МУЗ «Первая городская клиническая больница скорой медицинской помощи»
Урогенитальный трихомониаз – широко распространенное инфекционное воспалительное заболевание, передаваемое преимущественно половым путем, вызывается простейшими Trichomonas vaginalis.
Трихомонады являются жгутиковыми эукариотами и относятся к простейшим из класса Flagellata, семейства Trichomonadida, рода Trichomonas. В человеческом организме паразитируют 3 вида трихомонад: Trichomonas intestinalis - кишечная трихомонада, Trichomonas elongata (tenax, buccalis) - ротовая трихомонада и Trichomonas vaginalis - влагалищная трихомонада. Только Tr. vaginalis поражает урогенитальный тракт и является патогенной для человека, вызывая воспалительные заболевания: уретрит, простатит, эндоцервицит, вагинит, бартолинит и т.д.
Влагалищные трихомонады являются одноклеточными простейшими. Форма их вариабельна, чаще грушевидная - в нативных препаратах (висячая капля), но наряду с этим могут наблюдаться овальные, шарообразные, несколько удлиненные - веретенообразной формы. Длина тела влагалищной трихомонады колеблется от 5 до 30 мкм, ширина – 5 - 8 мкм. Она покрыта оболочкой - пелликулой. Тело влагалищной трихомонады состоит из цитоплазмы, ядра, парабазального тела, блефаропласта, ризопласта, аксостиля, ундулирующей мембраны, краевой и парабазальной фибриллы и жгутиков. Цитоплазма состоит из тонкозернистой массы. Ядро продолговато-овальной формы, расположено в передней трети тела. Впереди ядра, на переднем конце тела трихомонады, находится блефоропласт, от которого берут начало направляющиеся вперед 4 свободных жгутика. Они выполняют роль органоидов движения и принимают участие в захватывании пищи. Обнаружение жгутиков при просмотре нативных препаратов служит дифференциально-диагностическим признаком влагалищных трихомонад от других элементов материала (лейкоциты, эпителиальные клетки). Степень подвижности жгутиков отражает биологическую активность возбудителя. В окрашенных препаратах жгутики трудно различимы, что обусловлено их хрупкостью и повреждением при фиксации и окраске препарата.
Влагалищные трихомонады размножаются делением, как простым продольным делением на две части, так и множественным. Полный цикл деления занимает от 0.5 до 1.5 - 3 часов. Перед делением движение трихомонады замедляется, разделяется блефаробласт и жгутики, число которых удваивается. Далее делится ядро, дочерние ядра расходятся к противоположным полюсам. После перешнуровки цитоплазмы образуются две новые особи.
Трихомонады являются факультативными анаэробами. Оптимум роста наблюдается при +37°С. Они легко культивируются в питательных средах в присутствии или отсутствии других микроорганизмов.
Встречаются штаммы влагалищных трихомонад, которые авирулентны для их носителей и не вызывают у них видимых клинических реакций со стороны слизистых мочеполовых органов. Однако, при передаче их в процессе полового акта партнеру с переменой условий обитания они становятся патогенными и вызывают развитие воспалительного процесса в слизистой мочеполовых органов. Возможен переход асимптомной формы трихомониаза в манифестную при нарушении равновесия между макроорганизмом и влагалищной трихомонадой вследствие изменения реактивности организма, происходящим при инфекционных заболеваниях, переохлаждении, переутомлении, изменении гормонального статуса, при действии нервно-психических травм и других стрессорных факторов, приводящих к снижению как местной, так и общей иммуннорезистентности.
Инвазия влагалищной трихомонады способствует переходу постоянных сапрофитов уретры и влагалища у здоровых лиц в вирулентное состояние, что ведет к усилению токсигенного воздействия на ткани органов урогенитального тракта. В результате этого развивается смешанный трихомонадно-бактериальный воспалительный процесс, в котором первичным этиологическим агентом является Tr. vaginalis.
Вагинальные трихомонады способны фагоцитировать бактерии и другие частицы, которые затем перевариваются. Однако возможна персистенция бактерий (гонококков) внутри трихомонады, что способствует их длительному существованию в организме в скрытом, недоступном для антибактериальной терапии состоянии.
