Главная Учебники - Разные Лекции (разные) - часть 18
поиск по сайту правообладателям
|
Содержание.
Введение 2 стр. Глава 1. Строение вирусов. 4 стр. Глава 2. Разнообразие вирусов. 8 стр. Глава 3. Биологическая роль вирусов. 11 стр. Заключение. 14 стр. Список литературы. 15 стр. Приложение. 16 стр. Введение.
"Вирус - это, по существу, часть клетки. Мы считаем вирусами те компоненты клетки, которые достаточно независимы для того, чтобы передаваться другим клеткам, и сравниваем их с другими клеточными компонентами, более прочно связанными со всей системой." В 1852 г. русский ботаник Д.И. Ивановский впервые получил инфекционный экстракт из растений табака, пораженных мозаичной болезнью. Когда такой экстракт пропустили через фильтр, способный задерживать бактерии, отфильтрованная жидкость все еще сохраняла инфекционные свойства. В 1898 г. голландец Бейеринк придумал новое слово "вирус"
(от латинского слова, означающего "яд"), чтобы обозначить этим термином инфекционную природу некоторых профильтрованных растительных жидкостей. Хотя удалось достичь значительных успехов в получении высокоочищенных проб вирусов и было установлено, что по химической природе это нуклеопротеины (нуклеиновые кислоты, связанные с белками), сами частицы все еще оставались неуловимыми и загадочными, потому что они были слишком малы, чтобы их можно было увидеть с помощью светового микроскопа. Поэтому-то вирусы и оказались в числе первых биологических структур, которые были исследованы в электронном микроскопе сразу же после его изобретения в 30-е годы прошлого столетия. Наиболее правдоподобной и приемлемой является гипотеза о том, что вирусы произошли из "беглой" нуклеиновой кислоты, т.е. нуклеиновой кислоты, которая приобрела способность размножаться независимо от той клетки, из которой она возникла, хотя при этом подразумевается, что такая ДНК размножается с использованием (паразитическим) структур этой или других клеток. Таким образом, вирусы, должно быть, произошли от клеточных организмов, и их не следует рассматривать как примитивных предшественников клеточных организмов. [www.medicinform.net] Вирусы отличаются от микроорганизмов следующими особенностями: 1) они содержат нуклеиновую кислоту только одного типа – или ДНК, или РНК; 2) для их репродукции необходима только нуклеиновая кислота; 3) они не способны размножаться вне живой клетки. Вирусы, таким образом, не являются самостоятельными организмами, а используют для своего размножения живые клетки: их репродукция происходит в клетке-хозяине. Клеточные механизмы нужны как для репликации нуклеиновой кислоты, так и для синтеза белковой оболочки вируса. Развитие вируса приводит к гибели клетки-хозяина. Вне клетки вирус существует в виде вирусной частицы (вириона), которая состоит из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки – капсида. Поэтому вирусную частицу называют также нуклеокапсидом. [Шлегель, 1987] В то же время внутриклеточный вирус есть самореплицирующаяся форма, не способная к бинарному делению. Тем самым в определение вируса закладывается принципиальное различие между клеточной формой, воспроизводящейся только из вирусной нуклеиновой кислоты. Однако качественное отличие вирусов от про- и эукариот не ограничивается только одной этой стороной, а включает ряд других: 1) наличие одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК); 2) отсутствие клеточного строения и белоксинтезирующих систем; 3) возможность интеграции в клеточный геном и синхронной с ним репликации. Вместе с тем вирусы отличаются от обычных репликонов, какими являются молекулы ДНК всех микроорганизмов и любых других клеток, а также плазмид и транспозонов, поскольку упомянутые репликоны являются биомолекулами, которые нельзя отнести к живой материи. [Борисов и др., 1994] Вирусы распознаются по последствиям своего развития в клетках хозяина. Они разрушают целые комплексы клеток и вызывают поражения тканей, что ведет к появлению некротических пятен или зон лизиса. Обычные хозяева вирусов – это растения, животные и микроорганизмы. [Шлегель, 1987] Глава 1. Строение вирусов.
