Том 2. Справочник по кожным болезням - часть 129

 

  Главная      Учебники - Разные     Том 2. Справочник по кожным болезням

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  127  128  129  130   ..

 

 

Том 2. Справочник по кожным болезням - часть 129

 

 

ориентируясь на характер реакции в контролях. Поскольку микрореакция носит  отборочный характер, при

получении положительных результатов сыворотку крови исследуют в КСР, а при необходимости  -  в РИБТ и

РИФ.

Реакция с липоидным антигеном (VDRL).

Следует   напомнить,   что   уже   антиген,   первоначально   использованный   Вассерманом   в   реакции   связывания

комплемента,   содержал,   как   было   показано   в   дальнейшем,   не   антиген   бледной   трепо-немы,   алипоидное

вещество  -  кардиолипин. Иммуноглобулины, вступающие в реакцию с липоидным антигеном, впоследствии

были названы реагинами. Они являются аутоантителами к веществу митохондриальных мембран.

Одним   из   лучших   стандартных   методов,   в   которых   используются   липоидные   антигены,   является

рекомендуемая ВОЗ реакция VDRL. Название этой реакции происходит от заглавных букв учреждения, где она

была разработана,  -  Venereal  Diseases  Research  Laboratory  в Атланте (штат Джорджия, США). Антиген для

реакции  VDRL  включает  0,03   %  кардиолипина,  0,9   %  холестерина   и  0,21   %  лецитина.   Его   добавляют   к

инактивированной сыворотке больного, помещаемой на предметное стекло, которое затем вращают в течение

4-5 мин при комнатной температуре и сразу регистрируют результат: наличие в сыворотке реагинов вызывает

макроскопически видимую флокуляцию. Реактоспособность сыворотки в реакции VDRL выявляется примерно

через  4  нед после заражения сифилисом. Количественную оценку циркулирующих антител получают путем

разведения   сыворотки   перед   постановкой   реакции   в   геометрической   прогрессии:  1:2,   1:4,   1:8,   1:16.

Ложноположительные   результаты   (биологическая   неспецифическая   реактивность)   могут   обусловливаться

аутоантителами при заболеваниях, протекающих с нарушениями иммунитета (красная волчанка, ревматизм,

болезнь Шегрена, дисгаммаглобулинемия), а также при заболеваниях, связанных с усиленным разрушением

клеточных   ядер   (малярия,   пситтакоз,   вирусная   пневмония,   карцинома).   Главными   достоинствами   реакции

VDRL  являются низкая стоимость, легкость постановки, быстрое получение результатов с довольно высокой

чувствительностью и специфичностью, хотя и меньшей, чем в реакции с трепонем-ным антигеном.

Реакции иммунофлюоресценции.

Все   большее   значение   для   серологических   исследований,   особенно   при   скрытом   сифилисе   и   для

распознавания   неспецифических   результатов   стандартных   серологических   реакций,   приобретают   спе-

цифические серологические реакции. К ним относятся РИФ и РИБТ.

Принцип   РИФ   основан   на   выявлении   флюоресцирующих   антител,   так   как   меченные   флюорохромом

антитела   не   теряют   способности   соединяться   с   соответствующим   антигеном   и   тем   самым   обусловливают

свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах, источником которых является ртутно-кварцевая лампа.

РИФ в серодиагностике сифилиса начала применяться в нашей стране с конца 60-х годов (Беднова В. Н.,  1977).

Ее   отличительной   чертой,   по   сравнению   со   стандартными   серореакциями,   является   более   высокая

чувствительность   (поэтому   она   бывает   положительной   у   ряда   больных   уже   в   первичном   серонегативном

периоде сифилиса) при сохранении высокой специфичности. Однако, по мнению ряда авторов, РИФ уступает

по специфичности РИБТ, хотя по технике постановки она значительно проще.