Влагалищные трихомонады могут сохранять жизнеспособность в неразведенных выделениях или в культурах, разведенных физиологическим раствором, или в других солевых растворах в течение нескольких часов, однако они плохо переносят гипотонические растворы, а высушивание и температура свыше 45°С убивает их мгновенно.
Для обнаружения Tr. vaginalis используют следующие основные методы:
1. Микроскопия нативных препаратов;
2. Микроскопия окрашенных препаратов;
3. Культуральный метод;
4. Иммунологический метод.
При микроскопии нативных препаратов, возбудителя обнаруживают по его специфическому движению среди клеточных элементов и микроорганизмов в препарате, приготовленном непосредственно перед исследованием. Просмотр влагалищной трихомонады в нативных препаратах проводят методом раздавленной капли - “капли-суспензии” и реже методом “висячей” капли.
При приготовлении препарата “капли-суспензии” на сухое, обезжиренное и предварительно прогретое до 37°С предметное стекло наносят каплю теплого физиологического раствора хлорида натрия и смешивают в нем исследуемое отделяемое из очага заболевания (теплый физиологический раствор активирует влагалищную трихомонаду и увеличивает ее подвижность). Взвесь накрывают покровным стеклом, избегая образования воздушных пузырьков в препарате. Избыток жидкости, вышедшей за границы покровного стекла удаляют фильтровальной бумагой. Смывы со слизистой уретры, влагалища и негустые осадки центрифугатов, полученных на физиологическом растворе, а также культуры трихомонад, выделенные на жидких средах исследуются в нативных препаратах без дополнительного разведения.
При приготовлении препарата “висячая капля” на середину покровного стекла, края которого предварительно смазываются вазелином, наносится теплый (37 - 38°С) физиологический раствор, к которому добавляется исследуемый материал, осторожно перемешивается. Покровное стекло переворачивают и накладывают каплей вниз над лункой специального предметного стекла для просмотра “висячей капли”. Капля должна свободно свисать в углублении предметного стекла, не соприкасаясь с его краями и дном.
Ввиду того, что при длительном пребывании препаратов при комнатной температуре трихомонады теряют подвижность, исследование следует проводить возможно быстрее после получения материала (в течение не более 1 часа).
Исследование нативных препаратов проводят под микроскопом с естественным или искусственным освещением немедленно после его приготовления при общем увеличении 280 - 400 раз (объектив 40, окуляр 7 или 10). Влагалищная трихомонада определяется по грушевидной, округлой или овальной форме тела по размерам близким к лейкоцитам. Она имеет характерные толчкообразные движения ундулирующей мембраны и жгутиков, которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с темнопольным или фазовоконтрастным конденсором. Трихомонады совершают активные движения поступательного и вращательного характера.
При исследовании нативных препаратов влагалищные трихомонады трудно отличимы от жгутиковых семейства бодонидов, которые могут быть занесены в препарат из воды, загрязненной посуды и т.д. В отличие от трихомонад, бодониды имеют 2 жгутика и быстро двигаются по прямой. К ошибкам может привести наличие в препарате подвижных бактерий, которые, прикрепляясь к лейкоцитам, создают впечатление большого количества подвижных трихомонад.
Метод нативных препаратов высоко специфичен. Однако обнаружить в них влагалищные трихомонады можно лишь при наличии жизнеспособного возбудителя с активной подвижностью, что достигается технически правильным взятием материала и своевременным его просмотром. Чувствительность метода снижена при бессимптомном течении заболевания. Измененные формы трихомонад, неподвижные особи редко выявляются данным методом.