Вирусная частица, называемая также вирионом, состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной белковой оболочкой. Эту оболочку называют капсидом. Такая единица (капсид + нуклеиновая кислота = нуклеокапсид) может быть «голой», а в других случаях окружена оболочкой. Голым нуклеокапсидами являются, например, частицы вируса табачной мозаики, вируса, вызывающего бородавки, и аденовируса. Дополнительная оболочка окружает вирусы гриппа и герпеса. Капсид в свою очередь состоит из субъединиц – капсомеров. Он чаще всего имеет симметричное строение. Различают два вида симметрии – спиральную и кубическую. В таблице 1 различные вирусы сгруппированы по их структуре. Таблица 1. Морфологические классы вирусов.
Спиральная структура
Нуклеиновая кислота
Голые капсиды
Капсиды с оболочкой
РНК Вирус табачной мозаики РНК и многие другие вирусы растений Миксовирусы: вирусы гриппа, вирусы парагриппа (свинка, корь) ДНК Колифаг fd Полиэдрическая структура (икосаэды)
РНК Пикорнавирусы: вирусы РНК ящура, ЕСНО, полиомиелита, реовирусы Ретровирусы (онкогенные): вирусы саркомы, лейкозов, карциномы. Кольцевая ДНК Паповавирусы (онкогенные, РНК): вирусы папилломы, полиомы, SV 40 Тогавирусы: вирус лесов Семлики, вирусы энцефалита, желтой лихорадки Одноцепочечная кольцевая ДНК Колифаги ǿХ 174, М13 Вирусы простого герпеса, опоясывающего лишая, ветряной оспы, вирус Эпштейна – Барр (инфекционного мононуклеоза) Сложные вирусы (икосаэдрическая головка + спиральный хвост)
ДНК Большие бактериофаги (Т 2, Т 4, Т 6) Сложные вирионы
ДНК Вирусы оспы, коровьей оспы Рассмотрим четыре вируса, которые известны как возбудители болезней: два вируса со спиральной симметрией, из них один с голыми частицами (вирус табачной мозаики) и один с дополнительной оболочкой (вирус гриппа), и два типа вирусов с кубической симметрией – с голыми частицами (вирус полиомиелита и другие полиэдрические вирусы) и с оболочкой (вирус герпеса). Вирус табачной мозаики.
Это типичный пример вируса со спиральной симметрией. Его легко выделить из выжатого сока зараженных растений. Частицы представляют собой палочки толщиной 18 нм. Этот палочковидный нуклеокапсид состоит примерно из 2100 капсомеров. Они расположены по винтовой линии и образуют полый цилиндр. Каждый капсомер состоит из одной полипептидной цепи (158 аминокислот, последовательность которых определена). В стенке полого цилиндра между капсомерами помещается цепь РНК, которая тоже идет по винтовой линии. Вирус гриппа.
Частицы вируса гриппа имеют диаметр 110 нм. Нуклеокапсид, как и у вируса табачной мозаики, имеет спиральное строение, но он не палочковидный, а многократно закрученный. Нуклеокапсид окружен оболочкой – фрагментом мембраны клетки-хозяина, из которой вышел вирион. Оболочка имеет на своей наружной стороне шипы, которые служат для адсорбции вириона на поверхности новой клетки-хозяина и содержат мукопротеины и фермент нейраминидиазу. Этот фермент отщепляет от мукопротеинов инфицируемой клетки один компонент – N-ацетилнейраминовую кислоту – и, по-видимому, играет роль в разжижении слизи, покрывающей эпителиальные клетки носоглотки. Размножение вируса происходит внутри клеток. Освобождение вириона напоминает процесс почкования; при этом наружная оболочка вирусной частицы образуется из мембраны клетки-хозяина, которая может быть модифицирована добавлением белков вирусного происхождения (например, нейраминидазы). Существует много различных разновидностей вируса гриппа. Какую именно ткань будет поражать вирус, зависит от специфичности вируса по отношению к клеткам-хозяевам и от рецепторных свойств клеток. Вирус может вызывать нарушение клеточного метаболизма или даже гибель клетки. Кроме того, он действует как антиген и стимулирует образование антител в организме хозяина. Вирусы, ответственные за большие эпидемии гриппа, отличаются друг от друга по своей вирулентности и патогенности. Полиэдрические вирусы без наружной оболочки.
