I 624 bp 455;169 bp 1465-85G/A 5’-gcaagttgaggagccaagac –3’ 5’-acctgcatcaactcctcttc –3’ 60 Bsе 1I 142;75;24 bp 102;75;40;24 bp D543N 5’-gcatctccccaattcatggt –3’ 5’-aactgtcccactctatcctg –3’ 60 Bme 18I 126;79;39 bp 201;39 bp IL12 A1188C 5’-ttctatctgatttgcttta –3’ 5’-tgaaacattccatacatcc –3’ 43 Taq I 233 bp 165;68 bp Hall M. A. еt al., 2000 VDR B/b 5’-aacttgcatgaggaggagcatgtc-3’ 5’-ggagaggagcctctgtcccatttg-3’ 60 Pct I 813 bp 505;308 bp Wilkinson R.J. et al., 2000 F/f 5’-agctggccctggcactgactctgctct-3’ 5’-atggaaacaccttgcttcttctccctc-3’ 60 Fok I 267 bp 197;70 bp IL1B +3953A1/A2 5’-gttgtcatcagactttgacc-3’ 5’-ttcagttcatatggaccaga-3’ 58 Taq I 220 bp 148; 72 bp Wilkinson R.J. et al., 1999 IL1RN VNTR 5’-tcctggtctgcaggtaa-3’ 5’-ctcagcaacactcctat-3’ 60 А1-410 п.о. (4 повтора); А2-240 п.о. (2 повтора) А3-500 п.о. (5 повторов); А4-325 п.о. (3 повтора) А5-595 п.о. (6 повторов) Tarlow J.K. et al., 1993 2.2.3 Генетико – статистические методы анализа Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью точного теста Фишера [Вейр Б., 1995]. Рассчитывали ожидаемую гетерозиготность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN [NeiM., 1975]. Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле: D=(hobs –hexp )/hexp , где hobs и hexp – ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с туберкулезом, а также с качественными патогенетически важными признаками заболевания, сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера. В дополнение к этому об ассоциации разных генотипов (или их комбинаций) с заболеванием судили по величине отношения шансов (oddsratio (OR)), которая показывает, во сколько раз выше вероятность заболеть для индивида с определенным генотипом (или комбинацией генотипов) [PearceN., 1993]. OR= (A/B)/(C/D), где А – число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе больных; С - число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе здоровых; В – число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе больных; D - число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе здоровых. Значения OR>1 указывают на возможную положительную ассоциацию с заболеванием. Обсуждение величин OR проводили при уровне значимости не более 5%. На материале семейной выборки больных изучение ассоциаций полиморфизма исследованных генов с туберкулезом проводили с использованием теста на неравновесие при переносе (Transmission/DisequilibriumTest, TDT), который в случае диаллельного маркерного локуса М сводится к анализу таблицы сопряженности 2´2, где в ячейках матрицы суммированы случаи наследования и не наследования от родителей больными детьми маркерных аллелей [SpielmanR. S. etal., 1993]. a – число случаев наследования аллеля М1 от родителей М1 М1 ; b – число случаев наследования аллеля М1 от родителей М1 М2 ; c – число случаев наследования аллеля М2 от родителей М1 М2 ; d – число случаев наследования аллеля М2 от родителей М2 М2 ; Используются данные только от гетерозиготных родителей. Статистика теста рассчитывается по формуле: TDT=(b-c)2 /(b+c) и в случае верной нулевой гипотезы (Н0 : нет ассоциации) асимптотически распределена как χ2 с 1 степенью свободы. С целью выявления ассоциации маркеров исследуемых генов с количественными, патогенетически важными признаками туберкулеза, проводили сравнение средних значений уровней метрических показателей у носителей разных генотипов с помощью однофакторного дисперсионного анализа по Фишеру и теста LSD. При наличии зависимости признака от пола показатели анализировались отдельно в группе мужчин и женщин. В случае влияния возраста на количественный параметр проводилась его корректировка, которая осуществлялась с помощью уровня линейной регрессии и рассчитывалась по формуле [Лильин Е.