Для выявления влагалищных трихомонад мазки с материалом после фиксации возможно окрашивать различными способами, как простыми - окрашивание одним красителем, так и сложными - окрашивание несколькими красителями. После окрашивания мазки микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа и общим увеличением 500 - 1000 раз. Материал берут из очагов поражения при помощи стерильного зонда и наносят на чистое обезжиренное предметное стекло равномерным тонким слоем. После высушивания на воздухе, препараты фиксируют в течение 3 - 5 минут в метиловом спирте, или этиловом 96% спирте, или в смеси Никифорова. Наиболее часто используют следующие способы окраски:
1. Окрашивание по Романовскому-Гимзе. Фиксированный препарат помещают в рабочий раствор краски (исходный раствор краски разведенный дистиллированной водой в соотношении 1:10) на 25 - 60 минут, затем его промывают водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы. Ядра трихомонад окрашиваются в фиолетовый или фиолетово-рубиновый цвет, протоплазма - в голубой, блефаропласт, жгутики, аксостиль и хроматиновые зерна протоплазмы окрашиваются в розовый или красный цвет;
2. Окрашивание 1% водным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр). На препарат наносят 1% раствор метиленового синего на 1 минуту, затем тщательно смывают оставшийся краситель под струей холодной воды, высушивают и микроскопируют. Препарат синего цвета. Бактериальная флора прокрашивается в синий цвет разной интенсивности. Влагалищные трихомонады различной формы расположены в слизи, между клеточными элементами - четко просматривается оболочка, ядро расположено эксцентрично, интенсивно окрашено в синий цвет, протоплазма нежная, сетчатая, светло-синяя, вакуоли бесцветны.
3. Окрашивание 0.5% раствором бриллиантового зеленого (0.5 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды, фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр). На препарат наносят 0.5% водный раствор бриллиантового зеленого на 1 минуту, затем тщательно смывают краситель под струей холодной водопроводной воды, высушивают и микроскопируют. Препарат зеленого цвета - ядра клеток окрашены в зеленый цвет, протоплазма - в светло-синий. Слизь зеленого цвета. Бактериальная флора окрашивается в зеленый цвет разной интенсивности. Влагалищные трихомонады различают разной формы, они расположены между клеточными элементами в слизи, четко просматривается оболочка, ядро интенсивно окрашено в зеленый цвет, расположено эксцентрично, протоплазма сетчатая, светло-зеленого цвета, вакуоли бесцветны.
4. Окрашивание по модифицированному способу Грама. Метод основан на свойстве влагалищных трихомонад и других грамотрицательных микроорганизмов при обесцвечивании их определенное время в этиловом спирте, отдавать основной фиолетовый краситель и докрашиваться, в дальнейшем, дополнительным оранжево-красным.
Реактивы:
- 1% водный раствор кристаллвиолета (1 г кристаллвиолета растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды, раствор фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр);
- водный люголевский раствор (2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды, в полученном растворе растворяют 1 г чистого йода, фильтруют через бумажный фильтр;
- 96% этиловый спирт;
- 1% водный раствор нейтрального красного (1 г нейтрального красного растворяют в 100 мл дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр.
Препарат покрывают полоской фильтровальной бумаги и заливают ее 1% раствором кристаллвиолета на 1 минуту. Следят, чтобы между фильтровальной бумагой и стеклом не было пузырьков воздуха, их удаляют, придавливая полоску смоченной кристаллвиолетом фильтровальной бумаги стеклянной палочкой. Через 1 минуту бумагу снимают, препарат промывают водопроводной водой и заливают раствором Люголя, который выдерживают в течение нескольких секунд до почернения мазка. Затем остаток люголевского раствора смывают и приступают к обесцвечиванию препарата в 96% этиловом спирте. Обесцвечивание проводят под контролем глаза, поочередно погружая и вынимая препарат из спирта, находящегося в стаканчике. Обесцвечивают препарат до тех пор, пока с его тонких участков перестанут стекать фиолетовые струйки красителя и они станут бледно-серого цвета. Препарат быстро промывают под струей водопроводной воды, а затем докрашивают в течение 3 минут 1% водным раствором нейтрального красного. Препарат тщательно промывают, пока струя воды, стекающая с него, не станет прозрачной, высушивают и микроскопируют. При правильной окраске препарат оранжево-красного цвета на тонких участках, лилово-фиолетового на толстых. Ядра клеточных элементов (лейкоцитов, эпителиальных клеток) частично удерживают основную фиолетовую окраску, т.е. в центре они должны быть окрашены в фиолетовый цвет, по периферии в оранжево-красный. Высокое качество окраски обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания препарата.
