Главная Учебники - Разные Лекции (разные) - часть 23
|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Бийский технологический институт (филиал)
государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова» Н.И. Мезенцева, Е.В. Аверьянова, С.В. Лаптев
БИОХИМИЯ
Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей Бийск Издательство Алтайского государственного технического 2009 Рецензенты: д.х.н., профессор БТИ АлтГТУ А.Л. Верещагин; д.б.н., профессор ТСХИ Н.Я. Костеша Биохимия: практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и 240901 «Биотехнология» / Н.И. Мезенцева, Е.В. Аверьянова, С.В. Лаптев; Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. - Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2009. - 78 с. В практикуме представлены широко используемые методики биохимических исследований сырья растительного и животного происхождения для обучения по курсу «Биохимия». Рассмотрен и одобрен на заседании кафедры биотехнологии. Протокол № 99 от 19.12.2008 г. ã Н.И. Мезенцева, Е.В. Аверьянова, С.В. Лаптев, 2009 ã БТИ АлтГТУ, 2009 ВВЕДЕНИЕ……………………………………..…………………… 6 1 СВОЙСТВА ВОДЫ………………………………………………. 7 1.1 Водородный показатель рН……………………………..…… 9 1.2 Буферные системы……………………………………………. 12 1.3 Индикаторы и их свойства…………………………………… 16 1.4 Лабораторная работа «Электрометрическое определение водородного показателя»…………………………………………... 17 1.5 Лабораторная работа «Индикаторный метод измерения водородного показателя»…………………………………………... 18 2 УГЛЕВОДЫ……………………………………………………….. 19 2.1 Лабораторная работа «Определение глюкозы с помощью реакции восстановления оксида меди в гемиоксид»……………... 19 2.2 Лабораторная работа «Определение содержания глюкозы 21 2.3 Лабораторная работа «Определение концентрации 23 3 БЕЛКИ, ПЕПТИДЫ, АМИНОКИСЛОТЫ……………………… 25 3.1 Лабораторная работа «Определение содержания казеина 25 3.2 Лабораторная работа «Определение содержания белка 26 3.3 Лабораторная работа «Определение аминокислот формолтитрованием по Сьоренсону»……………………………... 27 3.4 Лабораторная работа «Реакции осаждения белков»……….. 29 3.5 Лабораторная работа «Диализ солевого раствора белка»…. 32 3.6 Лабораторная работа «Определение изоэлектрической точки белков»……………………………………………………….. 33 4 ФЕРМЕНТЫ………………………………………………………. 36 4.1 Лабораторная работа «Определение активности амилазы солода по методу Вольгемута»…………………………………….. 36 4.2 Лабораторная работа «Определение активности каталазы по Баху»……………………………………………………………… 37 4.3 Лабораторная работа «Капельный метод 38 4.4 Лабораторная работа «Метод Вильштеттера и Вальдшмидта-Лейтца определения протеолитической активности ферментов в модификации»………………………….. 41 5 ЖИРЫ……………………………………………………………… 44 5.1 Лабораторная работа «Определение числа омыления жира»………………………………………………………………… 44 5.2 Лабораторная работа «Определение кислотного числа жира»………………………………………………………………… 45 5.3 Определение эфирного числа жира…………………………. 46 5.4 Лабораторная работа «Определение йодного числа жира».. 46 6 ВИТАМИНЫ……………………………………………………… 47 6.1 Лабораторная работа «Реакция окисления тиамина 47 6.2 Лабораторная работа «Реакция восстановления рибофлавина (витамина В2
)»………………………………………. 48 6.3 Лабораторная работа «Реакция на пиридоксин 48 6.4 Лабораторная работа «Выделение фолиевой кислоты 49 6.5 Реакции на аскорбиновую кислоту (витамин С)…………… 49 7 НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ…………………………………… 53 7.1 Лабораторная работа «Обнаружение пуриновых 53 7.2 Лабораторная работа «Обнаружение белков в составе нуклеопротеидов»…………………………………………………... 54 8 СОДЕРЖАНИЕ ЛАБОРАТОРНОГО ПРАКТИКУМА 55 ЛИТЕРАТУРА………………………………………………………. 57 ПРИЛОЖЕНИЕ А. Классификация моносахаридов……………... 59 ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Дисахариды……………………………………. 60 ПРИЛОЖЕНИЕ В. Глюконеогенез………………………………... 61 ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Схема потока метаболитов 62 ПРИЛОЖЕНИЕ Д. Взаимопревращение питательных веществ… 63 ПРИЛОЖЕНИЕ Е. Классификация аминокислот, 64 ПРИЛОЖЕНИЕ Ж. Элементы вторичной структуры белков: 65 ПРИЛОЖЕНИЕ И. Некоторые a-аминокислоты, не входящие 66 ПРИЛОЖЕНИЕ К. Цикл мочевины (орнитиновый цикл)……….. 67 ПРИЛОЖЕНИЕ Л. b-Окисление жирных кислот………………… 68 ПРИЛОЖЕНИЕ М. Биосинтез жирных кислот…………………... 69 ПРИЛОЖЕНИЕ Н. Коферменты…………………………………... 70 ПРИЛОЖЕНИЕ П. Нуклеотиды РНК и ДНК…………………….. 73 ПРИЛОЖЕНИЕ Р. Распад пуринов……………………………….. 74 ПРИЛОЖЕНИЕ С. Распад пиримидинов…………………………. 75 ПРИЛОЖЕНИЕ Т. Структура ДНК……………………………….. 76 ПРИЛОЖЕНИЕ У. Структура тРНК……………………………… 77 Практикум является частью учебно-методического комплекса по курсу «Биохимия». Лабораторные методы исследований биомолекул изложены с учетом новых достижений современной биохимии. Цель настоящего практикума – закрепление теоретических знаний путем формирования практических навыков в области статистической, динамической и функциональной биохимии. При выполнении лабораторных работ студент приобретает основные экспериментальные навыки – качественного и количественного определения продуктов биосинтеза живой клетки, активности ферментов, получения ферментных препаратов, фракционирования клеточного содержимого. В практикум вошли основные методы по определению общего количества сахаров, белков, липидов, витаминов, определения активности ферментов, биохимические методы исследования растений, микроорганизмов, дрожжей. Лабораторные работы содержат изложение принципа методов с указанием структурных формул и реакций взаимодействующих веществ, перечень основных материалов, реактивов и оборудования, подробное описание хода работы и ожидаемых результатов. Основным растворителем в живом организме является вода. Рисунок 1 – Схема возникновения полярности за счет асимметрии Такое строение молекулы обеспечивает нейтрализацию зарядов ядра кислорода. Преимущественное сосредоточение положительных и отрицательных зарядов на разных полюсах молекулы приводит к развитию дипольного момента. Дипольный характер молекул воды хорошо объясняет растворимость в ней полярных веществ и плохую растворимость неполярных. Для процессов растворения большое значение имеет полярность молекул. Полярными называют молекулы, у которых одна часть имеет положительный заряд, другая – отрицательный (рисунок 1б
). Полярность возникает, когда молекулы имеют ионные связи, т.е. состоят из ионов. Например, при образовании молекулы NaCl происходит переход электрона от атома натрия к атому хлора, возникают два противоположно заряженных иона, которые взаимно притягиваются, образуя ионную связь. При этом одна часть молекулы сохраняет отрицательный, а другая – положительный заряд (рисунок 1в
). Полярными являются молекулы с ковалентными связями, построенные асимметрично. Двойные и тройные связи также обусловливают дипольность молекулы, т.к. их π-связи всегда поляризованы (рисунок 1г
). К полярным относятся также ионогенные группы: карбоксильная –COOH и аминогруппа –NH2