Т. и др., 1984]: y=x+b(t0 -t), где y – коррегированное значение исходной величины (х) признака; t – возраст индивида t0 – определенный возраст, к которому приводятся все значения; b – коэффициент линейной регрессии признака по возрасту, который рассчитывается по формуле: b=rxt /st 2 где rxt – коэффициент корреляции признака с возрастом; st - стандартное отклонение возраста в выборке. Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и Лилифорса. В случае неравных дисперсий использовали непараметрические тесты Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и медианный тест [Лакин Г.Ф., 1990]. Сравнение дисперсий проводили по критерию Левене. Расчеты гаметического неравновесия между парами молекулярно-генетических маркеров проводили по HillW. G. (1974). Все расчеты осуществляли с помощью программ "STATISTICAforWindows 6.0" и "MicrosoftExcel 7.0". 3. Результаты и обсуждение Учитывая поставленные задачи, исследование включало три аспекта: изучение популяционной распространенности полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN, анализ связи исследованных генов с туберкулезом и поиск ассоциаций с патогенетически важными параметрами заболевания у русских жителей г. Томска. К настоящему времени получены результаты исследования аллельных вариантов генов подверженности к ТБ у тувинцев, выполненного по аналогичной схеме и с использованием того же набора полиморфизма генов [Рудко А.А. и др., 2003]. Это дало возможность провести сравнение полученных результатов между русскими жителями г. Томска и тувинцами. 3.1 Распространенность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN среди здоровых лиц (контрольная группа) В настоящее время во многих популяциях мира достаточно широко исследованы полиморфные варианты гена NRAMP1, и в меньшей степени изучена распространенность аллелей генов VDR, IL12B, IL1B, IL1RN[Рудко А.А. и др., 2003; Имангулова М.М. и др., 2004; BellamyR. etal., 1998; RyuS. etal., 2000; CervinoA.C.L. etal., 2000;. Gao P. S., 2000; Baghdadi J. et al., 2004; Liu W. et al., 2004;]. Результаты исследований показали, что полиморфизм этих генов вносит вклад в возникновение туберкулеза. Однако известно, что восприимчивость к инфекционному заболеванию определяется одновременно многими генами с различным вкладом каждого из них в формирование того или иного патологического фенотипа. К тому же, один и тот же ген может участвовать в формировании чувствительности (или резистентности) к нескольким инфекционным заболеваниям. Вероятно, для каждого гена (и их ансамблей) существует свое "поле действия", которое модифицируется средой [Пузырев В.П., 2000]. Сочетания генов предрасположенности к болезни могут быть неодинаковы в популяциях, обусловливая различия в подверженности к заболеванию у разных народов. В связи с этим перспективным направлением исследований генетических основ предрасположенности к туберкулезу является изучение вкладов конкретных сочетаний аллелей в подверженность к болезни в различающихся как по расовой, так и по этнической принадлежности популяциях. У здоровых жителей г. Томска распределение генотипов по всем изученным полиморфным вариантам гена NRAMP1 (469+14G/C, D543N, 1465-85 G/A, 274 C/T), VDR(B/b, F/f), а также генов интерлейкинов (полиморфизм 1188A/C гена IL12B, полиморфизм +3953 A1/A2 гена IL1B) соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ), причем для большинства полиморфизмов наблюдаемая гетерозиготность (Hobs ) превышала ожидаемую (Hexp ) (табл.6). Лишь для частот генотипов VNTR полиморфизма