Ферменты микроорганизмов

Истоки современной биотехнологии уходят глубоко в прошлое. С незапамятных времен получали пищевые продукты и улучшали их качество с использованием биологических процессов и агентов. В качестве биологических агентов применялись различные организмы (от животных до микроорганизмов) На этом принципе основаны общеизвестные древнейшие способы получения молока, изготовления вин, уксуса, пивоварения, сыроделия, хлебопечения и т. д.

Хотя история пищевых технологий насчитывает тысячелетия, тем не менее совершенствование их постоянно продолжается. В последнее время наметились перспективы принципиального сдвига в технологии получения и улучшения качества пищевых продуктов. Это связано с переходом от использования целых биологических организмов на клеточный и молекулярный уровни. Появилась возможность конструировать биологические агенты, изменять структуру молекул, «резать» их на части и соединять по усмотрению исследователя-биотехнолога, извлекать биокатализаторы из естественного клеточного окружения и присоединять с помощью ковалентных или других связей к специальным носителям (тем самым опять-таки изменять структуру молекул) и т.д. В этом и заключается главное и принципиальное отличие традиционных пищевых технологий и их традиционного научного фундамента от современной биотехнологии. Следует, впрочем, иметь в виду, что четкую грань между технической биохимией и биотехнологией провести достаточно трудно.

Может возникнуть вопрос, почему в разделе, посвященном промышленным процессам инженерной энзимологии, речь идет в основном о получении пищевых продуктов. Дело в том, что иммобилизованные ферменты и клетки в основном используют в получении пищевых продуктов и в меньшей степени фармацевтических препаратов. Такое ограничение вызвано весьма малой доступностью (в широких масштабах) ферментов, способных катализировать реакции технологической значимости, например, в органической или неорганической химии, нефтехимии, полимерной химии, фармацевтической промышленности и т. д. Напротив, традиционное использование растворимых ферментов в пищевой промышленности создало определенный фундамент для дальнейшего совершенствования методов в этой области.

Биотехнологические производства с использованием ферментов микроорганизмов

К настоящему времени семь процессов с использованием иммобилизованных ферментов или клеток нашли крупномасштабное промышленное применение в ряде развитых стран мира:

1. Производство глюкозо-фруктозных сиропов и фруктозы из глюкозы.

2. Получение оптически активных L-аминокислот из их рацемических смесей.

3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты.

4. Синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты.

5. Производство диетического безлактозного молока.

6. Получение Сахаров из молочной сыворотки.

7. Получение 6-аминопенициллановой кислоты (пенициллинового ядра) из обычного пенициллина (пенициллина G) для последующего производства полусинтетических антибиотиков пенициллинового яда.

1. Получение глюкозо-фруктозных сиропов

Фруктоза, или иначе фруктовый, плодовый или медовый сахар, широко распространена в природе. Особенно богаты ей
яблоки и помидоры, а также пчелиный мед, который почти наполовину состоит из фруктозы. По сравнению с обычным пищевым сахаром (в состав которого фруктоза также входит, но в виде химического соединения с менее сладкой глюкозой) фруктоза обладает более приятным вкусом, и согласно профессиональной терминологии вкус фруктозы «медовый», а обычного
сахара — «приторный». Она на 60—70% слаще сахара и потреблять ее можно меньше, а значит, меньше будет и калорийность продукта. Это важно с точки зрения диетологии питания. Фруктозу в отличие от глюкозы и пищевого сахара могут потреблять больные диабетом, так как замена сахара фруктозой существенно снижает вероятность возникновения диабета. Это объясняется тем, что усвоение фруктозы не связано с превращением
инсулина. Кроме того, она в меньшей степени вызывает заболевание зубов , чем сахар.В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется (не засахаривается), поэтому нашла широкое применение в производстве мороженого, кондитерских изделий и т. д. Несмотря на неоспоримые преимущества фруктозы по сравнению с обычным сахаром, вплоть до начала 70-х годов она не производилась промышленным путем. В 1973 г. американской компанией «Клинтон Корн» был внедрен в промышленность процесс превращения глюкозы во фруктозу под действием иммобилизованного фермента глюкозоизомеразы, этот процесс стал самым крупным в мире по сравнению с другими, в которых используются иммобилизованные ферменты.

