работа студентки для 3 курсаа Бабской Евгении Михайловны Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. студентки 3 курса Бабской Евгении Михайловны “ Однонуклеотидные полиморфизмы PPAR-зависимых генов. Зависимость количества полиморфизмов от древности гена”. Тьютор: Алешин Степан Евгеньевич, аспирант 2 года ФББ 15 апреля 2008 г. /Алешин С.Е./ Содержание. 1. Введение…………………………………………………………………………….....4 1.1. SNP – однонуклеотидный полиморфизм ..........…………………………….........4 1.2. Пероксисом пролифератор-активирующие рецепторы...…………………..........6 1.2.1. Клинические фенотипы PPAR-зависимых генов............................................7 1.3. Однонуклеотидные полиморфизмы для генетики популяций и эволюционной биологии....................................................................................................9 2. Цели и задачи.................................................................................................................10 3. Методы и материалы..............................................................................................…...10 4. Результаты и обсуждение.............................................................................................11 4.1. Однонуклеотидные полиморфизмы генов выборки и всех генов человека.....11 4.2. Характеристика положения полиморфизмов в генах...………………………..14 4.3. Зависимость количества полиморфизмов от древности гена............................19 5. Выводы...........................................................................................................................21 6. Заключение………………………………………………………………………........22 7. Список литературы.......................................................................................................23 8. Приложение...................................................................................................................25 Список сокращений. SNP (ОНП) – однонуклеотидный полиморфизм. PPAR – пероксисом пролифератор-активирующие рецепторы. PPRE – пероксисом пролифератор-реагирующие элементы. NCBI – Национальный центр биотехнологической информации США. LD – неслучайное распределение (linkage disequilibrium). 1. Введение. 1.1. SNP – однонуклеотидный полиморфизм. Однонуклеотидный полиморфизм или SNP (произносится «снип»), представляет собой замену в последовательности ДНК, когда один нуклеотид, - А, Т, Г или Ц – в геноме (или другой последовательности) расходится между членами вида (или в паре хромосом для особи). Такой полиморфизм возникает в результате замены или потери отдельных нуклеотидов (Рис.1). В принципе, однонуклеотидные полиморфизмы могут быть би-, три-, и тетра-аллельными полиморфизмами. Однако, у человека, три-аллельные и тетра-аллельные полиморфизмы настолько редки, что, можно считать, что вообще не встречаются, поэтому под однонуклеотидными полиморфизмами часто понимают би-аллельные маркеры (или ди-аллельные) [1]. Однонуклеотидные полиморфизмы очень многочисленны, стабильны и рассредоточены внутри генома. Данный тип вариации связан с разнообразием в популяции, индивидуальностью, и, хотя большинство таких вариаций, возможно, не проявляются фенотипически, определенные полиморфизмы могут предрасполагать к заболеваниям, либо воздействовать на их остроту, прогрессирование, а также индивидуальные реакции на лечение. Они могут располагаться в кодирующих последовательностях генов, некодирующих регионах генов или в межгенных регионах. На молекулярном уровне, данные функциональные полиморфизмы могут влиять на человеческий фенотип вмешательством на обоих уровнях механизма синтеза белка: некодирующие полиморфизмы могут разрушать сайты связывания транскрипционных факторов, сайты сплайсинга и другие функционально важные сайты на транскрипционной уровне, в то время как кодирующие полиморфизмы могут становиться причиной аминокислотной замены и изменения функциональных или структурных свойств транслированного белка. Аннотирование проявления полиморфизма для индивидуального фенотипа должно быть сфокусировано на обоих уровнях: описание изменений свойств гена и белка. Замены в последовательности ДНК человека могут приводить к развитию заболеваний и нетипичным реакциям на: патогены, химикаты, лекарства, вакцины, а также другие факторы [2]. Однонуклеотидные полиморфизмы кодирующих последовательностей необязательно меняют аминокислотную последовательность закодированного белка. Полиморфизмы, обе формы которых формируют одну и ту же последовательность полипептидов называются синонимичными (иногда их еще называют молчащими мутациями), если же продуцируется другая полипептидная последовательность, их соответственно называют несинонимичными. Методы детекции и подсчета однонуклеотидных полиморфизмов многочисленны и разнообразны. На данный момент