Многие вирусы, кажущиеся сферическими, на самом деле имеют форму многогранника. Чаще всего это икосаэдр (двадцатигранник) – тело, ограниченное 20 равносторонними треугольниками и имеющее 12 вершин. Капсид икосаэдрического вируса состоит из капсомеров двух типов: в вершинах располагаются пентоны, состоящие из пяти белковых мономеров (протомеров); остальную поверхность граней и ребра образуют гексоны, состоящие из шести протомеров. Построение капсида из капсомеров следует законам кристаллографии; в соответствии с этим наименьший икосаэдрический капсид должен состоять из 12 пентонов, следующий по величине – из 12 пентонов и 20 гексонов. Существуют вирусы из 252 и даже 812 капсомеров. По принципу икосаэдра построено очень много вирусов: вирусы полиомиелита, ящура, аденовирусы. Полиэдрические вирусы с наружной оболочкой.
Икосаэдр, окруженный оболочкой, - такова форма возбудителей ветряной оспы, опоясывающего лишая и простого герпеса. Икосаэдрический капсид вируса герпеса состоит из 162 капсомеров. Наружная оболочка, несомненно, образуется из внутренней ядерной мембраны клетки-хозяина. Вирусы герпеса размножаются в ядрах клеток; капсиды новых вирусных частиц одеваются оболочкой из ядерной мембраны, «отпочковываются» от ядра и выводятся наружу по системе эндоплазматического ретикулума. Ветряная оспа – относительно легкая детская болезнь. Вирус инфицирует верхние дыхательные пути, разносится кровью по всему телу и, закрепляясь в коже, в конечном счете вызывает здесь образование пузырьков. Опоясывающий лишай возникает у частично иммунных лиц; он появляется в результате реактивации вируса ветряной оспы. Таким образом, оба заболевания вызываются одним и тем же вирусом. Вирус оспы.
Вирусы оспы – наиболее крупные из зоопатогенных вирусов. Их частицы устроены совсем не так, как у вирусов четырех представленных выше типов. Они содержат ДНК, белок и несколько липидов, из-за чего их иногда называют комплексными вирионами. Частицы вирусов натуральной оспы и коровьей оспы имеют вид округленных блоков. Они состоят из внутреннего тельца, содержащего двухцепочечную ДНК, двойного слоя, содержащего белок, эллиптических белковых телец и наружной мембраны; частицу обвивают плотно прилегающие к ней нити. Эти вирусные частицы очень устойчивы к высыханию и поэтому чрезвычайно инфекционны. Натуральной оспой могут заболевать только люди и обезьяны. Вирусом коровьей оспы могут заражаться также коровы, кролики и овцы. Оба вируса имеют общие антигены. Поэтому людям профилактически прививают вирус коровьей оспы, который получают от коров и который у человека вызывает весьма слабые симптомы болезни. Такая активная вакцинация приводит к образованию антител, которые обуславливают иммунитет и к натуральной оспе. Морфология бактериофагов.