Основы процесса.

Фермент глюкозоизомераза катализирует превращение глюкозы, получаемой при гидролизе крахмала (кукурузного или реже картофельного), в смесь глюкозы и фруктозы. Образующийся глюкозо-фруктозный сироп содержит 42—43% фруктозы, около 51% глюкозы и не более 6% ди- или олигосахаридов, по сладости соответствует обычному сахару или инвертному сахару, получаемому кислотным (или ферментативным) гидролизом сахарозы.

Для некоторых пищевых производств (например, безалкогольных напитков типа кока-колы) употребляют глюкозо-фруктозные сиропы с содержанием фруктозы 55 и 90%. Их в свою очередь изготавливают из обычных (42%-ных по фруктозе) сиропов с использованием разделительных процессов типа жидкостной хроматографии.

Глюкозо-фруктозная смесь поступает на рынок в виде сиропов. Применяется при производстве тонизирующих и ацидофильных напитков, мороженого, кондитерских изделий, хлеба, консервированных фруктов и т. д.

Технологические варианты процессов.

В литературе содержится немного данных о технологических деталях процессов. Несмотря на то, что почти в каждом процессе применяются ферменты или клетки различного происхождения, имеющие неодинаковую каталитическую активность и полученные различными методами иммобилизации, все процессы имеют общие черты.

2. Получение L-аминокислот

Аминокислоты — главный строительный материал организма, из которого формируются пептиды и белки. Растения и микроорганизмы способны сами синтезировать все нужные им аминокислоты из более простых химических соединений. Однако человеческий организм способен синтезировать лишь 12 из 20 аминокислот, необходимых ему для жизнедеятельности. Остальные 8 аминокислот получили название незаменимых и должны поступать в организм извне — с пищей. При нехватке хотя бы одной из незаменимых аминокислот замедляется рост организма, проявляется патология. Поэтому важно синтезировать эти аминокислоты в промышленных масштабах для корректировки рационов питания, в лечебных и профилактических целях и т. д. Кроме того, аминокислоты (как заменимые, так и незаменимые) являются важнейшим сырьем для обеспечения многих биотехнологических процессов.

Производство многих аминокислот, в том числе и незаменимых, —крупнотоннажная отрасль химической промышленности. Однако с помощью химических методов получается смесь оптических изомеров аминокислот, иначе говоря, смесь L- и D- аминокислот, молекулы которых в L- и D-форме представляют собой зеркальные изомеры. В химических реакциях эти изомеры практически неразличимы, однако человеческий организм усваивает лишь L-аминокислоты (за исключением метионина). Для большинства биотехнологических процессов D- аминокислоты также не представляют ценности.

Разделение смеси L- и D- аминокислот, так называемой рацемической смеси, на составляющие их изомеры стало первым процессом в мире, осуществленным с помощью иммобилизованных ферментов на промышленном уровне. Этот процесс был реализован в Японии на предприятии, принадлежащем компании «Танабе Сейяку» в 1969 г. В течение 15 предшествующих лет данный процесс проводился с применением растворимого фермента аминоацилазы, но он был недостаточно экономичен. После перехода на иммобилизованную аминоацилазу экономическая эффективность процесса возросла в полтора раза, и в настоящее время компания осуществляет на промышленном уровне производство пяти L-аминокислот, из них четыре незаменимые (метионин, валин, фенилаланин, триптофан).

В качестве исходного вещества используются ацилированные D, L-аминокислоты, полученные с помощью обычного химического синтеза. Фермент аминоацилаза гидролизует один ацил-L-изомер, отщепляя от него объемную ацильную группу, и тем самым резко увеличивая растворимость образующейся L-аминокислоты по сравнению с присутствующим в реакционной системе ацил-Д-изомером. После этого вещества легко отделяются друг от друга путем известных физико-химических методов. Так выделяется чистая L-аминокислота.