большинство процедур предполагают ПЦР-амплификацию нужного участка, дорогой и времязатратный процесс с ограниченными возможностями автоматизации и масштабирования [1]. В настоящее время эффективное использование однонуклеотидных полиморфизмов в генотипировании зависит от разработки дешёвых и эффективных способов их детекции. Практический интерес к однонуклеотидным полиморфизмам сильно возрос в ходе реализации проектов по определению полных нуклеотидных последовательностей ряда модельных организмов. Однонуклеотидных полиморфизмов в геноме человека огромное количество (3 - 10 миллионов распространенных однонуклеотидных полиморфизмов), никакой другой тип геномных различий не способен обеспечить такую плотность картирования. Такой тип маркеров, расстояние между которыми около 30 тысячи пар нуклеотидов, необходим для исследования природы полигенных заболеваний и признаков. Лишь при такой плотности появляется возможность путём сравнения больших выборок здоровых и больных индивидуумов, выявлять гены, участвующие в проявлении полигенных признаков, что позволит разработать стандартный подход к исследованию молекулярной природы предрасположенности к различным заболеваниям и предсказанию индивидуальной чувствительности к лекарственным средствам. Одной из первостепенных задач для генетиков является изолирование участков генома, для которых повышен риск появления заболевания, путем установления зависимости между генетическими изменениями и фенотипическими свойствами организма. Появление доступных полногеномных данных о полиморфизмах (таких, как однонуклеотидные полиморфизмы) подняло исследования о взаимосвязи генотипа и фенотипа на ранее недоступный уровень; характеристика и отбор полиморфизмов для исследований стали предметом повышенного интереса. Одним из методов отбора информативных полиморфизмов стало сравнение корреляции между ними (обозначенное термином «неслучайное распределение» (LD)), но данный метод сталкивается с проблемой смещения, в случае, когда сравниваются полиморфизмы разной частоты. В случае если сравниваются полиморфизмы примерно равной частоты, то выводы о корреляции между ними правомерны. По данному методу, полиморфизмы сравниваются внутри и вокруг гена, для получения всех корреляций между полиморфизмами на каждом участке. Последние исследования показали, что внутригенные участки имеют более высокий уровень LD, чем межгенные участки, а также было установлено, что вне генов рекомбинация происходит предпочтительно в 19 и 20 хромосомах человека [3]. Поскольку каталог полиморфизмов значительно упрощает исследования в ассоциативной генетике, позиционном клонировании, функциональном анализе и эволюционной биологии, возникает действительно серьезный интерес к обнаружению и распознаванию замен. В сотрудничестве с Национальным институтом генома человека США Национальный центр биотехнологической информации США (NCBI) создал базу данных dbSNP [4], (Рис.2). Полиморфизмы базы данных dbSNP в большинстве своем являются «кандидатами» на полиморфизмы, обнаруженными при помощи компьютерного анализа данных и не не подтвержденными экспериментально. Другими словами, полиморфизмы в dbSNP в большинстве своем вариации, обнаруженные, когда последовательности ДНК из небольшого количества клонов были сопоставлены при помощи компьютерного алгоритма. В основном это полиморфизмы генома человека. Менее 15 процентов однонуклеотидных полиморфизмов базы данных были проверены на полиморфность в какой-либо популяции. Еще по меньшему количеству были проведены генотипические исследования [5]. 1.2. Пероксисом пролифератор-активирующие рецепторы. Пероксисом пролифератор-активирующие рецепторы (PPAR) – семейство ядерных рецепторов, которые служат в качестве клеточных сенсоров жирных кислот и их остатков во многом регулирует обмен питательных веществ и гомеостаз энергии. Таким образом, PPAR выбраны идеальной целью для фармацевтической интервенции и использованы терапевтически, несмотря на то, что механизмы их действия не до конца выяснены. Три изотипа PPAR, α, ß и δ, по-разному экспрессируются в тканях и на разных стадиях развития. Однако все три связывают пероксисом пролифератор-реагирующие элементы (PPRE) в регуляторных регионах их генов-мишеней [6]. Недавно было показано, что PPAR-δ выступает как распространенный регулятор метаболизма липидов, что означает, что они, возможно, потенциальная цель для лечения ожирения и диабета 2 типа. Для того, чтобы идентифицировать полиморфные маркеры в потенциальных генах-кандидатах диабета второго типа, были построены последовательности PPAR-δ, включающие 1,500 пар оснований 5’-концевого региона. Девять полиморфизмов были найдены в PPAR- δ: четыре в интроне, один в 5’-концевой нетранслируемой области (UTR), и четыре в 3’-концевой нетранслируемой области [7]. 