. При диссоциации этих групп возникают электрические заряды, усиливающие их полярность: R–COO–
и Рисунок 2 – Схема растворения кристаллов NaCl и образования Способность жидких и твердых веществ растворяться зависит, с одной стороны, от их способности образовывать сольватную оболочку, а с другой стороны, от полярности молекул. Хорошая растворимость, например, сахаров, не образующих ионов, обусловлена присутствием в их молекулах многочисленных полярных спиртовых групп. Вещества со слабополярными молекулами, например, жирные кислоты, лучше растворяются в растворителях, молекулы которых также малополярны (эфир) или неполярны (бензол). Молекулы, включающие большое количество неполярных углеводородных группировок (фенол), не способны «притягивать» к себе значительное количество молекул воды. В результате их взаимная растворимость ограничена, что ведет к расслаиванию указанных веществ. Вследствие своей полярности вода растворяет или диспергирует очень многие вещества. Она является гораздо лучшим растворителем, чем большинство общеизвестных жидкостей. Многие кристаллические соли и другие полярные соединения легко растворяются в воде, но почти нерастворимы в неполярных жидкостях. Второй обширный класс веществ, хорошо растворимых в воде, включает неионные, но полярные соединения, такие как спирты, сахара, альдегиды, кетоны и др. Вода является слабым электролитом и диссоциирует на ион водорода и гидроксила незначительно:
Константа диссоциации равновесия К выражается следующим образом:
где С –
концентрация. Учитывая, что степень диссоциации воды при температуре 25 ºС очень мала, можно концентрацию недиссоциированных молекул воды принять за величину постоянную. Тогда, преобразовав уравнение, получим в левой части произведение двух постоянных величин, т.е. тоже величину постоянную:
Постоянная Кв
называется ионным произведением воды. Численное значение постоянной Кв
можно определить, зная, что концентрация Своды
составляет 55,56 моль/л, а константа диссоциации К – 1,8×10-9
. Таким образом, ионное произведение чистой воды при температуре В кислых или щелочных растворах эти концентрации не равны друг другу, но изменяются сопряженно: при увеличении одной концентрации соответственно уменьшается другая. Например: если величина Реакция среды будет кислой, если концентрация ионов Н+
превышает концентрацию ионов ОН-
. Количественно реакцию среды выражают через активность (концентрацию) водородных ионов. На практике используют водородный показатель рН
. Он определяется общей формулой
Водородным показателем называют величину, численно равную отрицательному десятичному логарифму активности (концентрации) водородных ионов, выраженную в г-ионах/литр.
Для чистой воды рН = 7,0, для кислых растворов рН < 7,0, для щелочных рН > 7,0. Логарифмируя ионное произведение воды, находим
Беря логарифм с обратным знаком, получим:
Следовательно, величины рН и рОН являются сопряженными величинами. Их сумма для разбавленных растворов всегда равна 14. Зная величину рН, легко вычислить значение рОН:
и наоборот
Таким образом, в нейтральной среде концентрация В кислых растворах рН имеет меньшее, а в щелочных большее значение, так как благодаря перемене знака логарифма возрастает числовое значение рН соответственно убывающей концентрации ионов Н+
. Постоянство концентрации водородных ионов является одной из основных констант внутренней среды организма. Так, рН крови человека и большинства сельскохозяйственных животных колеблется в пределах от 7,20 до 7,40. Активность разнообразных биологических катализаторов (ферментов), а также специфика происходящих в тканях биохимических процессов связаны с ограниченными зонами значений рН. Например, пепсин желудочного сока активен при значениях рН от 1,5 до 2,5, каталаза крови при рН=7,0; тканевые катепсины в нейтральной среде катализируют синтез белка, при кислой реакции активизируют его расщепление. Смещение реакции среды в живом организме в кислую сторону называется ацидозом,
а в щелочную – алкалозом
. Изменение рН крови на несколько десятых долей приводит к серьезным нарушениям жизнедеятельности организма. Определение рН в ряде случаев помогает судить о характере протекающих в организме патологических процессов. В связи с этим часто приходится определять рН в различных биологических жидкостях (крови, моче), что иногда представляет довольно сложную задачу. Определение реакции среды и знание концентрации водородных ионов в биологических объектах часто является необходимым в лабораторной практике. Эти определения нужны, например, для создания желаемой реакции среды при проведении многих биохимических и микробиологических экспериментов. Так, при работе с микроорганизмами, с культурами тканей, при определении ферментативной активности одним из основных условий является создание необходимой реакции среды. В технической биохимии (сыроварении, хлебопечении, изготовлении кож, чая, табака и др.) также очень важно создание определенной реакции среды для обеспечения правильного течения ферментативных реакций. Различные растворы очень сильно различаются по реакции среды. Значения рН некоторых растворов представлены в таблице 1. Таблица 1 – Значения водородного показателя некоторых веществ Раствор Значение рН 1Н NaOH 14,0 Отбеливатель 13,0 Нашатырный спирт 12,0 Сода питьевая 9,0 Морская вода 8,0 Молоко 6,5–7,0 Черный кофе 5,0 Пиво 4,5 Томатный сок, красное вино 3,5–4,0 Кока-кола 3,0 Уксус пищевой 3,0 Лимонный сок 2,0 Желудочный сок 1,0–1,5 1Н НСl 0,0 На практике определение рН осуществляют различными методами. Это электрометрический метод, колориметрический (буферный и безбуферный), определение рН с помощью различных индикаторов. Постоянство внутренней среды и поддержание рН организма обеспечивается совместным действием ряда физико-химических и физиологических систем, из которых основная роль принадлежит буферным системам. Буферными системами (буферами) называют растворы, обладающие свойством достаточно стойко сохранять постоянство концентрации водородных ионов как при добавлении кислот и щелочей, так и при разведении буферных растворов. Буферные системы по составу подразделяются на три вида: а) состоят из слабой кислоты и ее соли, образованной сильным основанием; б) состоят из слабого основания и его соли, образованной сильной кислотой; в) состоят из двух солей (кислой и основной). На практике чаще всего используют следующие буферные смеси: СН3
СООН + СН3
СООNa – ацетатный буфер; H2
CO3
+ NaHCO3
– бикарбонатный буфер; NH4
OH + NH4
Cl – аммиачный буфер; NaH2
PO4
+ Na2
HPO4
– фосфатный буфер. Каждая буферная система характеризуется определенной концентрацией водородных ионов, которую она стремится сохранить при добавлении кислых или щелочных продуктов. Рассмотрим, что определяет рН ацетатной буферной системы. Ацетатный буфер представляет собой смесь из слабой уксусной кислоты и ее натриевой соли.