Остающаяся ацил-О-аминокислота при нагревании рацеми-зуется, т. е. переходит опять в смесь ацилированных D, L-аминокислот, и процесс повторяют сначала. Таким образом, в итоге единственным продуктом является L-аминокислота. Оказалось, что для аминоацилазы не имеет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно лишь строение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфичность. В результате этого одна и та же реакционная колонна с иммобилизованной амино-ацилазой может быть применена в производстве самых различных L-аминокислот.

Иммобилизованный фермент легко готовить, так как он легко адсорбируется на специальной смоле, которую затем помещают в реакционную колонну. Время полуинактивации иммобилизованного фермента в промышленных условиях составляет 65 сут. Когда активность катализатора падает ниже нормы, в колонну добавляют раствор свежего фермента (раз в несколько месяцев), который опять адсорбируется на носителе. Устойчивость полимерного носителя высокая; так, на предприятии японской компании «Танабе Сейяку» он используется более 8 лет в одной и той же колонне без замены (I. Chibata, 1978).

3. Получение L-аспарагиновой кислоты

Аспарагиновая кислота не принадлежит к числу незаменимых, но производится в мире многими тысячами тонн. Она находит широкое применение в пищевой промышленности для придания (в сочетании с другой аминокислотой — глицином) кондитерским изделиям и напиткам различных оттенков кислого или сладкого вкуса. Аспарагиновую кислоту можно получать с помощью фермента аспартазы. В качестве исходных веществ для ферментативного синтеза используются фумаровая кислота и аммиак — крупнотоннажные продукты органического и неорганического синтеза. Протекающая реакция одностадийна — в присутствии фермента молекула аммиака присоединяется к фумаровой кислоте по месту двойной связи с образованием оптически активной L-аспарагиновой кислоты. В этом процессе впервые в технологической практике были применены иммобилизованные клетки микроорганизма, содержащие фермент в его естественной микробной оболочке. Этот процесс был разработан японской фирмой «Танабе Сейяку» в 1973 г.

Плотный гель с иммобилизованными в нем микробными клетками, содержащими аспартазу, формуют в кубики размерами 2—3 мм, набивают ими колонну объемом 1 м³ и пропускают через нее раствор фумарата аммония. На выходе из колонны L-аспарагиновую кислоту кристаллизуют, центрифугируют и промывают холодной водой. Процесс практически полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Масштабы производства на фирме «Танабе Сейяку»—1700 кг чистой L-аспарагиновой кислоты в сутки на реактор объемом 1 м³ .

4. Получение L-яблочной кислоты

Яблочная кислота находит спрос в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания и фармацевтических препаратах. Химическим путем (гидролизом ангидрида яблочной кислоты) производят только рацемическую смесь оптических изомеров яблочной кислоты, в то время как оптически активный L-изомер, получаемый микробиологическим способом, пока слишком дорог для промышленного производства.

L-яблочную кислоту получают ферментативным путем, так же как и L-аспарагиновую кислоту, из фумаровой кислоты. Здесь в качестве катализатора используют иммобилизованные в гель клетки, содержащие фермент фумаразу. В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи молекулы фумаровой кислоты. В остальном реакция протекает так, как и в случае L-аспарагиновой кислоты. В обычных (интактных) клетках время полуинактивации фумаразы составляет 6 сут, в иммобилизованных в полиакриламидный гель — 55 сут, а в иммобилизованных в гель на основе каррагинана — полисахарида из морских водорослей—160 сут

5. Получение безлактозного молока

Лактоза, или молочный сахар, содержится в достаточно больших количествах в молоке и молочной сыворотке. Этот сахар характеризуется малой сладостью и низкой растворимостью, в его присутствии происходит кристаллизация мороженого и других молочных изделий и продуктов, что является причиной неприятных вкусовых ощущений.

Молекулы лактозы распадаются на глюкозу и галактозу при гидролизе под действием лактазы, или β-галактозидазы. Молоко после такой обработки приобретает новые диетические качества, поскольку определенная часть населения не может употреблять молоко из-за наличия в нем лактозы. Это свойство организма получило название лактазной недостаточности.