1.2.1. Клинические фенотипы PPAR-зависимых генов. На самом деле, большинство клинических фенотипов подразумевают значительную генетическую обусловленность, которая, свою очередь, проявляется спектром вариаций, в первую очередь однонуклеотидными полиморфизмами [1]. Так, в свою очередь, заболевания в генах, регулируемых PPAR, могут быть вызваны наличием в них полиморфизмов, что и было показано в ряде исследований. ACADM. Ген дегидрогеназы средней цепи ацетилкофермента А. Это митохондриальный флавопротеин, катализирующий первую реакцию бета-окисления жирных шести- и двенадцатиуглеродных кислот. Гомотетрамер, молекулярная масса 43, 700. Отсутствие белка клинически характеризуется нетерпимостью к голоду, эпизодической гипогликемией, ацидозом и комой. ACADM сильно изменчивый локус [8]. ACOX. Ген Ацетил кофермент А оксидазы. Цис-активирующие пероксисом пролифератор-реагирующие элементы были обнаружены в 5’-концевом отделе гена пероксид-продуцирующей оксидазы ацетил-кофермента А. Ацетил кофермент А оксидаза пероксисом – это первый фермент пути бета-оксиления жирных кислот, который катализирует реакцию превращения ацетил-кофермента А в 2-транс-еноил-соА [9]. Нарушением, приводящим к летальности, при недостатке пероксисомального ACOX, является так называемая псевдонеонатальная адренолейкодистрофия. А также, возбуждение данного фермента, продуцирующего пероксид водорода, может повлечь за собой окислительное разрушение ДНК и гепатоканцерогенез, являющийся результатом воздействия на пролифераторы пероксисом [10]. ADIPOQ. Адипонектин, полученный из жира белок плазмы, признан важным биомаркером метаболического синдрома. Некоторые распространенные полиморфизмы в регионах промотера, экзона и интрона 2, а также несколько несинонимичных мутаций в экзоне 3, в гене человеческого адипонектина были неоднократно рассмотрены в большом количестве исследований для различных этнических популяций для связи с фенотипическим проявлениями, такими как вес тела, метаболизм глюкозы, чувствительность к инсулину и риск диабета второго типа, а также болезнь коронарных артерий. Замена пролина 12 аланином также была показана, как фактор, влияющий на чувствительность к инсулину, при взаимодействии с генотипом адипонектина или на уровень адипонектина плазмы [11], (Рис.3). Более полная информация изложена в таблице 1. Название гена Заболевание ACADM врожденное отсутствие белка, характеризуется нетерпимостью к голоду, эпизодической гипогликемией, ацидозом и комой ACOX псевдонеонатальная адренолейкодистрофия ADIPOQ метаболический синдром ANGPTL4 несколько типов рака, два типа диабета APOA1 недостаток липопротеинов высокой плотности, болезнь Танжера (Tangier disease), системная ненервнопатическая амилоидная дистрофия APOAII недостаток A-II или гиперхолестеринемия APOCIII гипертриглицеридемия APOE дибеталипопротеонемия, гиперлипопротеинемия III типа HMGCS2 недостаток HMG-CoA LPL гиперлипопротеинемия, нарушения метаболизма липопротеинов LRP1 болезнь Альцгеймера PPARA гиперапобеталипопротеинемия PTGS2 эпителиальные опухоли SAT кератоз SLC10A2 нарушения всасывания желчных кислот Таблица 1. Заболевания, вызванные нарушениями в PPAR-зависимых генах ( Homo sapiens). Для того, чтобы более полно оценить однонуклеотидные полиморфизмы в настоящее время, следует рассматривать их в эволюционном контексте. Хотя вариации геномной ДНК появляются постоянно, около 100 новых единичных замен оснований на индивидуум, большинство человеческих полиморфизмов в настоящее время возникли гораздо позже видообразования, но до появления различных популяций. Также, необходимо учитывать небольшое количество (около 10‾8 замен на нуклеотид на поколение) и, фактически, случайную природу явления замены основания, которые вместе делают однонуклеотидные аллели довольно стабильными. Огромное количество разновидностей фенотипических вариаций сколько-нибудь интересных для изучения, обусловлено генетическими и негенетическими факторами (факторами окружающей среды), также как и взаимодействием двух или нескольких случайных событий. Таким образом, риск большинства распространенных заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания, психические заболевания, аутоиммунные состояния и диабет, может быть в большой степени вызван однажды приобретенными полиморфизмами, но они еще не определены. Также возможен комбинированный эффект набора полиморфных аллелей во множестве ключевых генов, а также факторов окружающей среды, которые вместе определяют наличие болезни. И термин «комплексное заболевание» часто используется для того, чтобы описать подобную ситуацию. Уровень такой комплексности может быть огромным. Например, количество включаемых генов может быть десять, несколько десятков или даже несколько сотен. В этих генах может быть