Константа диссоциации уксусной кислоты выражается следующим образом:
отсюда
При добавлении к слабодиссоциирующей уксусной кислоте ее сильно диссоциированной соли СН3
СООNа произойдет резкое увеличение концентрации СН3
СОО-
. Это, в свою очередь, вызовет смещение равновесия влево, т.е. приведет к увеличению кислотности, и слабая диссоциация уксусной кислоты будет подавлена. При этом концентрация недиссоциированной уксусной кислоты будет практически равна общей концентрации кислоты. Так как соль диссоциирует полностью, можно принять концентрацию анионов СН3
СОО-
(без учета их количества, образующегося при диссоциации кислоты) равной общей концентрации соли в буферном растворе. Исходя из этого, уравнение можно представить в следующем виде:
Следовательно, рН буферных систем зависит от константы диссоциации кислоты или основания и от соотношения концентраций компонентов буферных смесей. При одинаковых соотношениях компонентов у ацетатной, фосфатной или аммиачной буферных смесей значения рН будут различными, в зависимости от разной величины констант диссоциации кислот и оснований. Константы диссоциации некоторых кислот и оснований представлены в таблице 2. Таблица 2 – Константы диссоциации слабых кислот и оснований Вещество К Муравьиная кислота НСООН 2,00×10-4
Уксусная кислота СН3
СООН 1,85×10-5
Фосфорная кислота Н3
РО4
1,00×10-7
Угольная кислота Н2
СО3
3,30×10-7
Гидроокись аммония NH4
OH 1,87×10-5
Таким образом, для приготовления буферных смесей с необходимым значением рН следует использовать кислоты или основания с соответствующими константами диссоциации, а также подбирать определенные соотношения компонентов. При одинаковых соотношениях компонентов (например, 9:1) у ацетатной, бикарбонатной или фосфатной буферных смесей значение рН будет различно, т.к. зависит и от константы диссоциации. Таблица 3 – Значения водородных показателей буферных систем Соотношение «кислота:соль» или «основание:соль» Ацетатная Фосфатная Аммиачная 9:1 3,72 5,91 10,28 8:2 4,05 6,24 9,95 7:3 4,27 6,47 9,73 6:4 4,45 6,64 9,55 5:5 4,63 6,81 9,37 4:6 4,80 6,98 9,20 3:7 4,99 7,17 9,01 2:8 5,23 7,38 8,77 1:9 5,57 7,73 8,43 При разбавлении буферных систем даже в значительной степени рН не меняется. В незабуференном растворе, например, сильной кислоты, при разведении концентрация водородных ионов уменьшается. При разведении кислоты в 10 раз концентрация ионов Н+
уменьшится во столько же раз: 0,1н раствор НСl имеет концентрацию 10-2
(рН = 2), при разведении в 100 раз концентрация Н+
становится 10-4
, т.е. рН = 4. В буферных же смесях значение рН зависит от соотношения компонентов буфера. При разведении буферных смесей в тех же пропорциях соотношение их компонентов остается прежним, поэтому значение рН не изменяется. Рассмотрим этот процесс на примере:
При добавлении кислот и щелочей к буферным системам происходит обезвреживание этих кислот и щелочей. Рассмотрим этот процесс на примере ацетатного буфера:
При добавлении кислоты к ацетатному буферу происходит взаимодействие кислоты с солью Как видно из уравнения, сильная кислота (НСl) заменяется эквивалентным количеством слабой кислоты (СН3
СООН). Повышение концентрации кислоты снижает степень ее диссоциации (по закону разведения Оствальда). В результате концентрация ионов Н+
в растворе остается практически на прежнем уровне. При добавлении щелочи:
Таким образом, сильная щелочь заменяется эквивалентным количеством слабодиссоциированной соли. Анионы СН3
СОО-
, образующиеся при диссоциации этой соли, будут оказывать угнетающее воздействие на диссоциацию уксусной кислоты. Поэтому при добавлении кислот и щелочей соотношение компонентов буферной смеси несколько изменяется. При добавлении небольших количеств кислоты и щелочи они мало влияют на изменение значения рН, однако дальнейшее добавление этих веществ значительно сдвигает рН. Подобным образом работают и другие буферные системы. Следовательно, способность буферных систем стойко удерживать рН на определенном уровне ограничена. Способность буферной системы противодействовать смещению рН среды определяется ее буферной емкостью. Буферная емкость определяется свойством буфера и выражается в количестве г-экв сильной кислоты или основания, которое следует добавить на один литр буферного раствора, чтобы сместить рН на одну единицу.