Строение бактериофагов в основном изучали на примере серии Т Escherichia coli. Колифаг Т 2 состоит из полиэдрической головки длиной 100 нм и отростка, или «хвоста», примерно такой же длины. Поэтому говорят о «составных» вирусах. Головка состоит из капсомеров и содержит внутри ДНК. Количество белка и ДНК примерно одинаково. Отросток фага Т 2 имеет сложное строение. В нем можно различить не менее трех частей: полый стержень, окружающий его сократимый чехол и находящуюся на дистальном конце стержня базальную пластинку с шипами и нитями (от последних зависит специфическая адсорбция на клетке-хозяине). На электронных микрофотографиях, полученных при негативном контрастировании, можно видеть фаговые частицы в двух состояниях: у одних частиц головка очень резко выделяется на электроноплотном фоне и чехол отростка растянут, у других головка мало отличается от фона по плотности и чехол находится в сокращенном состоянии. Первое состояние характерно для активного фага, в головке которого заключена ДНК, второе – для фага, который инъецировал свою ДНК в бактериальную клетку. Многие бактериофаги имеют более простое строение. В зависимости от формы зрелых фаговых частиц различают ряд типов. Большинство фагов содержит двухцепочечную ДНК. В последние годы, однако, было обнаружено несколько фагов с одноцепочечной ДНК и несколько с одноцепочечной РНК. Содержащие РНК фаги fr, R17, Qβ и другие обладают наименьшими из известных геномов: в них 3500-4500 нуклеотидов. [Шлегель, 1987] Глава 2. Разнообразие вирусов.
Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства – рибовирусы и дезоксирибовирусы. Подцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение разных видов. В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается типу нуклеиновой кислоты и ее молекулярно-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая, сегментированная, несегментированная, с повторяющимися и инвертированными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, полученные в результате электронно-микроскопических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоплазматическая локализация и др. Наряду с упомянутыми признаками учитываются и резистентность к температуре, рН, детергентам и т.д. В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств. Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кислоты, структурой, целостностью или фрагментацией генома, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы. Некоторые таксономические признаки представителей важнейших семейств вирусов человека и животных приведены в таблице 2 (см. приложение 1). РНК-содержащие вирусы.
К РНК-содержащим вирусам относится большинство патогенных для человека вирусов. Они отличаются многообразием строения генома, высокими изменчивостью и скоростью эволюции, что приводит к появлению новых возбудителей инфекционных заболеваний. Большинство РНК-геномных вирусов репродуцируется в цитоплазме клетки, хотя некоторые из них на определенных этапах развития локализуются внутри ядра. В настоящее время известно 13 патогенных для человека семейств РНК-геномных вирусов: 1. Семейство Пикорнавирусов. 1.1. Энтеровирусы. Представители: вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО, гепатита А и др. 1.2. Риновирусы. 1.3.Афтовирусы. Представители: вирус ящура 2. Семейство Калицивирусов. Представители: вирус Норфолк. 3. Семейство Реовирусов. 3.1. Реовирусы. 3.2. Ротавирусы. 3.3. Орбивирусы. 4. Семейство Ретровирусов. 4.1. Подсемейство Спумавирусов. 4.2. Подсемейство Онковирусов. 4.3. Подсемейство Лентивирусов. Представители: ВИЧ. 5. Семейство Тогавирусов. 5.1. Альфавирусы. 5.2. Вирус краснухи. 6. Семейство Флавивирусов. 6.1. Вирус желтой лихорадки. 6.2. Вирус лихорадки денге. 6.3. Вирус японского энцефалита 6.4. Вирус клещевого энцефалита 6.5. Вирус омской геморрагической лихорадки (ОГЛ). 7. Семейство Буньявирусов. 7.1. Вирус крымской геморрагической лихорадки. 7.2. Вирусы москитных лихорадок. 7.3. Вирус геморрагической лихорадки с почечным синдромом. 8. Семейство Аренавирусов. 8.1. Вирус лимфоцитарного хориоменингита. 8.2. Вирус Ласа. 9. Семейство Филовирусов. 9.1. Вирус Марбург. 9.2. Вирус Эбола. 10. Семейство Рабдовирусов. 10.1. Вирус везикулярного стоматита. 10.2. Вирус бешенства. 11. Семейство Коронавирусов. 12.Семейство Парамиксовирусов. 12.1. Вирусы парагриппа человека (ВПЧГ). 12.2. Вирус паротита. 12.3. Вирус кори. 12.4. Респираторно-синцитиальный (РС) вирус. 13. Семейство Ортомиксовирусов. 13.1. Вирусы гриппа. ДНК-содержащие вирусы.