множество разнообразных предрасполагающих к риску аллелей (аллельная гетерогенность). Разные или перекрывающиеся множества генов могут иметь значение для пораженных индивидуумов (локусная гетерогенность). Взаимодействие между генами может быть аддитивным, то есть при котором степень развития количественного признака определяется влиянием одного гена на работу другого, действующего сходным образом; синергическим, то есть суммирующим их работу; либо эпистатическим, то есть когда присутствие одного гена подавляет действие какого-либо гена, находящегося в другом локусе. Развивающиеся патологии могут быть количественными, а не бинарными признаками. На это накладывается эффект окружающей среды и взаимодействия с ним [1]. 1.3. Однонуклеотидные полиморфизмы для генетики популяций и эволюционной биологии. Основной каталог полиморфизмов чрезвычайно полезен для исследования эволюции генома. Исследования простираются от изучения динамики генов в популяции через взаимодействие эволюционных сил, таких как мутации, отбор, дрейф генов и миграции до исторических заключений о прошедших демографических или генетических событиях и их влиянии на современные популяции. В свою очередь, для того, чтобы понять историю и эволюцию популяции, обычно необходимо изучить большое количество полиморфизмов, в идеальном случае полного генома, для того чтобы минимизировать косвенное влияние, привнесенное вероятностной ошибкой или отбором на единичном локусе. 2. Цели и задачи. · Рассмотреть данные, которые предоставляют базы данных однонуклеотидных полиморфизмов и выбрать одну из баз для последующей работы с ней. · При помощи базы данных определить количество полиморфизмов в выбранных генах. · Детально рассмотреть характеристики полиморфизмов в генах выборки, сделать выводы относительно их появления и расположения. Показать важность однонуклеотидных полиморфизмов в развитии заболеваний, предопределенных генетически. · Установить зависимость между древностью гена и количеством полиморфизмов на его длину для выборки PPAR-зависимых генов. Сделать выводы о закономерности их появления и устойчивости. 3. Методы и материалы. Для выборки были взяты PPAR-зависимые гены, собранные в статье D. G. Lemay, D. H. Hwang, 2006. По ним, при помощи небольшой программы, вычисляющей количество полиморфизмов в каждом из них, были получены данные. Программа выглядит следующим образом: #!/usr/bin/perl -w use strict; use Data::Dumper; my $file = 'snp_result.txt'; open (SNP, $file); my %genes; while (<SNP>) { # finding mentions of gene accession numbers # they are between chr-pos and ctg-start # and in RefSeq format, like NW_001494128.1 if (m/chr-pos=.*\|\s*(\w\w_[\d\.]+)\s*\|.*ctg-start=/) { my $gene_id = $1; $genes{$gene_id}++; } } close SNP; print Dumper(\%genes); Данная программа работает с файлами вида: rs43704734 | Bos taurus | 9913 | snp | genotype=NO | submitterlink=YES | updated 2007-01-19 10:27 ss61497711 | BCM-HGSC | BTA-102243 | orient=+ | ss_pick=YES SNP | alleles='A/T' | het=? | se(het)=? VAL | validated=NO | min_prob=? | max_prob=? | notwithdrawn CTG | assembly=Btau_3.1 | chr=22 | chr-pos=54759533 | NW_001494128.1 | ctg-start=1040197 | ctg-end=1040197 | loctype=2 | orient=+ LOC | PPARG | locus_id=281993 | fxn-class=intron Такие файлы можно получить выбрав формат “flat file” в меню базы данных dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Программа запускается на сервере kodomo. Далее была вычислена длина каждого гена выборки, это необходимо для подсчета числа полиморфизмов на нуклеотид (Таблица 2 Приложения). Из той же базы были взяты данные о расположении полиморфизмов в генах (Таблица 3 Приложения). Для установления зависимости количества полиморфизмов на длину гена от древности гена были, в первую очередь, определены ортологи для каждого гена при помощи программы InParanoid (http://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgi) [12]. Для обработки полученной информации также потребовалось таксономическое дерево, полученное на сервере NCBI в базе данных Entrez Taxonomy (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=taxonomy) (Рис.4). 4. Результаты и обсуждение. По данным, полученным путем обработки содержимого базы dbSNP и занесенным в таблицы 1 и 2, были построены зависимости, показывающие некоторые особенности генов выборки, в частности, особенности содержащихся в них полиморфизмов. 