где В – буферная емкость; С – количество кислоты, г-экв; рН0
– водородный показатель до добавления кислоты; рН1
– водородный показатель после добавления кислоты. Наибольшей буферной емкостью обладают концентрированные буферные растворы и те буферы, которые состоят из равного количества компонентов, т.е. соотношение кислота/соль равно единице. Буферные системы крови обеспечивают постоянство внутренней среды живых организмов. В процессе метаболизма в организме постоянно образуются как кислые продукты (органические кислоты, кислые соли, продукты брожения и др.), так и щелочные соединения (аммиак, кератин, основные аминокислоты и др.) В организме человека образуется от 20 до 30 л кислот в сутки. Однако, рН крови поддерживается на постоянном уровне, колеблясь в ту или другую сторону на 0,05…0,07 единиц. У разных животных рН крови несколько различается. Кислотно-основные индикаторы – сложные органические соединения, которые в растворах меняют окраску в зависимости от реакции среды, т.е. от значения рН. Окраска индикаторов обусловлена наличием в их молекуле хромофорных групп (азогруппы, хиноидные группы и др.). Индикаторы представляют собой слабые кислоты или слабые основания, которые могут находиться в растворах в диссоциированном или недиссоциированном состоянии. При этом молекулы окрашены в один цвет, а ионы – в другой. Поскольку степень диссоциации зависит от реакции среды, то при различных значениях рН в растворах будет находиться различное количество молекул и ионов, и от их соотношения будет зависеть окраска раствора. Индикаторы, имеющие различную окраску в кислых и щелочных средах, называют двухцветными (метиловый красный, лакмус, диметиламиноазобензол и др.). Индикаторы, имеющие только одну окраску, называют одноцветными (фенолфталеин, нитрофенолы и др.). Универсальная индикаторная бумага содержит полоски фильтровальной бумаги, пропитанные универсальным индикатором (по Богену), в состав которого входят: фенолфталеин 0,2 г, метиловый красный 0,4 г, диметиламиноазобензол 0,6 г и бромтимоловый синий 1,0 г. Смесь индикаторов растворяют в спирте и добавляют едкий натр до появления желтой окраски. Изменения окраски универсального индикатора в зависимости от рН среды следующие: при рН = 2 – красный, при рН = 4 – оранжевый, при рН = 6 – желтый, при рН = 8 – зеленый, при рН = 10 – синий. Таблица 4 – Окраска индикаторов при различных значениях рН Индикаторы Кислая среда Щелочная среда 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Диметиламино-азобензол Красная Желтая Метиловый оранжевый Красная Желтая Метиловый красный Красная Желтая Лакмус Красная Синяя Бромтимоловый синий Желтая Синяя Фенолфталеин Бесцветная Ярко-розовая Ализариновый желтый Желтая Фиоле-товая 1.4 Лабораторная работа «Электрометрическое определение Определение рН растворов основано на установлении потенциала электрода, погруженного в раствор. Величина электрического потенциала ех
зависит от рН раствора. Значение ех
определяют по величине э.д.с. цепи, составленной из электрода определения (измерительный электрод) и электрода сравнения с известным потенциалом (сравнительный электрод). Электродом сравнения с известным значением э.д.с. обычно выступает хлорсеребряный (или каломельный) электрод. Э.д.с. цепи измеряют компенсационным методом, т.е. сравнением с постоянной э.д.с. сравнительного электрода, которая составляет 1,0183 В при температуре 20 °С. Определение производится с помощью приборов – универсальных иономеров (рН-метров). Такое определение рН очень удобно, имеет высокую степень точности, занимает мало времени. Особенно удобен такой метод определения при исследовании биологических жидкостей, а также окрашенных и мутных растворов. Точность измерения рН таким методом составляет 0,001 единиц рН. Материалы и реактивы:
фосфатный, ацетатный, трисглициновый буферы; вытяжки из растений. Оборудование:
универсальный иономер (рН-метр), стеклянные палочки, пробирки, колбы конические (объем 50 мл), воронки, ступки, фильтровальная бумага, пипетки, капельницы, бюретки, штатив для пробирок. Ход работы:
в подписанные соответственно стаканчики налить предложенные буферные растворы и измерить их рН с помощью иономера. Записать результат в таблицу. Таким же образом измерить рН неизвестных растворов – 1, 2, 3. Результаты оформить в табличной форме. Между измерениями обязательно промывать электроды дистиллированной водой (электроды поместить в стаканчик с водой) и промокнуть фильтровальной бумагой. 1.5 Лабораторная работа «Индикаторный метод измерения
водородного показателя»
Производится с помощью универсальной индикаторной бумаги и красителей – индикаторов. Материалы и реактивы:
универсальная индикаторная бумага (полоски); фосфатный, ацетатный, трис-глициновый буферы; растительные вытяжки. Оборудование:
стеклянные палочки, пробирки, колбы конические (объем 50 мл), воронки, ступки, фильтровальная бумага, пипетки, капельницы, штатив для пробирок. Ход работы:
положить на фильтровальную бумагу полоски универсальной индикаторной бумаги, нанести на полоски стеклянной палочкой несколько капель буферных растворов с известным рН. Сравнить со шкалой. Затем определить тем же способом рН неизвестных растворов в колбах 1, 2, 3. Результаты опыта оформить в форме таблицы, приведенной ниже. Результаты работы: Номер раствора рН известных растворов рН раствора, измеренный с помощью иономера рН раствора, измеренный с помощью индикаторной Углеводы широко представлены в растениях и животных, где они выполняют как структурные, так и метаболические функции. В растениях в процессе фотосинтеза из углекислого газа и воды синтезируется глюкоза, которая далее запасается в виде крахмала или превращается в целлюлозу. Животные способны синтезировать ряд углеводов из жиров и белков, но большая часть углеводов поступает с пищей растительного происхождения (Приложения А-Д). В основе метода лежит способность солей меди (II) в определенных условиях количественно окислять глюкозу по реакции Троммера. В реакции Троммера происходит образование как альдоновых кислот, так и гидроксида меди (II), что указывает на отсутствие количественной связи между глюкозой и гемиоксидом меди. Однако, если к реакционной смеси добавляют сегнетову соль, то образуется комплекс, в котором медь реагирует с глюкозой в стехиометрическом соотношении.
Количество закиси меди (Cu2
O), эквивалентное окисленной глюкозе, определяют йодометрическим методом:
Эта реакция в присутствии солей щавелевой или винной кислот протекает практически до конца. Количество йода в излишке, которое не прореагировало с гемиоксидом меди, можно определить титрованием тиосульфатом натрия (индикатор – раствор крахмала)
Материалы и реактивы:
исследуемый раствор глюкозы Оборудование:
стеклянные палочки, пипетки, конические колбы (объем 50 мл), капельницы, водяная баня, бюретки, часы. Ход работы.