гена IL1RN показано отклонение от ожидаемых при РХВ (χ2 =16,75 р=0,010). При этом наблюдаемое количество гомозигот А2А2 превышало ожидаемое в 2,5 раза, а уровень гетерозиготности был меньше ожидаемого (D= –0,280). Возможно, этот факт объясняется тем, что анализируемая популяционная группа индивидов была выбрана не случайным образом из общей популяции, а включала только здоровых в отношении туберкулезной инфекции. Сравнение распространенности полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RNу здоровых от туберкулеза русских и тувинцев показало статистически значимые отличия между этими этническими группами, которые имели место в распределении, как частот аллелей, так и генотипов по большинству изученных генов (табл. 7). Максимальные отличия между сравниваемыми этническими группами выявлены для полиморфизма B/b гена VDR, VNTR полиморфизма гена IL1RN и 1188А/С гена IL12B. Таблица 6 Частоты аллелей и генотипов исследованных генов у здоровых жителей г. Томска Ген Поли-морфизм Гено-типы N.O. N.E. Частота аллеля χ2 (df) Hobs Hexp D NRAMP1 469+14 G/C GG GC CC 97 38 2 98,22 35,56 3,22 G= 0,847 0,44 (1) 0,277 0,260 +0,069 D543N DD DN NN 127 12 0 127,26 11,48 0,26 D= 0,957 0,01 (1) 0,086 0,083 +0,045 1465-85 G/A GG GA AA 73 47 15 68,98 55,04 10,98 G= 0,715 2,60 (1) 0,348 0,408 -0,146 274C/T CC CT TT 80 34 2 81,11 31,78 3,11 C= 0,836 0,37 (1) 0,293 0,274 +0,070 IL12B 1188 A/C AA AC CC 85 43 1 87,92 37,15 3,92 A= 0,826 2,75 (1) 0,333 0,288 +0,157 VDR B/b BB Bb bb 19 63 26 23,61 53,77 30,61 b= 0,532 2,93 (1) 0,583 0,498 +0,172 F/f FF Ff ff 42 54 17 42,13 53,73 17,13 F= 0,611 0,00 (1) 0,478 0,476 +0,005 IL1B +3953 A1/A2 A1A1 A1A2 A2A2 90 44 5 90,24 43,51 5,24 A1= 0,806 0,00 (1) 0,317 0,313 +0,011 IL1RN VNTR A1A1 A1A2 A1A3 A1A4 A2A2 другие 93 27 4 3 12 1 86,49 40,94 3,96 2,20 4,84 1,57 A1= 0,786 A2= 0,186 A3= 0,018 16,8* (6) 0,250 0,347 -0,280 Примечание. N.O. и N.E. – наблюдаемая и ожидаемая численности генотипов соответственно; χ2 – критерий для сравнения ожидаемого и наблюдаемого распределения генотипов; d.f. – число степеней свободы; Hobs и Hexp – соответственно наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность; D – относительное отклонение наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой; * – p < 0,05 Таблица 7 Частоты аллелей и генотипов исследованных генов у русских жителей г. Томска и тувинцев Ген Полимор-физм Генотип / аллель Русские N (%) Тувинцы N (%) p NRAMP1 469+14 G/C GG GC CC 97 (70,8) 38 (27,7) 2 (1,5) 224 (85,2) 36 (13,7) 3 (1,1) 0,002 G 0,847 0,920 0,002 D543N DD DN NN 127 (91,4) 12 (8,6) 0 (0) 198 (75,3) 57 (21,7) 8 (3) 0,000 D 0,957 0,861 0,000 1465-85 G/A GG GA AA 73 (54,1) 47 (34,8) 15 (11,1) 162 (61,6) 88 (33,5) 13 (4,9) 0,057 G 0,715 0,783 0,040 274 C/T CC CT TT 80 (69) 34 (29,3) 2 (1,7) 207 (78,7) 49 (18,6) 7 (2,7) 0,072 C 0,836 0,880 0,127 IL12B 1188 A/C AA AC CC 85 (65,9) 43 (33,3) 1 (0,8) 104 (39,5) 119 (45,3) 40 (15,2) 0,000 A 0,826 0,622 0,000 VDR B/b BB Bb bb 19 (17,6) 63 (58,3) 26 (24,1) 2 (0,8) 88 (33,5) 173 (65,7) 0,000 b 0,532 0,825 0,000 F/f FF Ff ff 42 (37,2) 54 (47,8) 17 (15) 148 (56,3) 98 (37,3) 17 (6,4) 0,001 F 0,611 0,749 0,000 IL1B +3953 A1/A2 A1A1 A1A2 A2A2 90 (64,7) 44 (31,7) 5 (3,6) 197 (74,9) 61 (23,2) 5 (1,9) 0,086 A1 0,806 0,865 0,035 IL1RN VNTR A1A1 A1A2 A2A2 другие 93 (66,4) 27 (19,3) 12 (8,6) 8 (5,7) 190 (72,5) 31 (11,8) 1 (0,4) 40 (15,3) 0,000 A1 A2 A3 0,786 0,186 0,018 0,849 0,069 0,013 0,000 Примечание. N – численность лиц с соответствующими генотипами; р – достигнутый уровень значимости У русских г. Томска по сравнению с тувинцами аллели b гена VDR и А1 гена IL1RN