4.1. Однонуклеотидные полиморфизмы генов выборки и всех генов человека. Если сопоставить диаграммы суммарных количеств однонуклеотидных полиморфизмов для выборки генов и для всех генов человека, без учета полиморфизмов, возникающих в интронах, то можно увидеть, что в обоих случаях в большинстве генов их число не превышает 300, а основная масса генов содержит от 1 до 60 полиомрфизмов. Это не может быть связано только с длиной гена, так как среди низко вариабельных генов имеются структуры превышающие числом остатков высоко вариабельные. Очевидно, существуют критерии стабильности гена, или же, напротив, некоторые предрасположенности их к полиморфности. Диаграмма 1.1. Характерное количество полиморфизмов для выборки PPAR-зависимых генов. Диаграмма построена по генам, разбитым на группы в соответствии с количеством содержащихся в них полиморфизмов. Диаграмма 1.2. Характерное количество полиморфизмов для генов человека. Диаграмма построена по генам, разбитым на группы в соответствии с количеством содержащихся в них полиморфизмов. Что касается процентного содержания полиморфизмов в исследуемых генах, то нетрудно заметить, что их число достаточно велико, в среднем оно составляет почти 0,83%, что вполне логично, учитывая, что в среднем на тысячу нуклеотидов появляется один полиморфизм (Диаграмма 2). Диаграмма 2. Характерные процентные отношения количества полиморфизмов к длине гена для исследуемых PPAR-зависимых генов. Для данной диаграммы распределения были получены процентные отношения количества полиморфизмов к длине гена для каждого из генов выборки. Далее гены были разбиты на подгруппы с разным процентным содержанием полиморфизмов. 4.2. Характеристика положения полиморфизмов в генах. Однако, для того, чтобы получить представление о проявлении полиморфизмов и их возможном влиянии на экспрессию гена, необходимо также рассмотреть в каких участках гена они располагаются, в каком количестве, и каким типом замен они являются: приводящим к замене аминокислоты на другую, на ту же самую (синонимичная), на стоп-кодон, или, например, приводящим к сдвигу рамки считывания. Диаграмма 3.1. Интронные полиморфизмы в выборке PPAR-зависимых генов. При построении данной диаграммы были использованы процентные отношения каждого типа замен ко всем полиморфизмам гена, для того, чтобы исключить различия, возникающие из-за разности длин исследуемых генов. По диаграмме 3.1, построенной по данным таблицы 3, видно, что наибольшее количество замен происходит в интронах генов, что неудивительно, так как интрон является транскрибируемым участком гена, не содержащим кодонов и удаляемым из молекулы РНК при ее процессинге, и лишь в редких случаях содержат открытые рамки считывания. Диаграмма 3.2. Характеристика полиморфизмов выборки PPAR-зависимых генов. Процентные соотношения количества полиморфизмов, дающих аминокислотную замену, замену аминокислоты на стоп-кодон и синонимичную замену аминокислоты для выборки PPAR-зависимых генов. Полиморфизмы, приводящие к аминокислотным заменам, встречаются практически в каждом гене, одним из исключений является ген SYCP3. Продуктом этого гена является белок синаптонемального комплекса, ДНК-связывающий белок, участвующий в профазе мейоза, что, скорее всего, и объясняет консервативность данного гена. Синонимичные замены, то есть такие замены нуклеотидов, при которых измененный кодон соответствует той же аминокислоте, не являются достаточно показательными для того, чтобы можно было сделать какие-либо выводы из такого рода распределения. Что касается замен, приводящих к появлению стоп-кодона (nonsense): замена G на A в триптофановом кодоне (UGG) приводит к появлению либо UAG, либо UGA; замена C на U в глютаминовых кодонах (CAA и CAG) приводит к появлению либо UAA, либо UAG. Появление UAG обозначается как " янтарная" мутация , UAA - " охровая ", а UGA - "опал". Такие мутации нарушают естественную экспрессию гена, его полное считывание становится невозможным, а, следовательно, последовательность белка нарушается. Такие замены, очевидно, очень редки. Диаграмма 3.3. Характеристика полиморфизмов выборки PPAR-зависимых генов. Процентные соотношения количества полиморфизмов, расположенных в 5’-концевой и 3’-концевой нетранслируемых областях (5’UTR и 3’UTR) мРНК для выборки PPAR-зависимых генов. Последовательности 5'UTR, как правило, способны образовывать сложные вторичные структуры типа "стебель-петля" и содержать короткие открытые рамки считывания, которые оказывают сильное влияние на эффективность трансляции мРНК. Помимо этого, 5'UTR могут включать в себя регуляторные последовательности, обеспечивающие регулируемую трансляцию мРНК (и координированную экспрессию соответствующих генов). Этим и объясняется то, что полиморфизмы этого участка редки и немногочисленны. 