В две колбы помещают по 5 мл реактива Фелинга I и II. В одну из колб (проба) добавляют 10 мл исследуемого раствора глюкозы, а в другую (контроль) – 10 мл дистиллированной воды. Содержимое обеих колб нагревают до кипения, кипятят 5 мин и затем охлаждают. После этого в обе колбы наливают по 10 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты, по 10 мл йода и после перемешивания отстаивают в течение 5 мин. По истечении этого времени в колбы вносят по пять капель раствора крахмала и титруют раствором тиосульфата до исчезновения окраски, образовавшейся после добавления крахмала. Массовую концентрацию глюкозы в исследуемом растворе (мг/мл) рассчитывают по формуле:
где А и В – объемы раствора тиосульфата натрия, затраченные на титрование пробы и контроля соответственно; f – коэффициент поправки на титр 0,05 моль/л раствора тиосульфата натрия; Q – масса глюкозы (3,52 мг), эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора тиосульфата натрия; V0
– общий объем пробы; V1
– объем исследуемого раствора, взятый до анализа. Метод основан на способности глюкозы в безбелковой вытяжке в щелочной среде при нагревании восстанавливать красную кровяную соль (гексацианоферрат калия (III) – K3
Fe(CN)6
) в желтую кровяную соль (гексацианоферрат калия (II) – K4
Fe(CN)6
). Уравнение реакции имеет вид: Вследствие обратимости этой реакции гексацианоферрат калия (III) под действием сульфата цинка переводят в нерастворимую соль – цинкгексацианоферрат калия (III):
Гексацианоферрат калия (III) берут в избытке и неиспользованный в реакции его остаток определяют йодометрически в кислой среде (например, в присутствии уксусной кислоты), титруя количество образовавшегося йода тиосульфатом натрия
В качестве индикатора на молекулярный йод используют крахмал. Содержание глюкозы рассчитывают по специальной таблице 5, которая составлена так, что в ней определенному объему тиосульфата натрия, затраченного на титрование йода, а, следовательно, избытка гексацианоферрата калия (III), соответствует то число миллиграммов глюкозы, которое прореагировало в реакции. Таблица 5 – Зависимость содержания глюкозы от объема титранта Объем тиосульфата натрия, мл 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,0 0,385 0,382 0,379 0,376 0,373 0,370 0,367 0,364 0,361 0,358 0,1 0,355 0,352 0,350 0,348 0,345 0,343 0,341 0,338 0,336 0,333 0,2 0,331 0,329 0,327 0,325 0,323 0,321 0,318 0,316 0,314 0,312 0,3 0,310 0,308 0,306 0,304 0,302 0,300 0,298 0,296 0,294 0,292 0,4 0,290 0,288 0,286 0,284 0,282 0,280 0,278 0,276 0,274 0,272 0,5 0,270 0,268 0,266 0,264 0,262 0,260 0,259 0,257 0,255 0,253 0,6 0,251 0,249 0,247 0,245 0,243 0,241 0,240 0,238 0,236 0,234 0,7 0,232 0,230 0,228 0,226 0,224 0,222 0,221 0,219 0,217 0,215 0,8 0,213 0,211 0,209 0,208 0,206 0,204 0,202 0,200 0,199 0,197 0,9 0,195 0,193 0,191 0,190 0,188 0,186 0,184 0,182 0,181 0,179 1,0 0,177 0,175 0,173 0,172 0,170 0,168 0,166 0,164 0,163 0,161 1,1 0,159 0,157 0,155 0,154 0,152 0,150 0,148 0,146 0,145 0,143 1,2 0,131 0,139 0,138 0,136 0,134 0,132 0,131 0,129 0,127 0,125 1,3 0,124 0,122 0,120 0,119 0,117 0,115 0,113 0,111 0,110 0,108 1,4 0,106 0,104 0,102 0,101 0,099 0,098 0,097 0,095 0,093 0,092 1,5 0,088 0,086 0,084 0,083 0,081 0,079 0,077 0,075 0,074 0,072 1,6 0,070 0,068 0,066 0,065 0,063 0,061 0,059 0,057 0,056 0,054 1,7 0,052 0,050 0,048 0,047 0,045 0,043 0,041 0,039 0,038 0,036 1,8 0,034 0,032 0,031 0,029 0,027 0,025 0,024 0,022 0,021 0,019 1,9 0,017 0,015 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,005 0,003 0,002 Материалы и реактивы:
вата гигроскопическая для фильтрования растворов, вытяжка из солода, 0,1 моль/л раствор гидроксида калия, 0,45 %-ный раствор сульфата цинка, щелочной раствор гексацианоферрата калия (III) (1,65 г K3
Fe(CN)6
и 10,6 г безводного карбоната натрия растворяют в дистиллированной воде до объема 1 л), раствор сульфата цинка в растворе хлорида натрия(10 г сульфата цинка и 50 г хлорида натрия растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 200 мл), раствор иодида калия (5 г иодида калия растворяют в 25 мл дистиллированной воды), 0,05 моль/л раствор тиосульфата, 3 %-ный раствор уксусной кислоты, 1 %-ный раствор крахмала. Оборудование:
стеклянные палочки, пробирки, колбы конические (объем 50 мл), воронки стеклянные, пипетки, капельницы, водяная баня, бюретки, штатив для пробирок, чашки, часы. Ход работы.
В две пробирки помещают по 1 мл раствора гидроксида калия. В одну из них (проба) добавляют также 0,1 мл вытяжек, а в другую (контроль) 0,1 мл дистиллированной воды. Затем вносят по Массовую концентрацию глюкозы (мг/мл) рассчитывают по формуле:
где А и В – массы глюкозы, определенные по таблице, в пробе и контроле; V – объем вытяжки, взятый для анализа. В основе метода лежит способность альдегидной группы лактозы в щелочной среде окисляться молекулярным йодом:
Избыточное количество йода, которое не вступило в реакцию, определяют титрованием тиосульфатом натрия, используя в качестве индикатора крахмал. Материалы и реактивы:
складчатые бумажные фильтры, молоко, 7 %-ный раствор сульфата меди, 2 %-ный раствор гидроксида натрия, 5 %-ный раствор фторида натрия, 0,05 моль/л раствор йода, Оборудование:
стеклянные палочки, пипетки градуировочные, колбы мерные (объем 50 мл), колбы конические с притертой пробкой (объем 100 мл), воронки стеклянные, бюретки, капельницы, часы. Ход работы.
В две мерные колбы вносят по 5 мл раствора сульфата меди, по 5 мл раствора гидроксида натрия и по 2,5 мл раствора фторида натрия. В одну из них (проба) добавляют 5 мл молока, в другую (контроль) – 5 мл дистиллированной воды, перемешивают и доводят дистиллированной водой до объема 50 мл, через 30 мин фильтруют. Затем в конические колбы переносят по 20 мл фильтрата пробы и контроля, вливают по 20 мл раствора йода и, непрерывно перемешивая, по 10 мл раствора гидроксида натрия. Тщательно закрывают. Через 20 мин к содержимому колб добавляют по 10 мл раствора соляной кислоты, по три капли раствора крахмала и титруют раствором тиосульфата натрия до исчезновения окраски, образовавшейся при добавлении крахмала. Массовую концентрацию лактозы в молоке (мг/мл) рассчитывают по формуле