Реакция ставится в нескольких модификациях: РИФ-10, РИФ-200 и РИФ-абс. Считается, что РИФ-10 более

чувствительна, а РИФ-200 и РИФ-абс - более специфичны. Реакция ставится непрямым методом в 2 фазы. В

первой фазе реакции на антиген наносится испытуемая сыворотка крови. Если в ней имеются соответствующие

антитела, то образуется комплекс антиген - антитело. Для выявления образовавшегося комплекса проводится

вторая   фаза   реакции,   при   которой   его   обрабатывают   меченной   флюорохромом   иммунной   кроличьей

сывороткой (против сывороточных глобулинов человека)

Полученный   во   второй   фазе   комплекс   антиген  -  антитело   определяется   с   помощью   люминесцентной

микроскопии. Если  свечения антигена нет, то это указывает  на отсутствие в испытуемой  сыворотке крови

соответствующих антигену антител.

Наиболее   ценной   модификацией   реакции   иммунофлюоресценции   является   РИФ-200,   основным

назначением   которой   считается   не   ранняя   серодиагностика   сифилиса,   а   распознавание   неспецифических

результатов КСР и серодиагностика других форм сифилитической инфекции, в том числе и скрытого сифилиса.

При установлении излеченности сифилиса решающим является только отрицательный результат РИФ-200. Как

и всякая другая серологическая реакция, РИФ-200 не обладает абсолютной специфичностью, поэтому вопрос о

наличии   или   отсутствии   заболевания   должен   решаться   на   основании   совокупности   клинических,

серологических и других данных.

Методика   постановки   РИФ-200.   Кровь   берут   из   вены   в   чистую   и   сухую   пробирку   в   объеме  5  мл   и

обрабатывают   как   для   реакции   Вассермана.   Инактивируют   сыворотку   однократно   в   течение  30  мин   при

температуре 56°С. Хранят при температуре +4 °С или -20°С. Во время лечения больных пенициллином иногда

могут быть получены ложноотрицательные результаты реакции, поэтому в этих условиях РИФ проводить не

следует.

Антиген. В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-

суточного орхита кролика. Получение и хранение антигена требует соблюдения условий стерильности, так как

с одним и тем же антигеном реакция ставится в течение длительного времени. (Антиген может быть получен в

ампулах   из   ближайшей   лаборатории,  где   ставят   РИФ).  Перед  каждой   постановкой  реакции  взвесь   хорошо

перемешивают и исследуют в темном поле зрения для определения ее густоты. Для РИФ необходимо иметь 40-

60 трепонем в темном поле зрения, и, если взвесь более густая, то ее разводят изотоническим раствором натрия

хлорида, (рН 7,2). Разводить надо только то количество антигена, которое необходимо для постановки реакции.

Антивидовая  флюоресцирующая  сыворотка.  В  реакции  необходима  меченная  флюорохромом  сыворотка

крови   животных,   иммунизированных   сывороточным   белком   человека.   Лиофильно   высушенную

флюоресцирующую сыворотку растворяют при соблюдении условий стерильности в дистиллированной воде, в

том объеме, который указан на этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с корковой или резиновой

пробкой и в процессе использования хранят в холодильнике при температуре -4 °С. В день постановки реакции

нужное количество сыворотки разводят по титру дистиллированной водой. Титр каждой серии необходимо

определять. Для этого берут 5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток здоровых людей, разводят

их изотоническим раствором натрия хлорида в  200  раз и ставят реакцию с использованием во второй фазе

различных разведении флюоресцирующей сыворотки против сывороточных глобулинов человека той серии,

титр которой определяется. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100 исследуемых

сыворотках, из которых не менее 20 должно быть от больных сифилисом.

Техника постановки реакции. Из антигена готовят препараты на тонких, хорошо обезжиренных предметных

стеклах, на обратной стороне которых обозначены кружки диаметром  1 см. Запаянным концом пастеровской

пипетки круговыми движениями распределяют антиген в пределах кружка, и высушенный на воздухе мазок

фиксируют   в   течение  5  мин   в   чистом   ацетоне.   После   фиксации   стекла   помещают   во   влажную   камеру.

Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз изотоническим раствором натрия хлорида.

Для проведения первой фазы реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят испытуемые

сыворотки. Для того, чтобы покрыть препарат, достаточно  1  капли сыворотки. После этого влажную камеру

закрывают и помещают в термостат при температуре 35°С на 30 мин. По истечении этого времени препараты

вынимают из влажной камеры, промывают в течение 10 мин в двух порциях изотонического раствора натрия

хлорида и помешают в штатив для высушивания. После высушивания препараты вновь помещают во влажную

камеру и наносят по капле разведенной по титру флюоресцирующей сыворотки против глобулинов человека.