3'UTR-концевой участок может оказывать влияние на состояние рибосом после терминации синтеза полипептидных цепей, число полиморфизмов в нем может достигать 30% всех замен гена. Диаграмма 3.5. Характеристика полиморфизмов выборки PPAR-зависимых генов. Процентные соотношения количества полиморфизмов, приводящих к сдвигу рамки, для выборки PPAR-зависимых генов. Также определенный интерес представляет ген LRP1, насчитывающий 6 замен, приводящих к сдвигу рамки. Этот ген кодирует альфа-2-макроглобулиновый рецептор (связывающий липопротеины низкой плотности). Это белок содержит большое количество сайтов связывания лигандов, каждый длиной около 40 оснований, в регионах богатых повторами цистеина. Из многочисленных полиморфизмов данного гена лишь один ведет к замене данного основания. Наличие замен приводящих к сдвигу рамки можно объяснить тем, что существует четыре различных гена, кодирующих данный белок, а также тем, что семейство рецепторов, связывающих липопротеины низкой плотности, насчитывает семь рецепторов, в состав которых входит несколько типичных функциональных доменов. Сходным образом можно объяснить появление полиморфизма, приводящего к сдвигу рамки для гена AQP7: этот ген имеет сходные последовательности с AQP3 и AQP9, а следовательно их продукты могут быть взаимозаменяемы. Появление полиморфизмов в различных участках гена спонтанно, но когда появление полиморфизма нарушает функцию экспрессируемого белка или нарушает саму его экспрессию, как при появлении стоп-кодона, функционирование клетки затрудняется, а в некоторых случаях становится невозможным. Если ни одна из систем регуляции организма не сумеет обнаружить подобную замену, то она может привести к развитию заболевания, которое, возможно, будет передаваться по наследству. 4.3. Зависимость количества полиморфизмов от древности гена. Еще одним объяснением высокой полиморфности гена может быть его «новизна». Если найти ортологи всех генов выборки и проследить их таксономическое распространение, то можно определить относительную древность гена (Рис.4). Так, гены, встречающиеся в большом количестве далеких друг от друга видов, очевидно, более древние, нежели те, которые встречаются внутри одного семейства, отряда или класса. При использовании данного метода, гены исследуемой выборки были отсортированы по возрастанию древности. Для такой выборки был построен график процентных содержаний полиморфизмов. Диаграмма 4. Зависимость процентного содержания полиморфизмов от древности гена для выборки PPAR-зависимых генов. Относительная древность генов была установлена при рассмотрении распространения их ортологов внутри таксонов. Наиболее древним считался ген, ортологи которого находились в самом эволюционно древнем таксоне. Таким образом, гены были отсортированы по убыванию древности по группам, показанным в таблице 4. Каждой группе в соответствие был поставлен средний процент полиморфизмов на длину гена, характерный для генов этой группы. простейшие rCAT hACADM hAQP7 rACSL1 rMCD rACAA1 hHMGCS2 hSCARB1 hFADS2 hANGPTL4 hLIPA hUGT2B4 нематоды hCPT1 hCYP27 hNR1D1 hLRP1 hCAV1 hLXRa rCPT1a hPLTP hSULT2A1 членистоногие rPLA2G2A hADFP hTF рыбы hSLC10A2 rRBP2 rCYP8B1 hPPARA hADIPOQ hLPL hAPOE hPTGS2 земноводные hAPOA1 млекопитающие hAPOCIII Таблица 4. Таксономические группы генов выборки. Гены были разбиты на группы в соответствии с возникновением организмов, в которых были найдены их ортологи. Наиболее древними гены считаются те, ортологи которых были найдены в амебах, наиболее новыми считаются те, ортологи которых ищутся только среди млекопитающих. Можно заметить, что в самых новых генах содержится максимальное число полиморфизмов (около 4,6%), а в самых древних и основное части оно колеблется около 0,5%. Это можно объяснить, с одной стороны тем, что древность гена подразумевает устоявшуюся функцию, для поддержания которой необходима стабильность и неподверженность спонтанным мутациям, приобретенные в ходе эволюции. Но с другой стороны, большая вариабельность последовательностей новых генов является платформой для возникновения новых модификаций белков, лиганд-связывающих сайтов, комплексных функций, выполняемых экспрессирующимися белками, – своеобразным локальным двигателем естественного отбора. 5. Выводы. · Наиболее полной и удобной базой данных для работы с однонуклеотидными полиморфизмами является dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). · Количество полиморфизмов в генах выборки и во всех генах человека редко превышает 300 замен, среднее число полиморфизмов на длину гена около 0,83%. · Полиморфизмы делятся на несколько групп в связи с их типом: синонимичные замены, несинонимичные, замены на стоп-кодон; также расположение полиморфизмов в гене часто указывает на их особую функцию. Детальное изучение характеристики полиморфизмов показало, что расположение и проявление полиморфизмов в большинстве случаев связано с функцией участка гена, в котором он находится, особенностью белка данного гена, или же комплексом взаимодействий, происходящих в организме. · Была установлена обратная зависимость между процентным содержанием полиморфизмов в генах и их древностью, сделаны выводы о консервативности наиболее древних генов и высокой вариабельности новых. 