Первый промышленный процесс получения безлактозного молока с использованием иммобилизованной лактазы был осуществлен итальянской фирмой «Сентрале дель Латте» в Милане. Получаемое диетическое молоко несколько слаще по сравнению с обычным, поскольку глюкоза более сладкая, чем лактоза, однако это не мешает его употреблению. Стабильность иммобилизованного фермента достаточно высока, и после 50 сут работы он сохраняет 80% первоначальной активности.

6. Получение сахаров из молочной сыворотки

Молочная сыворотка содержит в своем составе большое количество лактозы — около 5% в жидкой и 75% в высушенной сыворотке. Ферментативный гидролиз лактозы в сыворотке открывает новые возможности получения сахаристых веществ из нетрадиционного сырья, вносит определенный вклад в решение кормовой проблемы и в проблему охраны окружающей среды, поскольку сыворотка большей частью не утилизуется. Первый промышленный процесс гидролиза лактозы в молочной сыворотке с помощью иммобилизованной лактазы был реализован в 1980 г. совместно английской, французской и американской компаниями одновременно в Англии и Франции.

Перед введением в колонный реактор с иммобилизованным ферментом сыворотку пастеризуют, подвергают ультрафильтрации и пропускают через ионообменник, чем добиваются ее деминерализации. Мощность установки составляет около 1000 л при степени конверсии лактозы 80%. Установка полностью автоматизирована. Получаемые при этом сахара (глюкоза и галактоза) по сладости в полтора раза превышают сладость пищевого сахара в расчете на одинаковые экономические затраты.

По данным итальянской компании «Снам Проджетти», продолжительность работы иммобилизованного фермента в реакторе с молочной сывороткой существенно зависит от качества сыворотки и время полуинактивации фермента изменяется от 60 (при обработке депротеинизованной и деминерализованной сыворотки) до 8 сут (для необработанной кислой сыворотки), о связи с этим в промышленных условиях ежедневно по полчаса производят очистку колонны (с иммобилизованной лактазой) Разбавленной уксусной кислотой. Время работы подобной системы в лабораторных условиях составляет около двух лет

7. Получение 6-аминопенициллановой кислоты

Проведение химического деацилирования бензилпенициллина, обычно являющегося исходным сырьем для получения 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК), представляет трудную задачу из-за наличия в его молекуле чрезвычайно лабильного β-лактамного кольца. Поэтому в промышленности до недавнего времени обрабатывали бензилпенициллин бактериальной массой Е. coli , содержащей фермент пенициллинамидазу, который специфически и без побочных реакций расщеплял именно ту амидную связь, которая необходима для образования 6-АПК.

В результате применения иммобилизованных бактериальных клеток, содержащих пенициллинамидазу, а затем и самой иммобилизованной пенициллинамидазы, удалось значительно повысить продуктивность и экономичность промышленного процесса получения 6-АПК. В 1975 г. процесс получения 6-АПК с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы был внедрен в нашей стране. В настоящее время значительная доля 6-АПК в Италии и вся 6-АПК, выпускаемая в РФ, производится с помощью иммобилизованных ферментов.

Итальянская компания использует иммобилизованную пенициллинамидазу, полученную включением фермента в волокна триацетата целлюлозы. При этом эмульсию, образованную при смешивании раствора фермента с раствором триацетата целлюлозы в метиленхлориде, подвергают экструзии в нити. Волокна закрепляют вдоль термостатируемой колонны и пропускают через нее 6%-ный раствор бензилпенициллина до степени конверсии последнего 97% или выше. По данным итальянских ученых, общий выход 6-АПК составляет 85% с чистотой 96% и выше.

По технологии компании «Танабе Сейяку», использующей бактериальные клетки, иммобилизованные в полиакриламидный гель (с временем полуинактивации 42 сут при 30°С или 17 сут при 40°С), общий выход 6-АПК составляет около 80%. На советском производстве употребляют пенициллинамидазу, иммобилизованную в полиакриламидном геле, модифицированном глутаровым альдегидом.

ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПРЕВРАЩЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В САХАРА

Целлюлоза построена из звеньев D-глюкозы, которые соединены 1-4-β-глюкозидными связями (по типу «голова к хвосту») в длинные, вплоть до тысяч глюкозных единиц, цепи, уложенные в плотную упаковку со своеобразной кристаллической структурой. Прочность упаковки обусловлена главным образом тем, что цепи поперечно «прошиты» водородными связями, которые по отдельности относительно слабы, но в совокупности с тысячами других образуют, можно сказать, монолитный блок. В результате целлюлоза не только нерастворима в воде, но ее кристаллические участки непроницаемы практически для любых химических агентов, в том числе и для сильных кислот. Но там, где плотная упаковка глюкозных цепей нарушена (на поверхности целлюлозы, в местах поворота цепей, а также после специальной обработки целлюлозы, например с помощью интенсивного измельчения), образуются «аморфные области», куда могут проникать и растворители, и механические агенты. Это свойство используется при промышленном получении так называемой микрокристаллической целлюлозы, которая широко применяется для специальных химических целей. Природную целлюлозу обрабатывают кислотой, аморфные участки легко расщепляются и уходят в раствор, оставляя мелкие микрокристаллиты, чрезвычайно стойкие к химическим реагентам.

Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты

В природе имеются так называемые целлюлолитические микроорганизмы, содержащие набор ферментов — целлюлаз, способных к расщеплению не только аморфной, но и кристаллической целлюлозы до глюкозы. Попадая на поверхность целлюлозосодержащего материала и прикрепляясь к ней, микроорганизм выделяет целлюлазы, под действием которых субстрат целлюлаза в непосредственной близости от грибка-паразита расщепляется до конечного продукта — глюкозы. Микроорганизм поглощает глюкозу в качестве основного продукта питания, размножается, растет, захватывая все большие участки поверхности, выбрасывает все новые и новые порции ферментов, пока не истощится доступная целлюлоза.

Однако эти процессы протекают весьма медленно. Для того чтобы пень в лесу полностью сгнил, нужны годы. Если же отделить от микроорганизма ферменты целлюлазы, сконцентрировать их и добавить к целлюлозе, процесс значительно ускорится. При этом образующаяся глюкоза не потребляется грибками, а накапливается в реакционной смеси. Кроме того, если в качестве субстрата использовать не чистую целлюлозу, а целлюлозосодержащие отходы промышленности или сельского хозяйства, то можно решить и еще одну важную проблему — утилизацию отходов. Полученная глюкоза в зависимости от ее чистоты и экономической эффективности процесса может найти применение в медицине, пищевой промышленности, тонкой химической технологии или технической микробиологии. Глюкозу, как известно, можно сбраживать в этанол и затем употреблять как «жидкое топливо» в качестве заменителя части нефтепродуктов. Наконец, дегидратация энатола дает этилен — основу современной «большой химии».

Целлюлоза на нашей планете — самое «крупнотоннажное» из всех возобновляемых видов сырья. Ежегодный естественный прирост целлюлозы составляет около 100 млрд. т. Использование человеком части этого сырья приводит к накоплению значительного количества целлюлозосодержащих отходов. Если даже малую долю этих отходов превращать ферментативным путем в полезные продукты, это даст ощутимый (и возобновляемый!) источник пищевых углеводов и заменителей нефти. Поэтому данной проблемой в последние годы столь упорно занимаются и исследователи, и технологи всего мира.

Выводы

Благодаря высокой скорости роста, сравнительно простому строению клеток и несложной структуре генетического аппарата бактерии стали одним из наиболее удобных объектов в биохимических исследованиях низших организмов. Многие бактериальные культуры хорошо известны как активные продуценты внеклеточных гидролаз и применяются при промышленном получении ферментов. Практическое использование бактериальных ферментов в значительной степени способствовало интенсификации исследований по изучению условий их продуцирования, а также локализации.

Список литературы

Безбородов А.М., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмов. – М.: 1984 г.
Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗов в 8 кн./ под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты. – М.: 1987 г.
Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗов в 8 кн./ под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 8: Инженерная энзимология. – М.: 1987 г.
В.М. Богданов, Р.С. Баширова и др. Техническая микробиология пищевых продуктов. – М.: 1968 г.
С. Прескотт, С. Дэнс Техническая микробиология. – М.: 1952 г.

содержание .. 366 367 368 ..