Вторую   фазу   реакции   проводят   при   комнатной   температуре,   после   чего   препараты  10  мин   промывают   в

изотоническом   растворе   натрия   хлорида,   высушивают   и   монтируют   для   люминесцентной   микроскопии.

Монтирование   препаратов   заключается   в   том,   что   на   них   стеклянной   палочкой   наносят   маленькие   капли

забуференного   глицерина  (1  часть   фосфатного   буфера   при   рН  7,4  и  9  частей   глицерина),   накрывают   их

тонкими, хорошо обезжиренными предметными стеклами, на которые стеклянной палочкой наносят по капле

нелюминесцирующее   иммерсионное   масло   (диметилфталат).   Исследование   препаратов   производят   в

люминесцентном   микроскопе   или   в   люминесцентном   устройстве   ОЙ-17.  Степень   свечения   трепонем,

зависящая   от   количества   антител   в   сыворотке   крови,   обозначается   плюсами.   Свечение   считается

положительным, если его оценивают как 4+, 3+ и 2+.

Реакция иммунофлюоресценции-абсорбции с бледной трепонемой (FTA-ABS).  Используемый для реакции

антиген   представляет   собой   взвесь   бледных   трепонем   из   пораженных   сифилисом   яичек   кролика,

фиксированную   ацетоном   на   предметном   стекле.   Можно   также   использовать   лиофилизированные   бледные

трепонемы после их восстановления в изотоническом растворе натрия хлорида. Инакти-вированную сыворотку

инкубируют с сорбентом (трепонемы Рейтера) для абсорбирован ия неспецифических групповых антител. За-

тем сыворотку помещают пипеткой на антиген, находящийся на предметном стекле. Специфические антитела

(глобулины)   связываются   бледными   трепонемами.   После   промывания   ктрепонемам   на   предметном   стекле

добавляют   комплекс   античеловеческого   глобулина   с   флюоресцентным   красителем   (флюоресцеин-

изотиоцианат). Этот комплекс связывается с человеческим глобулином на оболочке клеток бледных трепонем и

может быть идентифицирован методом флюоресцентной микроскопии. По прошествии не менее 2 ч по степени

флюоресценции   сыворотку   можно   классифицировать   как   нереактоспособную,   пограничную   или

реактоспособную. Реакция, обозначаемая двумя плюсами или больше, свидетельствует об инфекции.

Появления   реактоспособности   можно   ожидать   примерно   в   начале   3-й   недели   после   заражения,   а   у

нелеченных больных она обнаруживается постоянно. Сыворотка остается реактоспособной и через несколько

лет после успешного лечения раннего сифлиса, а у больных, получивших адекватное лечение при позднем

сифилисе,  -  на   протяжении   десятилетий.   Главными   достоинствами   реакции  FTA-ABS  являются   довольно

высокая специфичность и чувствительность, а также быстро наступающая реактоспособность. Положительная

FTA-ABS  может   иметь   решающее   значение   для   диагностики   в   сомнительных   случаях,   особенно   при

положительных   реакциях  VDRL  или   автоматизированной   реакции   микрогемагглютинации   (АМНА-ТР),

используемых для скрининга (LugerA., 1981).

Реакция 19S IgM-FTA-ABS. При идентификации антител IgM к бледным трепонемам реакцией FTA-ABS с

использованием   конъюгата  анти-IgM  в   качестве   реагента   выявлялись   ложноположительные   и

ложноотрицательные результаты. Реакция  19S IgM-FTA-ABS  в этом отношении является наиболее точным,

специфичным   методом.   В   целях   отделения   крупных   молекул  19S   IgM  от   более   мелких   молекул   7S  IgM

используется   методика   ультрацентрифугирования,   адсорбирования   на   белке   А   и   гель-фильтрация   с

применением ультрагеля АсА  34  с трисбуфером при рН  8,0  на колонке К  26/100  при объеме геля  300  мл,

скорости потока 27 мл/ч и температуре 24

0

С. В этой системе первый пик элюата содержит фракцию 19S IgM. В

процессе   фильтрования   отделяются   непрочные   иммунные   комплексы.   Использование   фракции  19S   IgM  в

реакции FTA-ABS обеспечивает высокую специфичность, устраняя возможность неспецифических, ошибочных

результатов.