где А и В – объемы раствора тиосульфата натрия, затраченные на титрование пробы и контроля; f – коэффициент поправки на титр 0,05 моль/л раствора тиосульфата натрия; Q – масса лактозы (18,01 мг), эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора тиосульфата натрия; V0
– общий объем пробы; V1
и V2
– объемы фильтрата и молока, соответственно, взятые для исследования. Все белки являются высокомолекулярными полипептидами. Простые белки (протеины) содержат только аминокислоты, а сложные (протеиды) – еще и неаминокислотные компоненты: гем, производные витаминов или углеводные компоненты (Приложения Е-К). Метод заключается в том, что устанавливают количество децинормального раствора щелочи, затраченное на титрование казеина, зная, что 1 мл децинормальной щелочи эквивалентен 0,11315 г казеина в молоке. Материалы и реактивы
:
складчатый бумажный фильтр; молоко цельное; 0,1 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина; 0,04 н раствор серной кислоты; 0,1 н раствор гидроксида натрия. Оборудование:
колбы мерные (объем 100 мл), колбы конические объемом от 200 до 250 мл, капельницы, воронки стеклянные, бюретка, часы. Ход работы:
1) в две колбы емкостью 200…250 мл отмерить по 20 мл из одной пробы исследуемого молока и добавить 80 мл дистиллированной воды; 2) в одну из колб прибавить из бюретки при постоянном перемешивании по каплям 0,04 н раствор H2
SO4
(приблизительно 23…28 мл) до появления хорошо заметных хлопьев казеина; 3) во вторую колбу влить из бюретки такое же количество серной кислоты, как и в первую колбу; 4) содержимое первой колбы отфильтровать в мерную колбу на 100 мл. В фильтрат пройдут через фильтр все составные части смеси, за исключением казеина и жира; 5) смесь во второй колбе (с казеином) оттитровать 0,1 н раствором NaOH с индикатором фенолфталеином (2-3 капли) до слабо-розового окрашивания; 6) 100 мл прозрачного фильтрата перелить в коническую колбу, прибавить 2-3 капли фенолфталеина и так же оттитровать 0,1 н раствором NaOH до слабо-розового окрашивания; 7) вычислить содержание казеина в молоке; 8) на нейтрализацию смеси во второй колбе пошло 14 мл 0,1 н раствора NaOH. На нейтрализацию 100 мл фильтрата из первой колбы без казеина пошло 10 мл 0,1 н NaOH. На нейтрализацию 55 мл фильтрата из колбы без казеина пошло 4 мл 0,1 н раствора NaOH: 55 - 4 61 - х х = 4,43 мл. Следовательно, на нейтрализацию казеина из 10 мл молока пошло: 10,0 – 4,43 = 5,57 мл 0,1 н раствора NaOH. Так как 1 мл 0,1 н раствора NaOH эквивалентен 0,11315 г казеина, то в 10 мл молока содержится: 0,11315·5,57=0,63 г. В 100 мл молока будет: 0,63·5=3,1 г казеина. Процентное содержание казеина в молоке: 3,1:1,030 = 3,01 %. Метод основан на том, что водный нейтральный раствор аминокислот в присутствии нейтрального формалина способен повышать кислотность с образованием соединений, в которых оба водорода аминогруппы замещены метильной группой.
Далее свободную группу COOH оттитровывают щелочью:
Материалы и реактивы:
молоко цельное; 1 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина (1 г фенолфталеина растворить в 70 мл этилового спирта и добавить 30 мл воды); нейтрализованный раствор формалина (приготовление: к 50 мл 30…40 %-ного формалина добавить 0,5 мл 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина и при перемешивании оттитровать 1 н раствором NaOH до слабо-розового окрашивания); 0,1 н раствор NaOH. Оборудование:
колба коническая (объем 100 мл), капельница, бюретка, стакан. Ход работы:
1) в колбу объемом от 50 до 100 мл отмерить пипеткой 10 мл молока, добавить 10 капель 1 %-ного спиртового раствора фенолфталеина, все размешать и оттитровать 0,1 н раствором щелочи до слабо-розового окрашивания, не исчезающего при взбалтывании; 2) в колбу добавить 2 мл нейтрализованного формалина, размешать (слабо-розовое окрашивание исчезнет); 3) в бюретке отметить уровень щелочи и содержимое колбы вновь оттитровать до такого же слабо-розового окрашивания (как в первый раз), не исчезающего при размешивании; 4) сделать отсчет по бюретке, показывающий количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшей на титрование смеси в колбе, и рассчитать содержание общего белка и казеина в молоке; 5) для установления содержания общего белка необходимо количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование после добавления формалина, умножить на коэффициент 1,94, а для определения казеина – на коэффициент 1,51. Пример
. После добавления формалина на титрование содержимого колбы пошло 1,7 мл 0,1 н раствора NaOH. Сколько общего белка и казеина в молоке? Содержание общего белка в молоке (%): 1,7×1,94=3,3. Содержание казеина (%): 1,7×1,51=2,57. Факторы, влияющие на точность анализа: а) неодинаковая интенсивность окраски при титровании до добавления формалина; б) качество формалина. Используйте только нейтральный и свежеприготовленный формалин! Метод основан на способности аминокислот реагировать с нейтральным раствором формальдегида с образованием метиленаминокислот. Этот метод применяется для определения карбоксильных групп аминокислот, которые титруют раствором щелочи, предварительно блокировав аминогруппы формальдегидом. Во время реакции с формальдегидом аминогруппа теряет основные свойства, при этом образуется метиленаминокислота, которая оттитровывается щелочью:
Определяя количество карбоксильных групп титрованием, можно одновременно определить и количество α-аминогрупп, так как количество карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных с формальдегидом α–аминогрупп. Материалы и реактивы
:
складчатый бумажный фильтр; сухой хлористый барий; 1 %-ная смесь аминокислот (вытяжка аминокислот из биологического материала); 0,1 %-ный спиртовый раствор фенолфталеина; 0,01 моль/л раствор соляной кислоты; 0,05 моль/л раствор гидроксида калия; формольная смесь (к 50 мл 40 %-ного раствора формальдегида добавляют 10 капель 0,1 %-ного раствора фенолфталеина и по каплям 0,1 моль/л раствор гидроксида калия до образования слабо-розовой окраски). Оборудование:
колбы мерные (объем 100 мл), капельницы, воронка стеклянная, бюретка, часы. Ход работы
.