встречались реже, а аллель 1188А гена IL12B – чаще. Кроме того, рассматриваемые популяционные группы статистически значимо различались по частотам аллелей и генотипов полиморфизмов 469-14G/C, D543N гена NRAMP1 и F/f гена VDR. Так, у русских чаще, чем у тувинцев наблюдали аллель 543D и реже аллель 469+14G гена NRAMP1. Индивиды, гомозиготы и гетерозиготы по аллелю f гена VDR, чаще встречались среди жителей г. Томска. Распределение генотипов полиморфизма 1465-85G/A гена NRAMP1 и +3953A1/A2 гена IL1B в исследованных популяционных группах не отличалось, однако частоты аллелей этих полиморфизмов были статистически значимо ниже у русских. Лишь для варианта 274С/Т гена NRAMP1 не найдено отличий по частотам аллелей и генотипов у русских и тувинцев. К настоящему времени накоплены результаты многочисленных исследований роли генов-кандидатов туберкулеза в патогенезе заболевания у представителей различных этнических групп. Это позволило провести сравнительный анализ частот генотипов между русскими г. Томска и другими изученными популяциями мира. Найдены статистически значимые отличия русских от других этносов по частотам аллелей генов NRAMP1, VDR, IL12B (табл. 8). Частота аллеля 469+14GNRAMP1 у жителей г. Томска оказалась статистически значимо ниже, чем у африканцев из Гамбии, но выше, чем у китайцев [BellamyR. etal., 1998; LiuW. etal., 2004]. Самым широко исследованным полиморфизмом гена NRAMP1 оказался D543N. Во все изученных популяциях этот генный маркер был низко полиморфным. Русские отличались по частоте аллелей D543N от коренных жителей Башкирии, у которых аллель 543N вообще не обнаружен [Имангулова М.М. и др., 2004]. При сравнении с другими исследованными популяциями (китайцы, корейцы, японцы, татары, гамбийцы) статистически значимых отличий для этого полиморфного варианта не показано (рис. 2, табл. 8) [ИмангуловаМ.М. идр., 2004; Bellamy R. et al., 1998; Ryu S. et al., 2000; Gao P. S. et al., 2000; Liu W. et al., 2004]. Рис. 2. Частоты аллелей гена NRAMP1 у русских г. Томска и в других популяциях мира (по данным литературы). * – р < 0,05 Таблица 8 Частоты аллелей генов-кандидатов туберкулеза в различных популяциях мира в сравнении с русскими г. Томска NRAMP1 / 469+14 G/C Популяции Китайцы Гамбийцы Частота ал. χ2 (p) G=0,785 3,83 (0,050) G=0,934 18,65 (0,000) NRAMP1 / D543N Популяции Китайцы Корейцы Японцы Гамбийцы Татары Башкиры Частота аллеля χ2 (p) D=0,981 1,84 (0,175) D=0,925 2,38 (0,123) D=0,933 1,30 (0,254) D=0,948 0,16 (0,690) D=0,983 0,94 (0,333) D=1,00 5,57 (0,018) VDR / F/f Популяции Китайцы Индийцы (Лондон) Частота аллеля χ2 (p) F=0,604 0,01 (0,935) F=0,806 20,28 (0,000) IL1B / +3953A1/A2 Популяции Индийцы (Лондон) Частота аллеля χ2 (p) A1=0,794 0,05 (0,825) IL1RN / VNTR Популяции Индийцы (Лондон) Частота аллеля χ2 (p) A1=0,719 A2=0,241 A3=0,039 A4=0 7,15 (0,067) IL12B / 1188A/C Популяции Англичане Камерунцы Греки Ирландцы Частота аллеля χ2 (p) А=0,835 0,06 (0,812) А=0,625 18,37 (0,000) А=0,789 0,98 (0,323) А=0,802 0,23 (0,629) Примечание. χ2 – критерий использован для сравнения частот аллелей; р – достигнутый уровень значимости Рис. 3. Частоты аллелей полиморфизма F/f гена VDR, +3953A1/A2 гена IL1B, VNTR гена IL1RN у русских г. Томска и в других популяциях (по данным литературы). * – р < 0,05 Не показано различий при сравнении частот аллелей полиморфизма F/f гена VDRу русских г. Томска и китайцев [LiuW. etal., 2004]. Однако при сравнении с индийцами Лондона найдены статистически значимые отличия [WilkinsonR.J. etal., 2000]. В исследованной выборке русских аллель F гена VDR встречался реже (рис. 3, табл. 8). Для полиморфных вариантов +3953А1/А2 гена IL1B и VNTR гена IL1RN не выявлено отличий частот аллелей у русских и индийцев Лондона. Аллель 1188А гена IL12B у жителей г. Томска встречался чаще, чем у камерунцев (χ2 =18,37 р=0,000). Не выявлено различий в распространенности этого маркера при сравнении с англичанами, ирландцами и греками (рис. 4, табл. 8) [HallM.A. etal., 2000]. Установленные различия частот аллелей сравниваемых генов между русским населением г. Томска и другими популяциями мира свидетельствуют об этнической специфичности генов-кандидатов подверженности к туберкулезу. Возможно, это является одной из причин дифференциальной распространенности ТБ в этнических группах. Интересными представляются выявленные отличия по частотам аллелей для всех анализируемых маркеров у русских г. Томска при сравнении с жителями Тувы. Кроме того, известно, что по частотом аллелей рассматриваемых генов тувинцы значительно отличались не только от русских, но и от представителей иных популяционных групп [Рудко А.А. и др., 2003]. Вероятно, этот факт обусловлен длительной изоляцией тувинцев от других этносов, что привело к формированию уникального генофонда [Пузырев В.П. и др., 1999]. Рис. 4. Частоты аллелей полиморфизма 1188А/С гена IL12B у русских г. Томска и в других популяциях мира (по данным литературы). * – р < 0,05 Известно, что между неаллельными генами, расположенными близко на хромосоме, может возникнуть неравновесие по сцеплению в силу того, что в процессе мейоза кроссинговер между ними происходит реже, чем между далеко расположенными локусами. К тому же, под воздействием факторов популяционной динамики (естественного отбора) "сцепленными" могут оказаться гены, локализованные на разных хромосомах [Животовский Л.А., 1984]. Поэтому был проведен анализ гаметического неравновесия между исследованными полиморфными вариантами. Известно, что гены NRAMP1, IL1B и IL1RN расположены на длинном плече второй хромосомы, ген VDR – на двенадцатой, а ген IL12B – на пятой хромосоме. У русских г. Томска установлено, что в неравновесии по сцеплению находятся четыре пары полиморфизмов гена NRAMP1: 469+14G/C и 274C/T, 469+14G/C и 1465-85G/A, 274C/T и 1465-85G/A, D543N и 1465-85G/A (табл. 9). Во всех случаях неравновесия в фазе притяжения были часто встречающиеся аллели. Полиморфизм 274С/Т расположен в третьем экзоне гена, а 469+14G/C – в четвертом интроне. Такая локализация их в гене легко обьясняет наблюдаемое между ними сцепление (+0,104). Полиморфизм 1465-85G/A и D543N находятся в 13 интроне и 15 экзоне соответственно, что обусловливает неравновесие по сцеплению между ними (+0,017). Сила сцепления между полиморфизмом 1465-85G/A и вариантами 469+14G/C, 274C/T была примерно на одном уровне и составила +0,078 и +0,085, соответственно. Интересным представляется тот факт, что пары полиморфизмов гена NRAMP1, оказавшихся в неравновесии по сцеплению, были идентичны у тувинцев и русских [Рудко А.А., 2004]. Кроме того, у жителей г. Томска, в фазе притяжения оказались аллели гена VDR: b и F, сила сцепления между ними составила +0,053. Аллельный вариант F/f гена VDR у русских оказался в фазе отталкивания с полиморфизмами 469+14G/C, 274C/T, 1465-85G/A гена NRAMP1, мера неравновесия для них была –0,040, -0,039, -0,058, соответственно. Во всех случаях в фазе отталкивания оказались часто встречаемые аллели. Таблица 9 Неравновесие по сцеплению между парами исследованных полиморфных вариантов генов у русских г. Томска Ген NRAMP1 IL12B VDR IL1B IL1RN Ген Полимор-физм 469+14G/C 274C/T 1465-85 G/A D543N 1188 A/C F/f B/b +3953 A1/A2 VNTR NRAMP1 469+14 G/C - +0,104 +0,078 +0,078 -0,009 -0,040 -0,012 -0,030 +0,002 274C/T 70,39 - +0,085 +0,002 -0,019 -0,039 -0,003 -0,026 +0,003 1465-85 G/A 29,94 29,79 - +0,017 -0,041 -0,058 -0,027 -0,014 +0,016 D543N 1,54 0,085 4,69 - +0,001 -0,010 -0,005 -0,001 +0,013 IL12B 1188A/C 0,505 1,88 7,08 0,029 - +0,011 +0,016 +0,018 -0,000 VDR F/f 6,12 4,92 7,68 1,05 0,361 - +0,053 -0,012 +0,008 B/b 0,465 0,03 1,47 0,221 0,730 4,65 - +0,006 -0,010 IL1B +3953 A1/A2 5,88 3,63 0,747 0,017 1,85 0,371 0,104 - -0,023 IL1RN VNTR 0,024 0,042 0,890 3,08 0,001 0,162 0,217 2,65 - Примечание. Над центральной диагональю указаны значения меры неравновесия по сцеплению (D), под диагональю – соответствующее значение χ2 для теста на неравновесие по сцеплению. Выделены величины, для которых достигнутый уровень значимости составил 5% и менее 64 Также в фазе отталкивания находились аллели 1465-85G гена NRAMP1 и 1188А гена IL12B, 469+14G гена NRAMP1 и +3953А1 гена IL1B, мера сцепления для них была –0,041 и –0,030. Естественный отбор в теории популяционной генетики является важнейшим фактором эволюции, вызывающим адаптивные изменения в генетической структуре популяций. В случае формирования гаметического неравновесия между маркерами под воздействием естественного отбора, определенные комбинации аллелей разных локусов дают селективные преимущества их носителям и, следовательно, сохраняются при отборе и накапливаются в популяции [Алтухов Ю.П., 2003]. 3.2 Анализ связи полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RNс туберкулезом Туберкулез – инфекционное заболевание, обладающее клиническим полиморфизмом. Специфическая гранулема – субстрат болезни – может развиться в любом органе или ткани [Cтруков А.И., Кауфман О.Я., 1989; Ерохин В.В., Земскова З.С., 2003]. Современная классификация туберкулеза, в основу которой положено два признака: локализация процесса и клинико – рентгенологические особенности форм, насчитывает 23 основных клинических формы туберкулеза [Хоменко А.Г., 1996]. Такое разнообразие проявлений одного заболевания определяют множество факторов. Несомненно, в этом случае играют немаловажную роль свойства самой микобактерии туберкулеза, такие как вирулентность, резистентность к противотуберкулезным препаратам, а также массивность инфекции. От состояния естественных защитных сил организма (барьерная функция слизистой оболочки дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта) также будет зависеть исход встречи человека и микобактерии туберкулеза. Результаты современных генетических исследований не оставили сомнений в существовании наследственной предрасположенности к туберкулезу [Хоменко А.Г., 1996; Чуканова В.П., 2001; HillA.V.S., 1999]. Они показали, что одной из причин, определяющих такое разнообразие клинических проявлений, является полиморфизм генов, чьи продукты экспрессии вовлечены в патогенез заболевания. В то же время, пока не ясно, какие именно варианты генов имеют решающее значение. В связи с этим важно изучить вклад конкретных сочетаний аллелей в развитие болезни. В исследованной выборке 304 больных туберкулезом русских жителей г. Томска и Томской области проанализировано распределение генотипов и частот аллелей полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN (табл. 10). Выявлено отклонение наблюдаемого распределения генотипов полиморфизма B/b гена VDR от ожидаемого при РХВ (χ2 =6,95; р=0,008) за счет повышенной гетерозиготности (табл. 10). Учитывая неслучайный характер отбора индивидов в выборке, можно предположить наличие вероятного вклада гена VDR в патогенез туберкулеза. Для исследованных полиморфизмов генов NRAMP1, IL12B, IL1B, IL1RN в общей группе больных туберкулезом отклонение от РХВ не показано. Известно, что у жителей Тувы больных туберкулезом выявлено отклонение от РХВ для полиморфизмов 1465-85G/A и D543N гена NRAMP1 за счет пониженного количества гетерозигот в обоих случаях и для полиморфизмов B/b и F/f гена VDR за счет повышенной гетерозиготности [Рудко А.