Реакция иммобилизации бледных трепонем.

Основное назначение РИБТ - распознавание ложноположительных результатов при постановке стандартных

серологических  реакций.  Это  особенно важно  у больных,  у  которых отсутствуют  клинические  проявления

активного сифилиса или имеются поражения внутренних органов или нервной системы. Неоценима роль этой

реакции   для   распознавания   ложноположительных   результатов   стандартных   серологических   реакций   у

беременных, где от результата РИБТ фактически зависит судьба (здоровье) ребенка.

Сущность   реакции   заключается   в   потере   подвижности   бледными   трепонемами   в   присутствии

иммобилизинов испытуемой сыворотки и активного комплемента. Реакция ставится в условиях анаэробиоза.

Техника выполнения самой реакции довольно сложна, поэтому она ставится в специальных лабораториях.

Иммобилизины появляются в сыворотке крови больных позднее, чем другие антитела, и, следовательно,

РИБТ становится положительной позже, чем стандартные серореакции и РИФ.

Оценка реакции: при иммобилизации до  20 %  бледных трепонем реакция считается отрицательной; при

иммобилизации от 21 до 50 % бледных трепонем - слабоположительной; при иммобилизации от 51 до 100% -

положительной (оценка процента иммобилизации бледных трепонем производится по специальной таблице).

Положительный   результат   РИБТ   наблюдается   у   больных   с   тропическими   трепонематозами   (пинта,

беджель).   Иногда   РИБТ   дает   ложноположительный   результат   при   саркоидозе,   эритематозе,   туберкулезе,

циррозе печени, атеросклерозе и др. С возрастом пациентов число ложноположительных результатов РИБТ

увеличивается.

Упрощенная методика РИБТ (Методика разработана проф. Н. М. Овчинниковым.). Кровь для получения сы-

воротки берут из вены стерильно в сухую чистую и простерилизованную посуду. Больной перед взятием крови

не   должен   принимать   никаких   лекарственных   средств,   которые   могли   бы   оказать   вредное   влияние   на

подвижность трепонем; в частности, необходимо прекратить введение дюрантных препаратов пенициллина на

срок   возможной   задержки   его   в   организме.   Инактивация   сыворотки   производится   в   течение  30  мин   при

температуре  56  °С,   а   если   сыворотка   была   инактивирована   накануне,   то   в   день   постановки   реакции   ее

прогревают   в   течение  10  мин.   Никаких   консервантов   в   сыворотку   не   добавляют.   При   необходимости

длительного хранения сыворотку можно заморозить при -20 °С. Сыворотки, высушенные на вощаной бумаге (с

добавлением свежеприготовленного 40 % пищевого сахара по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки), можно в

отдельных   случаях   применять   для   исследования.   Следует,   однако,   учитывать,   что   титр   иммобилизинов

снижается  при   высушивании   сыворотки  подобно реагинам  и  при   невысоких титрах  снижение  может   быть

значительным. Поэтому не следует широко пользоваться в РИБТ высушенными сыворотками.

Срок годности для исследования высушенной сыворотки 5 дней с момента приготовления в южных районах

нашей страны или в жаркое время года и 10 дней - в остальных регионах. Сыворотка нативная, хранящаяся в

холодильнике при температуре +3...+5°С, также теряет свою активность.

В   качестве   антигена   применяют   взвесь   бледных   трепонем   из   раннего   орхита   кролика,   зараженного

сифилисом, обычно штаммом Никольса. Для заражения следует брать совершенно здоровых кроликов-самцов

массой 2-2,5 кг, предварительно исследовав у них кровь на реакцию Вассермана. Отбирают только кроликов с

отрицательными результатами серологических реакций. Заражение производят внутрь яичка взвесью трепонем

в количестве не менее 50-60 в поле зрения в объеме 0,50-0,75 мл. Непосредственно после заражения кролику

вводят внутримышечно  20  мг кортизона, а в последующие дни  -  по  10  мг ежедневно. Рекомендуемое рядом

исследователей   одновременное   рентгеновское   облучение   кроликов   трудно   для   выполнения   и   не   дает

существенных преимуществ.