К 25 мл смеси аминокислот в колбе прибавляют 1 г хлористого бария, 10 капель раствора фенолфталеина и перемешивают. К смеси приливают насыщенный раствор баритовой воды до появления едва заметного розового окрашивания. Колбу закрывают и оставляют на 15 минут. Затем разбавляют водой до объема 100 мл и отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр от фосфорнокислых и углекислых солей бария. Готовят две колбы объемом 100 мл. Массовую концентрацию аминокислот (мг/мл) рассчитывают по формуле:
где А и В – объемы раствора гидроксида калия, затраченные на титрование пробы и контроля, соответственно; f – коэффициент поправки на титр 0,05 моль/л раствора гидроксида калия; Q – масса аминокислот, эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора гидроксида калия (0,7 мл); V – объем раствора аминокислоты, взятый для анализа. Нарушение факторов, стабилизирующих структуру молекулы белка, приводит к осаждению белков. Так, при кипячении у большинства белков нарушаются связи, свойственные нативному состоянию молекулы. Лучший способ осаждения белков – кипячение в средах, имеющие значение pH, равное изоэлектрической точке белков. Внесение в раствор белка нейтральных солей (сульфата аммония, хлорида натрия и др.) облегчает и ускоряет осаждение при кипячении в результате возникающего дегидратирования белковых частиц. Минеральные и некоторые органические кислоты, органические растворители осаждают белки в результате денатурации и дегидратации белковых молекул, а также в результате образования комплексных солей белков с кислотами. Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами (танином, пикриновой, гексациановой, фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой, ферритовой кислотами и их солями) обусловлен образованием нерастворимых соединений этих реактивов с азотистыми группами белка. В таких соединениях алкалоидные реактивы являются анионами, а белки – катионами. Для придания молекуле белка положительного заряда раствор белка подкисляют уксусной кислотой. Соли тяжелых металлов (меди, ртути, цинка, серебра, свинца) осаждают белки в результате образования комплексных соединений с сульфогидрильными группами белков. Осадок белка в избытке солей некоторых тяжелых металлов (ацетата свинца, сульфата меди) растворяется. Это связано с тем, что избыток ионов этих металлов, адсорбируясь на поверхности белковых частиц, вызывает перезарядку белкового комплекса, в результате чего он переходит в раствор. В водном растворе большинство белков и их частиц (мицелл) заряжены и гидратированы, что обусловливает осаждение белков в растворах. Но при высокой концентрации средних солей (сульфата аммония, хлорида натрия), молекулы которых в водных растворах гидратированы, происходит разрушение водных оболочек белковых молекул. В результате этого снижается электрический заряд белковой молекулы адсорбирующимися на ней ионами соли, частицы белка слипаются друг с другом, укрупняются и выпадают в осадок. Материалы и реактивы:
1 %-ный раствор яичного белка; насыщенный раствор хлорида натрия; 10 %-ный раствор гидроксида натрия; концентрированная азотная и серная кислоты; 20 %-ный раствор сульфосалициловой кислоты; 10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 10 %-ный раствор пикриновой кислоты; насыщенный раствор танина; 1 %-ный раствор гесоцианоферрата калия (II); 0,1 %-ный раствор сульфата меди; 1 %-ный раствор ацетата меди; 96 %-ный раствор этилового спирта; 95 %-ный раствор ацетона; насыщенный раствор сульфата аммония; кристаллический сульфат аммония. Оборудование:
складчатые бумажные фильтры, стеклянные палочки, пробирки со штативом, капельницы, пипетки, пробирки центрифужные, воронки стеклянные, горелка, водяная баня. В пробирку вносят 2 мл раствора яичного белка и нагревают на кипящей водяной бане. Наблюдают образование осадка (свертывание белка). Чтобы сравнить зависимость осаждения белков от концентрации водородных ионов, в пять пробирок помещают по 5 мл раствора яичного белка. Нейтральный раствор белка в первой пробирке нагревают до кипения, он мутнеет, наблюдается опалесценция, обусловленная разрушением гидратной оболочки вокруг молекулы белка, и увеличение белковых частиц. Но мицеллы белка несут заряд и потому остаются в растворе, не попадая в осадок. Раствор во второй пробирке нагревают до кипения, вливают 1 мл раствора уксусной кислоты до слабокислой реакции. Через некоторое время белок выпадает в осадок. В этих условиях частицы теряют заряд, потому что значение pH среды близко к изоэлектрическому состоянию. В третью пробирку вносят 3 мл раствора уксусной кислоты для создания кислой реакции среды. При кипячении раствора осадок не образуется, так как молекулы белка приобретают положительный заряд, что повышает их устойчивость. В четвертую пробирку добавляют 5 мл раствора уксусной кислоты, 2 мл насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает белый осадок. Его образование обусловлено тем, что белок при взаимодействии с ионами хлорида натрия теряет свой заряд. В пятую пробирку вносят 2 мл раствора гидроксида натрия для создания щелочной среды. При кипячении жидкости осадок не образуется, так как в щелочной среде увеличивается отрицательный заряд белка. В одну из пробирок вносят 3 мл концентрированной азотной кислоты и по стенкам пробирки осторожно, чтобы жидкости не перемешивались, 3 мл раствора яичного белка. На границе раздела двух жидкостей образуется осадок в виде белкового кольца (проба Галлера). Содержимое перемешивают, доливают избыток азотной кислоты и убеждаются, что осадок не исчезает. В другую пробирку вносят 3 мл раствора яичного белка и осторожно по стенкам пробирки вливают 2-3 капли концентрированной серной кислоты. Выпадает осадок. Добавляют избыток серной кислоты и наблюдают растворение осадка. В две пробирки вносят по 5 мл раствора яичного белка. В одну добавляют 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а в другую – 1 мл раствора сульфосалициловой кислоты. В обоих случаях наблюдается выпадения осадка белка. В три пробирки вносят по 1 мл раствора яичного белка, по 0,5 мл раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую – раствора пикриновой кислоты, во вторую – насыщенного раствора танина, в третью – раствора гексоцианоферрата калия (II). Наблюдают выпадение осадка. При добавлении избытка раствора гексоцианоферрата калия (II) и раствора танина осадок растворяется. В две пробирки вносят по 3 мл раствора яичного белка, добавляют в первую – 2-3 капли раствора сульфата меди, во вторую – 2-3 капли раствора ацетата свинца. Наблюдают образование осадка (с солью меди – голубого цвета, свинца – белого цвета). При добавлении избытка раствора сульфата меди и ацетата свинца происходит растворение образовавшегося осадка. В две пробирки вносят по 3 мл раствора яичного белка. В первую – 3 мл этилового спирта, во вторую – 3 мл ацетона. Растворы в обоих случаях становятся мутными. Если к ним добавить по 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия, то через некоторое время белок выпадает в осадок. В пробирку вносят 3 мл раствора яичного белка и хлорид натрия до полного насыщения, через несколько минут в осадок выпадают глобулины. Смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр. В центрифужную пробирку вносят 3 мл яичного белка, 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и смесь перемешивают. Через К центрифугату добавляют при перемешивании кристаллический сульфат аммония до полного насыщения раствора, то есть до появления на дне пробирки кристаллов сульфата аммония. В этих условиях выпадают в осадок альбумины. Осадок альбуминов отделяют центрифугированием (3…5 мин при скорости 3000 об-1
). Фильтрат проверяют на осаждение белка по биуретовой реакции. Отрицательная биуретовая реакция свидетельствует об отсутствии белка, т.е. о полном осаждении белков из раствора. Метод диализа основан на способности малых по геометрическим размерам молекул (кристаллоидов) диффузно проникать через полупроницаемые мембраны, а макромолекул (коллоидов) – не проникать. Белки являются высокомолекулярными веществами и не диффундируют через полупроницаемые мембраны (например, коллодиевую или целлофановую пленки). Это свойство белков лежит в основе очистки белков от низкомолекулярных органических и молекулярных примесей. Материалы и реактивы:
целлофановый или коллодиевый мешочки; 1 %-ный раствор яичного белка; 1 %-ный раствор желатина, Оборудование:
стеклянные палочки, пробирки, капельницы, пипетки, диализатор (или стеклянный стакан объемом 0,5 л), штатив для пробирок. Ход работы.