Влагалищные трихомонады окрашиваются бледно - оболочка в виде тонкой полоски окружает сетчатую протоплазму оранжево-красного цвета, ядро сиреневого или фиолетового цвета, жгутики и ундулирующая мембрана не просматривается. Положительный ответ нужно давать при обнаружении только типичных форм влагалищных трихомонад. При обнаружении измененных (округлые, нетипично-окрашенные и др.), но похожих на влагалищных трихомонад простейших, надо исследовать повторно взятый материал или сделать посев на питательные среды.
Микроскопия окрашенных препаратов является простым, дешевым и доступным методом, не требующим немедленного проведения исследования и специального оборудования. Однако он имеет низкую чувствительность и специфичность.
Культуральный метод наиболее чувствительный и специфичный. Влагалищные трихомонады дают хороший рост на искусственных питательных средах при условии соблюдения правил забора материала для исследования и его культивирования. Питательные среды должны содержать антибиотики для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Влагалищные трихомонады - факультативные анаэробы. Оптимум их роста в слабокислой среде при среднем рН 5.8 - 6.3 и +37°С, поэтому перед посевом культуральную среду следует прогреть, если она хранилась в холодильнике. Следует избегать перегрева культуры выше 37-38°С, т.к. повышение температуры влагалищные трихомонады переносят хуже, чем понижение. Материал для исследования из очагов поражения следует брать стерильным зондом или бактериальной петлей. Материалом для исследования могут служить центрифугаты смывов стерильным физиологическим раствором, которые вносят в культуральную среду стерильной пастеровской пипеткой. Стерильной пастеровской пипеткой следует пользоваться при пересеве выделенных штаммов.
При выращивании на жидких питательных средах влагалищные трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой берут материал для исследования в нативном препарате. Микроскопическое исследование культур и идентификацию следует производить на 3 - 5-й день, при отрицательных результатах на 7 - 9-й и на 11 - 17-й день после посева, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от величины посевной зоны. Из придонного роста готовят нативный препарат одним из описанных выше способов и микроскопируют с объективом 40 или 90, окуляр 7 или 10. Влагалищные трихомонады в поле зрения могут быть одиночными или большими скоплениями, активно движущиеся, при этом хорошо просматривается движение жгутиков и ундулирующей мембраны. Возможно определять влагалищные трихомонады в культуре методом РНИФ (реакция непрямой иммунофлюоресценции).
Культуральный метод длительный по времени, требует дорогостоящих сред.
Иммунологический метод позволяет определить специфический поверхностный антиген влагалищной трихомонады реакцией непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) посредством набора “ТрихоСлайд”. Материалом для исследования служат мазки-отпечатки из очагов поражения, которые наносят на чистое обезжиренное предметное деколированное (со специальной лункой) стекло стерильными одноразовыми зондами, имеющими ватный тампон с повышенными сорбционными свойствами. При нанесении материала тампоном многократно касаются поверхности предметного стекла. После высыхания на воздухе препарат фиксируют 5 минут 96% этиловым спиртом или ацетоном (наносят на препарат несколько капель безводного ацетона до полного его испарения). Фиксированные препараты лучше не хранить, т.к. при хранении влагалищные трихомонады разрушаются, что может затруднить постановку правильного диагноза. После фиксации проводят “окрашивание” препарата, которое имеет два этапа. На первом этапе на препарат наносят 30 мкл реагента №1- специфические противотрихомонадные АТ - и инкубируют его во влажной камере (избегать подсыхания реактива) при комнатной температуре или 37°С 15 минут. Затем препарат промывают дистиллированной водой 30 секунд, высушивают на воздухе и наносят 30 мкл реактива №2 - антитела к противотрихомонадным АТ, меченые ФИТЦ - инкубируют 15 минут во влажной камере при комнатной температуре или 37°С. После этого препарат промывают 30 секунд дистиллированной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют в люминисцентном микроскопе с использованием масляной или водной иммерсионной системы. Препараты к микроскопии готовят также, как и при диагностике хламидиоза методом РИФ.
Трихомонады выявляются в виде полиморфных мембраноограниченных структур, имеющих ярко-зеленое свечение. У подвижных форм могут прокрашиваться жгутики. Неспецифическая бактериальная флора окрашивается в оранжевый цвет, клетки эпителия, лейкоциты, сперматозоиды окрашиваются в оранжевый и красно-бурый цвета. Допускается неспецифическое диффузное слабо-зеленое свечение цитоплазмы эпителиальных клеток, слизи и посторонней микрофлоры. Результат считают отрицательным, если в мазке отсутствует специфическое свечение при обязательном наличии не менее 10 клеточных элементов.