Для удаления яичка (при 6-8-дневном орхите) кролика привязывают к станку, обескровливают сердечной

пункцией   (некоторые   предпочитают   обескровливать   через   сонную   артерию).   Затем   забивают   кролика

воздушной   эмболией   (введение  15  см

3

  воздуха   в   краевую   вену   уха).   Яички   выводят   в   мошонку   путем

поглаживания ладонью по животу кролика сверху вниз. Поверхность кожи мошонки, предварительно немного

подстриженной   ножницами,   смазывают   спиртом,   поджигают,   тут   же   тушат   и   опять   поджигают.   Этим

достигаются   освобождение   кожи   от   шерсти   и   одновременно   дезинфекция   кожи.   После   этого   мошонку

покрывают   резиновой   стерильной   салфеткой   с   разрезом,   через   который   выводят   наружу   яичко.   Оператор

фиксирует   яичко   одной   рукой,   а   другой   рукой   делает   скальпелем   небольшой   поперечный   разрез   кожи

мошонки. Ножницами отрезают яичко от подлежащих тканей и помещают его в стерильную чашку Петри.

Такого же рода манипуляцию проделывают и с другим яичком. Далее ножницами удаляют придаток, осво-

бождают яичко от жира и разрезают его на 10-15 кусочков. Готовят препарат с каплей изотонического раствора

натрия хлорида и определяют под микроскопом в темном поле наличие трепонем и их число. Все кусочки

помещают   в   стерильную   колбу   объемом  50-75  мл,   в   которую   уже   налита   среда   (сыворотка   кролика,

разведенная  0,83 %  стерильным раствором натрия хлорида, в количестве  10-14  мл на яичко). Колбу ставят в

аппарат   для   встряхивания   на  20-30  мин.   После   этого   все   содержимое   выливают   в   большую   стерильную

центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для удаления плотных кусочков

тканей.   Затем   надосадочную   жидкость   сливают   и   готовят   препараты   для  микроскопии.   Определяют   число

трепонем в темном поле зрения (окуляр  10,  объектив  40).  Если число трепонем большое, то взвесь следует

развести, чтобы было по  10-15  трепонем в поле зрения, так как при большем их числе трудно подсчитывать

иммобилизованные трепонемы.

Обычно   в   центрифужной   пробирке   над   осадком   оставляют   некоторое   количество   жидкости   и   дают

возможность немного ей постоять. Жидкостью, содержащей большое число трепонем, заражают кроликов для

следующей   постановки   реакции.   При   каждой   постановке   следует   одновременно   производить   и   заражение.

Зараженных кроликов содержат в клетках в проветриваемом помещении при температуре +18...20°С. Пища

кроликов должна содержать значительное количество витаминов.

Для сохранения трепонем жизнеспособными предложено большое количество различных сред (Овчинников

Н. М., 1961).

Первоначально среда Нельсона была очень сложна. Затем Нельсон значительно упростил ее, но она все еще

сложна.  A.  Bellone  и М.  Bonelli  (1957)  в качестве среды для сохранения трепонем применяют разведенную

изотоническим раствором натрия хлорида сыворотку человека (2:1), а К. Meinike и К. Lagel (1959) - сыворотку

кролика (2:1 или 1:1). Следует отметить, что трепонемы, взвешенные в одном изотоническом растворе натрия

хлорида и особенно вместе с сывороткой больного и комплементом в небольшой дозе, выживают, судя по

контрольным   исследованиям,   и   без   какой-либо   среды,   однако   сроки   их   выживания   значительно   короче,

подвижность менее активна, и наблюдается значительное количество сомнительных результатов.