Вначале с помощью биуретовой реакции определяют, содержит ли исследуемый раствор белок. Для этого к 10 каплям раствора белка добавляют три капли 10 %-ного раствора гидроксида натрия, одну каплю 1 %-ного раствора сульфата меди и полученную смесь тщательно перемешивают. Красно-фиолетовая окраска свидетельствует о наличии в растворе белка. Целлофановый (коллодиевый) мешочек наполняют на 1/3 объема 1 %-ным раствором исследуемого белка. Мешочек помещают в диализатор, заполненный дистиллированной водой (или в стеклянный стакан с водой), зажимая у верхнего края двумя стеклянными палочками, которые скреплены резиновыми колечками. Через 1,5 ч с диализатом (наружная жидкость) и используемой для диализа дистиллированной водой проводят реакцию на обнаружение хлоридов. Готовят две пробирки, в одну из них добавляют 1 мл дистиллированной воды, в другую – 1 мл диализата, затем по одной капле Для проверки содержания белка в первую пробирку добавляют Определение изоэлектрической точки белков основано на способности белков под действием осадителей, вызывающих дегидратацию белков, при значении pH среды, соответствующем их изоэлектрической точке, легко осаждаться. Материалы и реактивы
: 1 %-ные растворы казеина и желатина; 0,01, 0,1 и 1 моль/л растворы уксусной кислоты; 0,1 моль/л раствор ацетата натрия; 96 %-ный этиловый спирт (или 95 %-ный ацетон); дистиллированная вода. Оборудование
: стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив для пробирок. Ход работы.
В шесть пробирок помещают соответствующие количества (мл) растворов уксусной кислоты, ацетата натрия, дистиллированной воды и овальбумина (яичного белка) согласно данным таблицы 6. Содержание каждой пробирки перемешивают. Затем во все пробирки медленно по стенке доливают по 2 мл спирта (или ацетона). Через 30 мин определяют изоэлектрическую точку. Она будет соответствовать pH пробирки с максимальной степенью помутнения. Далее провести аналогичный опыт с желатином согласно данным таблицы 7. Таблица 6 – Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для образования значения рН при выявлении изоэлектрической точки Вода СН3
СООН (0,01 моль/л) CH3
COOH (0,1 моль/л) Раствор казеина (1 %-ный) рН среды 8,4 0,6 1,0 5,9 7,8 1,3 — 1,0 5,6 8,8 — 0,3 1,0 5,3 8,5 — 0,5 1,0 5,0 8,0 — 1,0 1,0 4,7 7,0 — 2,0 1,0 4,4 5,0 — 4,0 1,0 4,1 1,0 — 8,0 1,0 3,8 Таблица 7 – Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для образования рН при выявлении изоэлектрической точки желатина Вода CH3
COOH (0,1 моль/л) СН3
СООН (1 моль/л) CH3
COONa (0,1 моль/л) Раствор желатина (1 %-ный) рН среды 3,8 0,8 2,0 2,0 5,6 3,5 0,5 — 2,0 2,0 5,3 3,0 1,0 — 2,0 2,0 5,0 2,0 2,0 — 2,0 2,0 4,7 — 4,0 — 2,0 2,0 4,4 3,2 — 0,8 2,0 2,0 4,1 Оформить результаты в табличной форме (таблица 8). Таблица 8 – Отчетная таблица экспериментальных данных Реакции осаждения белков Яичный белок Растительный белок Осаждение нагреванием Осаждение минеральными Осаждение органическими Реактивы на алкалоиды Осаждение тяжелыми металлами (ацетат свинца и сульфат меди) Осаждение органическими Осаждение солями (NaCl) Осаждение сульфатом аммония Диализ солевого раствора белка Определение изоэлектрической точки белков Ферменты являются белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие фермента протекала бы крайне медленно. В отличие от химических катализаторов каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну. Таким образом, ферменты это реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами. Многие ферменты оказывают каталитическое действие на субстраты только в присутствии специфического термостабильного низкомолекулярного органического соединения – кофермента. В таких случаях холофермент (каталитически активный комплекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента (Приложение Н). Кофермент может быть связанным с апоферментом ковалентными и нековалентными связями. Термин «простетическая группа» относится к ковалентно связанному коферменту. К числу реакций, требующих присутствия кофермента, относятся: окислительно-восстановительные, переноса групп, изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5, 6). Реакции расщепления протекают в отсутствие коферментов (по системе IUB это классы 3 и 4). 4.1 Лабораторная работа «Определение активности амилазы Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала. Амилазная активность солода выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл вытяжки из солода при температуре 38 °С в течение 30 мин. В норме амилазная активность равна от 160 до 320 единиц активности. Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении – для определения амилазной активности солода. Резкое повышение амилазной активности в крови и моче (в 10–30 раз) наблюдается при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы. Материалы и реактивы:
вытяжка из солода зерновых, разбавленная в 10 раз; 0,1 %-ный раствор крахмала; 0,1 %-ный раствор йода в 0,2 %-ном растворе иодида калия. Оборудование:
штатив с пробирками, пипетки, капельницы, термостат. Ход работы.
В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз вытяжки, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают и 1 мл переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Разведение вытяжки в десяти пробирках составит: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240. Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по две капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет. Отметив, при каком разведении произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной вытяжки (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность вытяжки Например, желтый цвет появился в четвертой пробирке, где вытяжка разведена в 160 раз. Это количество вытяжки способно гидролизовать 2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной вытяжки в тех же условиях гидролизует 320 мл: Х = 2×160/1. Следовательно, амилазная активность равна 320. 4.2 Лабораторная работа «Определение активности каталазы
по Баху»
Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы, титрованием на него раствора KMnO4
. Реакция протекает по уравнению
1 мл 0,1 моль/л раствора перманганата калия соответствует 85 мг пероксида водорода. Материалы и реактивы:
препарат каталазы (1 г проростков солода ячменного растирают в фарфоровой ступке с 6 мл фосфатного буфера и фильтруют); 10 %-ный раствор H2
SO4
; 0,1 %-ный раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH=7,0 (35,0 мл 0,2 моль/л NaH2
PO4
в 13,6 мл 0,2 моль/л NaH2
PO4
); 0,1 моль/л раствор KMnO4
. Оборудование:
колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, термостат. Ход работы.
В две колбы вносят по 2 мл препарата каталазы, в одну из них (проба) прибавляют 1 мл 10%-ного раствора H2
SO4
, затем наливают по 2 мл раствора пероксида водорода в каждую колбу, ставят в термостат на 40 мин при температуре 38 °С. По истечении времени инкубации во вторую колбу (контроль) прибавляют 1 мл 10 %-ного раствора H2
SO4
и оба раствора титруют 0,1 моль/л раствором KMnO4
до появления стойкого розового окрашивания от излишка перманганата калия. Активность каталазы определяют по количеству разложенного пероксида водорода (мл) и рассчитывают по формуле:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||