А., 2004]. Таким образом, как для русских, так и для тувинцев, больных туберкулезом, характерно повышенное количество гетерозигот B/b гена VDR. Сравнение частот аллелей и генотипов у русских и тувинцев, больных туберкулезом, показало статистически значимые отличия для всех исследованных полиморфных маркеров (табл. 11). Максимальная степень отличий частот аллелей и генотипов показана для полиморфизма B/b гена VDR. Таблица 10 Частоты аллелей и генотипов исследованных полиморфизмов у больных туберкулезом Ген Поли-морфизм Гено-типы N.O. N.E. Частота аллеля χ2 (d.f.) Hobs Hexp D NRAMP1 469+14 G/C GG GC CC 179 94 6 183,07 85,86 10,07 G= 0,810 2,25 (1) 0,337 0,308 +0,095 D543N DD DN NN 263 14 1 262,23 15,54 0,23 D= 0,971 1,28 (1) 0,050 0,056 -0,099 1465-85 G/A GG GA AA 126 126 27 128,03 121,94 29,03 G= 0,677 0,25 (1) 0,452 0,437 +0,033 274C/T CC CT TT 163 122 14 167,82 112,37 18,81 C= 0,749 2,01 (1) 0,408 0,376 +0,086 IL12B 1188 A/C AA AC CC 162 100 17 161,09 101,82 16,09 A= 0,760 0,05 (1) 0,358 0,365 -0,018 VDR B/b BB Bb bb 49 168 76 60,37 145,26 87,37 b= 0,546 6,95* (1) 0,573 0,496 +0,157 F/f FF Ff ff 124 134 40 122,42 137,16 38,42 F= 0,641 0,12 (1) 0,450 0,460 -0,023 IL1B +3953 A1/A2 A1A1 A1A2 A2A2 169 108 24 165,21 115,57 20,22 A1 0,741 1,16 (1) 0,359 0,384 -0,066 IL1RN VNTR A1A1 A1A2 A1A3 A1A4 A2A2 A2A3 другие 158 100 10 1 25 4 1 152,43 110,16 11,53 0,43 19,90 4,17 0,38 A1= 0,714 A2= 0,258 A3= 0,027 6,35 (6) 0,385 0,422 -0,088 Примечание. Обозначения см. табл. 6 Таблица 11 Сравнение частот аллелей и генотипов у русских и тувинцев с ТБ Полимор-физм Гено-типы Частоты (%) p Ал-лели Частоты p русские тувинцы русские тувинцы NRAMP1 469+14 G/C GG GC CC 179 (64,2) 94 (33,7) 6 (2,1) 198 (85) 32 (13,7) 3 (1,3) 0,000 G 0,810 0,918 0,000 D543N DD DN NN 263 (94,6) 14 (5) 1 (0,4) 191 (80,9) 39 (16,5) 6 (2,6) 0,000 D 0,971 0,892 0,000 1465-85G/A GG GA AA 126 (45,2) 126 (45,2) 27 (9,6) 153 (65,7) 63 (27) 17 (7,3) 0,000 G 0,677 0,794 0,000 274C/T CC CT TT 163 (54,5) 122 (40,8) 14 (4,7) 190 (80,5) 45 (19,1) 1 (0,4) 0,000 C 0,749 0,900 0,000 IL12B 1188 A/C AA AC CC 162 (58) 100 (35,8) 17 (6,2) 90 (38,6) 102 (43,8) 41 (17,6) 0,000 A 0,760 0,605 0,000 VDR B/b BB Bb bb 49 (16,7) 168 (57,3) 76 (26) 3 (1,3) 82 (35) 149 (63,7) 0,000 b 0,546 0,812 0,000 F/f FF Ff ff 124 (41,6) 134 (45) 40 (13,4) 125 (53,6) 102 (43,8) 6 (2,6) 0,000 F 0,641 0,755 0,000 IL1B +3953 A1/A2 A1A1 A1A2 A2A2 169 (56,1) 108 (35,9) 24 (8) 185 (79,1) 47 (20) 2 (0,9) 0,000 A1 0,741 0,891 0,000 Примечание. р – достигнутый уровень значимости при сравнении частот аллелей и генотипов У русских с ТБ и здоровых по сравнению с жителями Тувы чаще наблюдали гомозиготный по аллелею В и гетерозиготный генотипы. Среди жителей г. Томска, больных туберкулезом, по сравнению с тувинцами статистически значимо чаще встретились аллели 469+14C, 1465-85A, 274T гена NRAMP1, f гена VDR, и +3953А2 гена IL1В, реже регистрировались аллели 543N гена NRAMP1 и 1188С гена IL12B. В целом можно отметить, что отличия в распределении генотипов и аллелей между русскими и тувинцами были идентичными у больных и здоровых: у русских с туберкулезом преобладали те же аллели генов, что и у здоровых. При сравнении распределений генотипов и частот аллелей в выборках больных и здоровых лиц, живущих в г. Томске и Томской области, выявлены статистически