Н.М.   Овчинников  (1961,   1962)  предложил   для   РИБТ   простую   среду.   Готовят  0,2%  раствор   пищевого

желатина на 0,83 % растворе натрия хлорида. Раствор стерилизуют автоклавированием при температуре 110°С

в течение 10 мин, после чего добавляют стрептомицина сульфат из расчета 1:10000. Среда для опыта состоит из

сыворотки   кролика,   разведенной  1:2  изотоническим   раствором   натрия   хлорида,   желатина   и   раствора

человеческого   альбумина.   Альбумин   готовят   на   изотоническом   растворе   натрия   хлорида,   стерилизуют

фильтрацией через бактериальный фильтр (пригоден только сухой альбумин, лиофильно высушенный); каждый

раз   при   употреблении   новой   серии   следует   испытать,   параллельно   со   старой,   новую   серию.   Весь   запас

ингредиентов хранится в обычном рефрижераторе.

На 10 сывороток требуется 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина и 1,6 мл взвеси

трепонем. Вымывание трепонем обычно производят разведенной кроличьей сывороткой, но можно с самого

начала использовать указанную среду сохранения. Особенно следует обращать внимание на возможность у

кроликов спонтанного спирохетоза, при котором могут наблюдаться положительные результаты реакции или

спонтанная агглютинация трепонем.

При хранении ингредиентов рН среды может меняться. В случае окисления среды к ней следует добавить 1

% стерильный раствор натрия гидрокарбоната до рН 7,2.

Реакция протекает только при условии избытка комплемента, поэтому применяют различные количества

комплемента, что в значительной степени зависит от примененной среды. При пользовании одной и той же

средой установлено, что чем больше взято комплемента, тем больше находят иммобилизованных трепонем, а

чем   меньше   комплемента,   тем   больше   подвижных   трепонем.   При   употреблении   желатиновой   среды

оптимальное количество комплемента равно  0,15  мл на каждую пробирку. Комплемент применяется свежий,

полученный от морской свинки. Консервированный комплемент непригоден.

Техника   постановки   реакции.  Пронумерованные   пробирки   с   сыворотками   расставляют   в   штативе.   В

журнале нечетными номерами отмечают все смесители, в которые добавлялся активный комплемент (опыт), и

четными номерами  -  куда добавлялся инактивированный комплемент (контроль). Комплемент добавляют не

для каждой сыворотки отдельно, а готовят «коктейль», т. е. предварительно соединяют комплемент с антигеном

в нужных соотношениях для всех сывороток. Взвесь трепонем в питательной среде из расчета по  0,3  мл на

каждую   сыворотку   делят   на  2  части   и   добавляют   в   один   флакон   активный   комплемент,   а   в   другой  -

инактивированный.

В стерильный смеситель для лейкоцитов набирают сыворотку до метки  1.  Конец смесителя стерильной

ваткой вытирают от сыворотки, оставшейся на стенках. Это необходимо, так как при попадании положительной

сыворотки в антиген в последующих сыворотках могут быть получены неверные результаты. Во избежание

загрязнения при больших постановках разливают антиген параллельно в два флакона. После этого набирают

взвесь   трепонем   с   активным   комплементом   до   метки  2.  В   другой   смеситель   набирают   взвесь   трепонем   с

инактивированным   комплементом.   Оба   конца   каждого   смесителя   закрывают   резиновым   кольцом,   как   для

транспортировки   крови,   взятой  для  клинического   исследования,   и   встряхивают   для   смешивания.   (При

отсутствии  таких колец  их можно сделать,  разрезав  полую  резиновую  трубку диаметром  до  1  см вдоль  и

соединив   концы).   Кольца   до   опыта   и   каждый   раз   после   его   проведения   следует   кипятить.   Во   избежание

возможного влияния некоторых сортов резины места ее соприкосновения со смесителем следует смазывать

стерильным вазелиновым маслом. Можно не закрывать концы смесителя резиновыми кольцами, а заливать их

парафином   с   температурой   плавления   выше   50°С   (парафин   с   более   низкой   температурой   плавления

непригоден, так как при помещении смесителей в термостат парафин может стечь и герметичность системы

будет нарушена), однако это менее удобно. Благодаря тому, что оба конца смесителя закрыты, прекращается

доступ воздуха, взвесь трепонем находится в относительно анаэробных условиях.

Для контроля набирают в те же смесители все взвеси с активным и инактивированным комплементом, а

также   одну   взвесь   без   комплемента.   Ставят   также   реакцию   иммобилизации   с   сыворотками,   заведомо

отрицательными и заведомо положительными, оставшимися от прошлой постановки.