6. Заключение. Однонуклеотидные полиморфизмы исследованной выборки PPAR-зависимых генов подчиняются общим законам появления и распределения данных замен. Характерные нарушения данных генов, в связи с появлением полиморфизмов, зачастую приводят к развитию тяжелых заболеваний или другим отклонениям в работе организма. Важность изучения однонуклеотидных полиморфизмов неоспорима: новые методы детекции замен, исследование эволюции и фенотипических проявлений полиморфизмов могут стать основой для фармацевтических разработок и важных открытий в области исследования таких заболеваний, как диабет, болезнь Альцгеймера, рак и ожирение. Появление в настоящее время большого числа проектов, посвященных изучение генома человека, таких как HAPMAP (http://snp.cshl.org/), а также баз данных полиморфизмов и многих других вспомогательных ресурсов, содержащих информацию о генетическом материале, значительно ускоряет процесс появления новых технологий в медицине и позволяет исследованиям подниматься на все более новые уровни. Список литературы. 1. Anthony J. Brookes. The essence of SNPs. Gene 234; 1999; 177–186 2. Joke Reumers, Lucia Conde, Ignacio Medina, Sebastian Maurer-Stroh, Joost Van Durme, Joaquin Dopazo, Frederic Rousseau and Joost Schymkowitz. Joint annotation of coding and non-coding single nucleotide polymorphisms and mutations in the SNPeffect and PupaSuite databases. Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, Database issue 3. Michael A. Eberle , Mark J. Rieder, Leonid Kruglyak, Deborah A. Nickerson. Allele Frequency Matching Between SNPs Reveals an Excess of Linkage Disequilibrium in Genic Regions of the Human Genome. PLoS Genet 2(9): e142. DOI: 10.1371/journal.pgen.0020142 4. Stephen T. Sherry, Minghong Ward, and Karl Sirotkin. Use of Molecular Variation in the NCBI dbSNP Database. Hum Mutat 15:68–75, 2000. 5. 2001 Nature Publishing Group http://genetics.nature.com 6. Danielle G. Lemay and Daniel H. Hwang. Genome-wide identification of peroxisome proliferator response elements using integrated computational genomics. J. Lipid Res. 2006. 47: 1583–1587. 7. Hyoung Doo Shin, Byung Lae Park, Lyoung Hyo Kim, Hye Seung Jung, Young Min Cho, Min Kyong Moon, Young Joo Park, Hong Kyu Lee, and Kyong Soo Park. Genetic Polymorphisms in Peroxisome Proliferator–Activated Receptor – δ Associated With Obesity. Diabetes 53: 847–851, 2004 8. J. R. Kidd, Y. Matsubara, C. M. Castiglione, K. Tanaka, K. K. Kidd. The Locus for the Medium-Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Gene on Chromosome 1 Is Highly Polymorphic. GENOMICS 6.89-93 (1990) 9. Usha Varanasi, Ruiyin Chu, Qin Huang, Raquel Castellon, Anjana V. Yeldandi, and Janardan K. Reddy. Identification of a Peroxisome Proliferator-responsive Element Upstream of the Human Peroxisomal Fatty Acyl Coenzyme A Oxidase Gene. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 271, No. 4, Issue of January 26, pp. 2147–2155, 1996 10. Usha Varanasi, Ruiyin Chu, Su Chu, Rafael Espinosa, M. M. Lebeau, J. K. Reddy. Isolation of the human peroxisomal acyl-CoA oxidase gene: Organization, promoter analysis, and chromosomal localization . Biochemistry, April 1994 . 11. Wei-Shiung Yang, Lee-Ming Chuang. Human genetics of adiponectin in the metabolic syndrome. J Mol Med (2006) 84: 112–121. 12. Kevin P. O'Brien, Maido Remm1 and Erik L. L. Sonnhammer. Inparanoid: a comprehensive database of eukaryotic orthologs. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33 . 7. Приложение. Рис.1 Однонуклеотидный полиморфизм. На рисунке приведен пример замены основания тимина на цитозин, приводящей к замене комплементарного основания. Выделено однонуклеотидное различие в последовательностях ДНК. (David Hall, 2007-07-06). . Рис 2. Главная страница базы данных dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Записи базы содержат информацию о последовательности вокруг полиморфизма, описание популяции, содержащей вариацию и часто информацию о генотипе популяции или индивида. Поиск проводится по идентификатору гена для выдачи всех содержащихся в нем полиморфизмов, либо по id отдельного интересующего полиморфизма. Рис 3. Структура гена адипонектина человека и распределение обычных полиморфизмов и редких мутаций, описанных в исследованиях генетических связей данного гена [11]. Рис.4. Таксономическое дерево видов, в которых были обнаружены ортологи исследуемых генов, полученное при помощи сервера NCBI, Taxonomy Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=taxonomy). Идентификатор гена Идентификатор dbSNP Суммарное количество SNP Длина гена Процент SNP на долю гена hACADM NT_032977.8; NW_921351.1 224 38901 0,575820673 hACOX NT_010641.15; NW_926918.1 184 37851 0,486116615 hADFP