значимые отличия для полиморфизма 274С/Т гена NRAMP1 и трех генов, принимающих участие в продукции интерлейкинов (табл. 12). Так, у больных туберкулезом статистически значимо чаще регистрировался гетерозиготный генотип 274С/Т гена NRAMP1 (OR=1,66, 95%CI:1,02–2,71; p=0,040). Лица, обладающие гомозиготным генотипом 274С/C чаще встречались среди здоровых (OR=0,54, 95%CI:0,33–0,87; р=0,010). Показаны отличия частот аллелей у больных и здоровых для полиморфизма +3953 А1/А2 гена IL1B (p=0,036) за счет повышения доли аллеля А2 у больных туберкулезом. В тоже время, не найдено отличий при сравнении распределения генотипов этого полиморфизма гена IL1В (табл. 12). Различия по VNTR полиморфизму гена IL1RN в выборках больных и здоровых касались как частот аллелей, так и частот генотипов. Аллель А2 статистически значимо чаще встречался у пациентов с туберкулезом. При сравнении частот генотипов выявлено более высокое количество гетерозигот А1/А2 у больных туберкулезом по сравнению с контролем (OR=2,10, 95%CI:1,26–3,51, р=0,003) (табл. 12). В противоположность этому у африканцев гетерозиготы по аллелю А2 IL1RN статистически значимо реже встречались у больных туберкулезом, чем в контрольной группе [BellamyR., RuwendeC., 1998]. Найдена ассоциация полиморфизма 1188А/С гена IL12В с туберкулезом. Установлено, что распределение генотипов и частота аллелей в группах больных и здоровых различаются. В выборке больных статистически значимо чаще встречаются гомозиготы по аллелю 1188С (р=0,035). В данном случае вероятность заболеть туберкулезом обладателей гомозиготного генотипа 1188С/С значимо выше, чем у индивидов с гомозиготным генотипом 1188А/А и гетерозиготным (OR=8,31, 95%CI:1,15–169,30, р=0,030) (табл. 12). Несмотря на отклонение распределения генотипов от ожидаемого при РХВ полиморфизма B/b гена VDR у больных туберкулезом, не показано отличий между больными и здоровыми. Диагноз туберкулеза устанавливается на основании наличия у больного характерных жалоб, эпидемиологического анамнеза, анамнеза заболевания, клинических симптомов, характерных изменений в общем анализе крови и рентгенологической картины. Однако только при обнаружении микобактерий туберкулеза (МБТ) в мокроте диагноз туберкулеза можно считать верифицированным [Рабухин А.Е.,1976]. Учитывая это, при дальнейшем анализе из общей группы больных была выделена выборка пациентов с бактериовыделением (МБТ+) (n=234). При сравнении распределения генотипов и частот аллелей в группах больных лабораторно подтвержденным туберкулезом и контрольной, найдены статистически значимые отличия для полиморфизма 274С/Т гена NRAMP1, аллельного варианта +3953 А1/А2 гена IL1B, VNTR полиморфизма гена IL1RN и полиморфизма 1188А/С IL12В (табл. 13). Частота аллеля 274Т гена NRAMP1 была выше в группе больных (р=0,009). Показана протективная роль генотипа 274С/С (OR=0,53, 95%CI: 0,32– 0,88, р=0,012). Таблица 12 Статистические показатели для сравнения частот аллелей и генотипов у больных туберкулезом и здоровых               содержание   ..  115  116  117   ..   Ген Полимор-физм Гено-типы Сравнение OR (95%CI) Генотиповр Аллелейр NRAMP1 469+14 G/C GG GC CC 0,393 0,229 0,74(0,46–1,18) 1,32 (0,83–2,13) 1,48 (0,27–10,77) D543N DD DN 0,283 0,377 1,66 (0,70–3,88) 0,56 (0,24–1,34) 1465-85 G/A GG GA AA 0,134 0,312 0,70 (0,45–1,08) 1,54 (0,99–2,41) 0,86 (0,42–1,76) 274C/T CC CT TT 0,009 0,020 0,54* (0,33–0,87) 1,66* (1,02–2,71) 2,80 (0,59–18,13) IL12B 1188 A/C AA AC CC 0,035 0,044 0,72 (0,45–1,13) 1,12 (0,70–1,78) 8,31* (1,15–169,30) VDR B/b BB Bb bb 0,925 0,791 0,94 (0,51–1,76) 0,96 (0,60–1,54) 1,10 (0,64–1,91) F/f FF Ff ff 0,705