Заполненные и закрытые смесители помещают в специальный штатив или коробку с вырезами. На каждый

смеситель надевают нумерованные кольца из картона. Смесители помещают в термостат при температуре 35 °С

на 18-20 ч. Для регистрации опыта через 18 ч смесители вынимают из термостата попарно - опыт и контроль.

Подсчет   подвижных   и   неподвижных   трепонем.  По   количеству   смесителей   в   штативе   расставляют   и

нумеруют   маленькие  пробирки  (12х60  мм).   Содержимое   смесителя   выливают   в  соответствующую  нумеро-

ванную пробирку, перемешивают тем же смесителем с надетой на него пипеткой и наносят каплю взвеси с

активным комплементом на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону  -  с инактивированным

комплементом той же сыворотки; посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают покровными

стеклами 20х20 мм. Капли должны быть небольшими, иначе трепонемы «плывут» с током жидкости, и тогда

суждение   об   их   подвижности   и   подсчет   затруднительны.   Учет   результатов   реакции   начинают   с   инак-

тивированного   комплемента.   Подсчитывают  25-30  трепонем   и   отмечают,   какое   количество   среди   них

подвижных   и   какое  -  неподвижных.   Если   в   контроле   содержится   меньше  17  подвижных   трепонем   из  25

сосчитанных,   то   такой   опыт   непригоден   и   его   следует   повторить.   В   пробирках   с   инактивированным

комплементом отсутствие подвижности трепонем объясняется не иммобилизацией, а токсичностью сыворотки

или недостаточно высоким качеством среды сохранения (зафязнение бактериями, примесь медикаментов и т.

д.).

При   определении  подвижности   трепонем  следует  учесть,  что  движения  трепонем  различны.  Они   могут

обладать весьма активной подвижностью, особенно отчетливы сгибательные движения, а иногда отмечаются

только винтовые движения. Иногда трепонема лежит как бы неподвижно, но если присмотреться, то видно, что

через некоторое время она начинает активно двигаться. Следует также уметь отличать активные движения

трепонемы от движения с током жидкости.

В пробирках, в которые вылили содержимое смесителей, в дальнейшем определяют остаточный комплемент

(во всех пробирках опыта и контроля). Пробирки с инактивированным комплементом служат как бы контролем

для сравнения происшедшего гемолиза.

Расчет специфической иммобилизации производят по следующей формуле:

Число подвижных трепонем 

___

число подвижных в контроле

в контроле

 

     

        

        

        

        

        

        

        

        

        

   трепонем в опыте

 

    

        

        

        

   

• 100

Число подвижных трепонем в котроле

Реакция иммобилизации считается положительной, когда процент иммобилизации выше 51; от 31 до 50 % -

слабоположительной; сомнительной - от 21 до 30% и отрицательной - ниже 20 %.

Опыт   с   сомнительными,   а   иногда   и   слабоположительными   результатами   следует   повторить;   при   этом

можно   получить   или   положительный,   или   отрицательный   результат.   Неудовлетворительным   считается

результат, если  имеется  большое бактериальное загрязнение или  отмечается  токсичность  сыворотки. Такие

исследования следует  повторить  с новой  порцией сыворотки. Целесообразно также подвергать  повторному

исследованию все сыворотки, давшие полное расхождение со стандартными серологическими реакциями. Эти

сыворотки заслуживают особого внимания, так как в таких случаях результаты РИБТ могут дать опору для

суждения о наличии или отсутствии сифилиса.

При постановке опыта обращают внимание на соблюдение стерильности и чистоты посуды. Она должна

быть   свободна   от   примеси   веществ,   могущих   оказать   вредное   влияние   на   жизнеспособность   трепонем.

Смесители и всю посуду моют сначала холодной водой, затем горячей, споласкивают дистиллированной водой,

не   применяя   никаких   дезинфицирующих   средств.   Смесители   стерилизуют   в   автоклаве,   подсушивают   в

сушильном шкафу.