NT_008413.17; NW_924062.1 53 11814 0,448620281 hADIPOQ NT_005612.15; NW_921807.1 100 15789 0,633352334 hANGPTL4 NT_077812.2; NW_927173.1 58 10246 0,566074566 hAPOA1 NT_113960.1; NW_925173.1; NT_079596.2; NT_033899.7 68 1869 3,638309256 hAPOE NW_927217.1; NT_011109.15 54 3611 1,495430629 hAQP7 NW_927964.1; NT_008413.17; NW_924062.1 269 14893 1,806217686 hCPT1 NT_032977.8; NW_921351.1; NT_019546.15; NW_925395.1; NT_033903.7; NW_925106.1 595 87217 0,682206451 hCYP1A1_01 NW_925907.1; NT_010194.16 1 hFADS2 NT_033903.7; NW_925106.1 209 39112 0,534362855 hHMGCS2 NW_922462.1; NT_019273.18 92 20516 0,448430493 hLPL NT_079596.2; NW_001030907.1; NT_113801.1; NT_030737.9; NW_923907.1 202 28188 0,716617 hLRP1 NT_029419.11; NW_925395.1 398 84860 0,469007778 hLXRa NW_925006.1; NT_009237.17 55 9663 0,569181414 hPPARA NW_927650.1; NT_011523.11 550 93154 0,590420164 hPTGS2 NT_004487.18; NW_926128.1 137 8587 1,59543496 hSAT NW_927700.1; NT_011757.15; NW_925173.1 65 3023 2,150181938 hSCARB1 NT_009755.18; NW_925395.1 457 86345 0,529272106 hSLC10A2 NT_009952.14; NW_925517.1 168 22846 0,735358487 hSULT2A1 NT_011109.15; NW_927217.1 207 15723 1,316542645 hUGT2B4 NT_077444.3; NW_922162.1 192 15743 1,219589659 Идентификатор гена Идентификатор dbSNP Суммарное количество SNP Длина гена Процент SNP на долю гена mANGPTL4 NT_039649.7; NW_001030615.1; NT_039662.2 55 10246 0,536794847 mAQP7 NT_166289.1; NW_001030740.1 44 17569 0,250441118 mLPL NW_001030897.1; NW_001030907.1; NT_039462.7; NT_165766.1; NT_111920.1 252 26377 0,955377791 mLXRa NW_001471707.1; NW_925006.1; NT_009237.17 mMC2R NW_001037590.1; NW_001030635.1; NT_039674.7 155 22352 0,693450251 mPLIN NT_039428.7; NW_001030863.1 12 11007 0,109021532 mRETN NT_039455.7; NW_001030882.1 23 2307 0,996965756 mSCD1 NW_001030643.1; NT_039687.7 80 13098 0,610780272 mSLC27A1 NW_001030897.1; NT_039462.7 150 17781 0,843597098 mSORBS1 NW_001030750.1; NW_001030694.1; NW_001030740.1; NW_001030643.1; NT_039687.7 1586 221772 0,715148892 mUCP1 NW_001030416.1; NT_078575.6; NW_001030904.1 108 7690 1,404421326 Идентификатор гена Идентификатор dbSNP Суммарное количество SNP Длина гена Процент SNP на долю гена rACAA1 NW_047803.1; NW_001084876.1 32 8790 0,364050057 rACSL1 NW_047473.1; NW_001084718.1 18 44524 0,040427635 rAPOA5 NW_047799.2; NW_001084873.1 10 2239 0,446627959 rCAT NW_047657.2; NW_001084813.1 16 32135 0,049789949 rCPT1a NW_047563.2; NW_001084774.1 8 60223 0,013283961 rCYP8B1 NW_047803.1; NW_001084876.1 10 1970 0,507614213 rMCD NW_001084744.1; NW_047536.2 10 15823 0,06319914 rPLA2G2A NW_047726.2; NW_001084844.1 6 3067 0,19563091 rRBP2 NW_047375.1; NW_001084876.1; NW_047801.1; NW_001084677.1 6 20310 0,029542097 rSLC2A2 NW_001084800.1; NW_047625.2 4 29443 0,013585572 hCPT2 NT_032977.8; NW_921351.1 82 17766 0,461555781 hLIPA NW_924573.1; NT_030059.12; NT_033903.7; NT_035014.4; NW_924884.1; NW_925106.1 315 38331 0,821789152 hCYP27 NW_921618.1; NT_005403.16 147 33310 0,441308916 hTF NT_005612.15; NT_032977.8; NW_921807.1; NW_921795.1 443 32400 1,367283951 Идентификатор гена Идентификатор dbSNP Суммарное количество SNP Длина гена Процент SNP на долю гена hCAV1 NT_079596.2; NT_007933.14; NW_923640.1 201 36391 0,552334368 hINSIG1 NT_079596.2; NW_923796.1; NT_034885.3 97 12403 0,782068854 hPLTP NW_927339.1; NT_011362.9 145 13389 1,082978564 hNR1D1 NW_926828.1; NT_010755.15 36 7932 0,453857791 mHGF NW_001030802.1; NT_165760.2; NW_001030784.1; NT_039340.7 1607 65889 2,438950356 Таблица 2 . Количественные характеристики однонуклеотидных полиморфизмов выборки PPAR-зависимых генов. Ген Замена АК (missense) Замена на стоп-кодон (nonsense) Синонимичная замена UTR 5' UTR 3' Около 5'-конца гена Около 3'-конца гена Сдвиг рамки Интрон FADS2 0 0 3 1 12 7 4 0 184 UGT2B4 6 0 4 0 4 7 26 0 145 SAT1 5 0 1 3 3 31 6 0 19 LRP1 39 0 48 2 6 16 3 6 312 HMGCS2 2 0 4 1 0 0 7 0 79 PPARA 7 0 4 5 75 23 3 0 467 NR1H3 2 0 5 1 5 11 2 0 29 ANGPTL4 9 0 6 3 10 2 3 0 26 AQP7 14 0 6 2 2 7 27 3 280 ADFP 3 0 4 1 1 4 10 0 30 SLC10A2 1 0 3 4 12 3 3 0 142 PTGS2 6 0 10 6 39 5 16 0 55 CYP1A1 19 0 3 0 15 5 22 1 31 ACOX1 10 1 11 0 17 2 3 0 155 SULT2A1 4 0 3 0 10 2 10 0 78 APOC3 0 0 1 0 5 39 3 0 64 APOE 18 0 5 0 0 14 1 0 16 LPL 9 1 5 1 20 7 4 0 154 SCARB1 5 0 5 0 7 0 14 1 452 ACADM 4 0 2 0 4 9 2 1 202 APOA1 11 0 6 0 1 7 30 0 20 CHPT1 1 0 2 2 0 9 1 0 108 SYCP3 0 0 0 0 1 0 9 0 1 Таблица 3. Характеристика полиморфизмов в выборке PPAR-зависимых генов. Данные для таблицы получены в базе данных dbSNP и разбиты на категории в связи с их особенностью: полиморфизмы, приводящие к аминокислотной замене, к замене аминокислоты на стоп-кодон, синонимичной замене, полиморфизмы 5’-концевой и 3’-концевой нетранслируемых областей мРНК, расположенные около 5’ и 3’-концов, приводящие к сдвигу рамки и полиморфизмы в интронах генов.