Патогенные для человека ДНК-содержащие вирусы входят в состав 6 семейств. По сравнению с РНК-геномными вирусами они генетически более консервативны, т.е. менее изменчивы, нередко способны к длительной персистенции в организме хозяина. Подавляющее большинство ДНК-содержащих вирусов репродуцируется в ядрах клеток. 1. Семейство Аденовирусов. 2. Семейство Парвовирусов. 3. Семейство Герпесвирусов. 3.1. Альфа-герпесвирусы. 3.2. Бета-герпесвирусы 3.3. Гамма-герпесвирусы 4. Семейство Поксовирусов. 4.1. Вирус натуральной оспы. 4.2. Вирус оспы обезьян. 4.3. Вирус осповакцины (коровьей оспы). 4.4. Вирус контагиозного моллюска. 5.Вирусы гепатита. 5.1. Вирус гепатита А (семейство пикорнавирусов) 5.2. Вирус гепатита В. 5.3. Дельта-вирус. 5.4. Вирус гепатита С. 5.6. Вирус гепатита Е. 6. Онкогенные вирусы. 6.1.Паповавирусы. Представители: Папилломавирусы человека, вирусы полиомы, SV-40. 6.2. Вирусы герпеса. 6.3. Поксивирусы. 6.4. Вирус гепатита В. [Борисов и др., 1994] Глава 3. Биологическая роль вирусов.
Всем известно, что вирусы играют в основном негативную роль. Но не все знают, что именно вирусы сыграли немаловажную роль в становлении микробиологии и генетики в частности, помогли ученым в изучении свойств и структуры ДНК. Например, при изучении жизненного цикла бактериофагов ученые Лурия и Дельбрюк пришли к предположениям о биологической роли ДНК. В 1970 г. не известные широкой научной общественности Г.Темин и Д.Балтимор опубликовали в Nature статьи, посвященные обратной транскриптазе (ОТ) – ферменту РНК-содержащих, в том числе раковых, вирусов, которые синтезируют ДНК на матрице РНК, т.е. осуществляют реакцию, обратную той, которую до тех пор наблюдали в клетках. Журнал Time назвал Уотсона «охотником за генами». Сам же ученый сказал следующее: «Это захватывающая перспектива. Тридцать лет назад мы не могли и мечтать о том, чтобы узнать структуру генома даже мельчайшего вируса. А сегодня мы уже расшифровали геном вируса СПИДа и почти полностью прочитали геном кишечной палочки объемом в 4,5 млн букв ген-кода. Точное знание детальной структуры генома человека – это восхитительно!». В нашем геноме много последовательностей, доставшихся нам в «наследство» от ретровирусов. Эти вирусы, к которым относятся вирусы рака и СПИДа, вместо ДНК в качестве наследственного материала содержат РНК. Особенностью ретровирусов является, как уже говорилось, наличие обратной транскриптазы. После синтеза ДНК по РНК вируса вирусный геном встраивается в ДНК хромосом клетки. Вирусы всегда являются паразитами и поэтому вызывают у своих хозяев определенные симптомы того или иного заболевания. Удельный вес вирусных инфекций человека в инфекционной патологии очень велик. Свыше 75% всех инфекционных болезней приходится на вирусные заболевания, более 25% всех желудочно-кишечных инфекции являются вирусной этиологии. Многие вирусы могут длительное время находиться в организме в латентном (не проявляя себя) состоянии, а при нарушении нормальных условий жизни они активизируются, вызывая клинически выраженные формы болезни. Способы передачи вирусных заболеваний.