Описанная методика РИБТ достаточно проста и дает возможность ставить реакцию иммобилизации всюду,

где   имеются   квалифицированный   персонал   и   возможность   содержать   кроликов.   Этот   метод   можно

использовать также с другими питательными средами.

Реакция  иммунного прилипания бледных трепонем  (РИП)  Приводится по методическим рекомендациям,

составленным   Г.П.   Авдеевой   (Узбекский   научно-исследовательский   кожно-венерологический   институт).

основана   на   том,   что   вирулентные   тканевые   трепонемы,   сенсибилизированные   сывороткой   больного

сифилисом,   в   присутствии   комплемента   и   эритроцитов   прилипают   к   поверхности   эритроцитов   и   при

центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

Перед началом работы, связанной с приготовлением антигена из бледных трепонем, в кастрюлю объемом 2-

3 л наливают на 2/3 дистиллированной воды и в процессе работы складывают в нее колбы, пробирки, пипетки,

предметные   стекла,   загрязненные   антигеном.   Готовят   также   почкообразный   тазик,   заливаемый   на  2/3  дис-

тиллированной   водой,   куда   складывают   покровные   стекла   после   работы.   Приготовление   препарата   для

подсчета бледных трепонем необходимо проводить с максимальной точностью, так как при неточном разливе

ингредиентов,   при   избытке   или   недостатке   исследуемого   материала   в   препарате   можно   получить

недостоверные результаты. Учет результатов следует проводить в день постановки реакции, лучше всего тут же

после   центрифугирования,   так   как   при   длительном   стоянии   пробирок  (15-24  ч)   возможны

ложноположительные результаты. Покровные стекла должны иметь размеры только 24х24 мм. Надосадочную

жидкость берут микропипеткой объемом 0,1 мл.

Для   постановки   реакции   используются   следующие   ингредиенты:   испытуемая   сыворотка,   антиген,

комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и обрабатывают,

как   для   реакции   Вассермана.   Сыворотку   крови   инактивируют   в   водяной   бане   при   температуре   55-56°С   в

течение 30 мин.

В   качестве   антигена   используют   взвесь   бледных   трепонем   штамма   Никольса.   Здоровым   кроликам

интратестикулярно вводят по  0,75-1  мл взвеси бледных трепонем, содержащей не менее 60-70 особей в поле

зрения. На 7-12-й день кролика забивают воздушной эмболией, вводя  20  см

3

  воздуха в ушную вену. Яички

удаляют, очищают от оболочек, жира, освобождают от придатков и разрезают на мелкие кусочки, которые

затем помещают в стерильную колбу, заливают 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида.

После этого всю жидкость из колбы отсасывают пипеткой в пробирку и определяют в ней число бледных

трепонем.   Для   этого   микропи-геткой   из   пробирки   наливают  0,01  мл   на   предметное   стекло,   покрывают

покровным стеклом и смотрят в темном поле зрения. Если число бледных трепонем в поле зрения достигает

100, то в колбу с тканями яичка добавляют 50 мл, а если 50, то 20-25 мл стерильного изотонического раствора

натрия хлорида и производят встряхивание в шюттель-аппарате в течение  50  мин. Первую  порцию  взвеси

бледных   трепонем   уничтожают   (она   не   может   быть   использована   в   качестве   антигена).   Вторую   порцию

жидкости,   полученную   при   экстрагировании,   отсасывают   стерильной   пипеткой,   разливают   в   химические

пробирки  и снова определяют  в ней  число бледных трепонем в поле зрения. При наличии в этой  порции

жидкости 50-100 бледных трепонем яички можно подвергать повторным экстрагированиям с новыми порциями

изотонического раствора натрия хлорида до тех пор, пока в антигене не будет не менее 20 бледных трепонем в

поле   зрения.   После   каждого   экстрагирования   жидкость   из   колбочки   отсасывают   пипеткой   в   стерильные

химические   пробирки   и   центрифугируют   при  1000  об/мин   в   течение  15  мин.   Надосадочную   жидкость

отсасывают (или сливают) из всех пробирок в одну стерильную колбочку, прогревают при температуре 56°С в

течение  30  мин, и в ней определяют число бледных трепонем в темном поле зрения, просматривая  10  полей

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  127  128  129  130   ..