Метод РНИФ обладает высокой чувствительностью и специфичностью, сравнимой с культуральным методом, позволяет выявлять нежизнеспособные формы возбудителя, не определяемые культуральным методом. В отличие от нативных препаратов, он позволяет выявить атипичные и неподвижные формы влагалищных трихомонад. Это повышает его диагностическую значимость. Метод РНИФ сравнительно дешев, прост в выполнении, не требует специального оборудования, позволяет визуально контролировать качество взятия материала и получить ответ в течение 40 - 60 минут. Все это делает его методом выбора для диагностики урогенитального трихомониаза.
Вывод
Окончательное установление диагноза заболевания возможно при обнаружении возбудителя или наличия антител в отделяемом из очагов поражения или в крови пациента методами микроскопического, бактериологического, а также иммунологического (серологического) исследований.
В целях совершенствования контроля за ЗППП рекомендовано создать в качестве структурных подразделений центральные лаборатории, сосредоточив в них все виды исследований для микроскопической, вирусологической, бактериологической, серологической иммунологической диагностики инфекций.
Лабораторные исследования в централизованной лаборатории проводятся всеми имеющимися методами:
1. Для диагностики сифилиса: исследование в темном поле микроскопа нативного препарата отделяемого или пунктата лимфатических узлов; серологического исследования крови и ликвора в РСК, реакции Кана, микрореакции прицепитации с кардиолипиновым антигеном, реакции иммобилизации бледных трепонем, реакции иммунофлуоресценции в модификациях, реакции иммунного прилипания, иммуноферментным методом в модификациях, реакции пассивной гемагглютинации.
2. Для диагностики гонореи исследования препаратов, окрашенных метиленовым синим (бриллиантовым зеленым) и по способу Грама, культуральные исследования, определение беталактамазной активности чистых культур гонококка, определение чувствительности гонококков к антибиотикам или другим лекарственным препаратам, постановка реакции Борде‑Жангу.
3. Для диагностики трихомониаза исследование нативных препаратов и окрашенных метиленовым синим и по способу Грама, а также методом выращивания на питательных средах.
4. Для диагностики хламидиоза исследование препаратов, окрашенных по Романовскому-Гимзе, ПИФ, с помощью моноклональных антител, ИФА, культуральные исследования.
Список использованных источников
1. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. / Г.И. Назаренко [Кишкун А.А.]. – М.: Медицина, 2006. – 544с.
2. Ю.К.Скрипкин, Г.Я.Шарапова, Г.Д.Селисский. Инфекции, передаваемые половым путем. М. – Медицина, 1997 г. – 208 с.
3. М.С. Покровская. Лабораторная диагностика инфекций. ЗАО «Лаборатория генно-инженерных систем «ЛАГИС» . – М. – 1999 г.
4. Башмакова М.А., Бочкарев Е.Г., Говорун В.М., Савичева А.М., Парфенова Т.М. // Хламидиоз. Современные подходы к диагностике и лечению.- М., 1999.-61 с.
5. Cавичева А.М., Башмакова М.А., Шипицина Е.В., Шалепо К.В., Мартикайнен З.М., Зациорская С.Л., Рыбина Е.В., Новикова Л.Н., Тараскина А.Е. Клиническая оценка генитальных инфекций // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. Материалы 3-ой Всероссийской научно-практической конференции.- М.- 2000.- с.79-82 .
6. Е.Г. Бочкарев. Лабораторная диагностика хламидийной инфекции. М. – 2004 г.
7. Р.А. Андреасян, М.В. Яцуха. Оптимизация качества диагностики заболеваний, передаваемых половым путем, функциональные обязанности и нормирование труда персонала лабораторий, занимающихся их диагностикой. // Вестник дерматологии и венерологии. – М. – 2001 г.
8. Приказ № 286 от 7 декабря 1993 г. "О совершенствовании контроля за заболеваниями, передаваемыми половым путём".
содержание ..
236
237
238 ..
|