2.1.1.Общая методика.
Экспериментальная часть работы выполнялась на ферме крупного рогатого скота учебно-опытного хозяйства «Кетросу», района Анений Ной, ОПХ «Колоница» района Криулень и в лаборатории микробиологии кафедры эпизоотологии Государственного aграрного университета Молдовы с 1973 по 1998 год.
Опыты проводились на коровах черно-пестрой породы 5-8 лактации и на родившихся от них телят, с целью изучения состояния неспецифической и специфической иммунологической реактивности новорожденных телят при колибактериозе, а также выявления роли кислотно-основного баланса в течение инфекционного процесса, коррекции иммунодефицитного состояния новорожденных телят. Для лечения применяли антисекреторные препараты, ингибирующие циклический аденозинмонофосфат.
Пробы молозива отбирались в первый день (из первого, второго и третьего доения), на второй, пятый день после отела, а на десятый, двадцатый день и через месяц исследовалось молоко.
В сыворотке крови, молозиве и молоке изучались: динамика накопления агглютининов, иммуноглобулиновый уровень, в т. ч. в динамике.
Сыворотку крови получали путем отстаивания, а из молозива — методом пепсинизации. Из сывороток молозива первого и второго дня после отела выделяли колостральную сыворотку и лактоглобулин. У родившихся телят от опытных и контрольных групп коров в сыворотке крови изучали: динамику накопления О- и К- антител-агглютининов, уровень иммуноглобулинов в зависимости от клинического статуса, показатели фагоцитоза, пропердина, комплиментарной и бактерицидной активности (до поения молозивом, на 2, 5, 10, 20 и 30 день жизни).
Бактерицидные свойства колостральной сыворотки и сыворотки крови новорожденных телят изучали нефелометрическим методом. Профилактические и лечебные свойства молозивных сывороток и лактоглобулина изучались на лабораторных животных и телятах.
Коррекцию иммунодефицита неонатальных телят, проводили с применением лактоглобулина и витамина А.
В качестве анти-секреторных факторов, ингибирующих циклический аденозинмонофосфат (сАМР) применяли хлорпромазин и Т-активин.
Опыты проводились на 562 телятах, 468 коровах, 247 белых мышах и 30 кроликах.
Полученный цифровой материал подвергался биометрической обработке по различным биометрическим методикам: [Дж. У. Снедекор, 1961; И. П. Ашмарин, А. А. Воробьев, 1962; В. Ю. Урбах, 1964; Е. В. Гублер, А. А. Генкин А. А., 1969].
2.1.2. Приготовление колибактериозного антигена.
Для приготовления антигена использовали три серотипа колибактерий: О78:К80, О119:К69 и О137:К79.
Использованные серотипы Е. coli
по морфологическим и биохимическим свойствам были типичными, отвечающими требуемым иммуногенным, антигенным н вирулентным свойствам.
Е. coli
О78:К80, О119:К69 и О137:К79 раздельно высевали в пробирки с мясопептонным бульоном на 12 ч и проверяли на чистоту (микроскопия мазков, окрашенных по Граму). В последующем бульонную культуру высевали на стерильный мясопептонный агар в матрацах. Посевы выращивали в термостате в течение 18 ч при температуре 37° С, проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Для выделения О-антигена бактериальную суспензию автоклавировали при 120°С в течение 2 ч дня разрушения К-антигена. Густую отмытую суспензию Е. coli
содержащую 10 млрд. микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту, смешивали с ацетоном в отношении 1:5 до появления коагуляции (свертывания). Плотную часть материала отбирали на воронке Бюхнера, промытой один раз ацетоном и затем высушенной эфиром. Препарат высушивали на воздухе и хранили при 4°С.
Сухой порошок применяли для приготовления суспензии антигена, добавляя 1 мг высушенных ацетоном бактерий на 1 мл барбиталового буфера.
Для выделения К-антигена бактериальную суспензию получали путем смыва из агаровых культур изотоническим раствором хлорида натрия, содержащего 0,5 % формальдегида. Бактерии были экстрагированы при добавлении ацетона непосредственно после их смыва с агаровой культуры и промыты. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].
Полученные О- и К-антигены проверяли на стерильность и на безвредность. Стерильность устанавливали путем высева на МПБ, МППБ и МПА. Посевы выдерживали 10 дней в термостате (+37°С). Безвредность антигенов была проверена на лабораторных животных. Для этого каждый из антигенов вводили 10 белым мышам под кожу в области спины по 0,5 мл и 5 морским свинкам в области внутренней поверхности задней конечности по 1,0 мл. Клинические наблюдения за опытными животными вели в течение 15 дней.
Отсутствие роста в посевах на МПБ, МППБ и МПА и гибели привитых животных позвонило считать антигены стерильными и безвредными. Хранились антигены при температуре +4 +5°С в холодильнике.
2.1.3. Изучение агглютиногенных свойств серотипов О78:К80, О119:К69 и О137:К79 Е. coli
.
Для определения агглютиногенности изучаемых серотипов использовали 30 кроликов, по 5 на каждый серотип (определение О- и К-антигенов). Антигены вводили кроликам в краевую вену уха в нарастающих дозах (от 0,5 до 2,0 мл) с интервалом в три дня, четырехкратно.
Для определения О-антигена смешивали одну каплю антигена с одной каплей соответствующей О-сыворотки на зеркальном стекле, размещали над водяной баней при 60°С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания.
Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя формалинизировавную шестичасовую культуру в МПБ. Основное разведение сыворотки 1:10.
Для определения К-антигена культуру вначале тестировали пластинчатой реакцией агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии культуры смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты учитывали в течение 30с после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген живую пятичасовую культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37°С два часа, в последующем агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в течение трех минут. Одинаковый писк агглютинации учитывали как позитивную реакцию. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].
2.1.4. Получение сыворотки крови, молозива и молока.
Кровь от животных (коров, телят) брали из яремной вены в стерильные пробирки и помещали в термостат (+37°С) на 3 ч, после чего выдерживали 12-16 ч при комнатной температуре до полного отделения сыворотки. Затем сыворотку отсасывали в стерильные пробирки и помещали в холодильник (+4 +5°С).
Молозиво от коров брали при первом, втором и третьем доении после отела, а затем на второй, пятый, десятый, двадцатый дни и через месяц.
Сыворотку из молозива и молока получали путем добавления пепсина. На каждые 1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и после тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при температуре 38° С на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от сыворотки фильтрацией через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам через воронку Бюхнера с двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем через бактериальный фильтр Зейтца.
2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками.
В центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина, приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл исследуемого молозива или молока, тщательно перемешивали и для свертывания ставили в термостат при температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво отделяли от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин.
С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра сыворотки. Контроли обычные.
Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и помешали в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через 24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.