Капельная инфекция
- самый обычный способ распространения респираторных заболеваний. При кашле и чихании в воздух выбрасываются миллионы крошечных капелек жидкости (слизи и слюны). Эти капли вместе с находящимися в них живыми вирусами могут вдохнуть другие люди, особенно в местах скопления большого количества народа, к тому же еще и плохо вентилируемых. Стандартные гигиенические приемы для защиты от капельной инфекции правильное пользование носовыми платками и проветривание комнат. Некоторые микроорганизмы, такие, как вирус оспы, очень устойчивы к высыханию и сохраняются в пыли, содержащей высохшие остатки капель. Даже при разговоре изо рта вылетают микроскопические брызги слюны, поэтому подобного рода инфекции очень трудно предотвратить, особенно если микроорганизм очень вирулентен (заразен). Контагиозная передача
(при непосредственном физическом контакте). В результате непосредственного физического контакта с больными людьми или животными передаются сравнительно немногие болезни. Сюда прежде всего относятся венерические (т. е. передающиеся половым путем) болезни, такие, как СПИД. К контагиозным вирусным болезням относятся обычные бородавки (папилломавирус) и простой герпес - "лихорадка" на губах. Переносчик - это любой живой организм, который разносит инфекцию. Он получает инфекционное начало от организма, называемого резервуаром или носителем. Вирус бешенства сохраняется и передается одним и тем же животным, например собакой или летучей мышью. В этих случаях переносчик выступает в качестве второго хозяина, в теле которого может размножаться патогенный микроорганизм. Насекомые могут переносить возбудителей болезней на наружных покровах тела. [www.medicinform.net] Заключение.
Вирусы – многочисленные микроорганизмы, разнообразные по форме и размерам. Вирусы – исключительно паразиты, заражающие людей, животных, растения, бактерии. Вирусы играют довольно важную роль в биосфере – они выступают как бы одним из факторов естественного отбора, позволяют стабилизировать численность популяций живых организмов. Более сильные организмы вырабатывают антитела и вместе с ними иммунитет, более слабые – погибают. Это позволяет более приспособленным давать потомство с уже сформированным иммунитетом к данному вирусу. Вирусы помогли ученым изучить роль ДНК в организме. А также было выяснено, что ретровирусы не только являются возбудителями страшных заболеваний: рака и СПИДа, - но и позволяют всем нам появиться на свет, т.к. они блокируют иммунные Т-лимфоциты матери, что не позволяет плоду быть отторгнутым. Таким образом, вирусы играют не только отрицательную роль, о которой все люди знают не понаслышке, но и исключительно положительную. Дальнейшее исследование этих загадочных «живых – неживых» организмов не только необходимо для человечества, чтобы бороться с неизлечимыми болезнями, вызываемыми вирусами, но и, я думаю, не менее интересно. Список литературы.
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Фрейдлин И.С. и др. «Медицинская микробиология, вирусология, иммунология». – М.: «Медицина», 1994 2. Шлегель Г. «Общая микробиология». – М.: «Мир», 1987 3. www.medicinform.net 4. www. Elite-genetix.ru Приложение 1. Таблица 2. Некоторые таксономические признаки представителей важнейших семейств вирусов человека и животных.
Таксономический признак Семейство Важнейшие представители I.
ДНК-содержащие вирусы
Двунитевая ДНК Аденовирусы Аденовирусы Отсутствие внешней оболочки Паповавирусы Вирусы папилломы, полиомы и бородавок человека Однонитевая ДНК Отсутствие внешней оболочки Парвовирусы Аденассоциированные вирусы Двунитевая ДНК. Наличие внешней оболочки Герпесвирусы Вирусы простого герпеса, цитомегалии, ветряной оспы Гепаднавирусы Вирус гепатита В Поксовирусы Вирус натуральной оспы, осповакцины II. РНК-содержащие вирусы
Плюс-однонитевая РНК. Отсутствие внешней оболочки Пикорнавирусы Вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО, вирус гепатита А. Калицивирусы Вирусы гастроэнтерита детей (Норфолк) Двунитевая РНК. Отсутствие внешней оболочки Реовирусы Реовирусы, ротавирусы, орбвирусы Наличие обратной транскриптазы Ретровирусы ВИЧ, вирусы Т-лейкоза, онковирусы Плюс-однонитевая РНК. Наличие внешней оболочки Тогавирусы Вирусы омской геморрагической лихорадки, краснухи Плюс-нитевая РНК (позитивный геном) Флавивирусы Вирусы клещевого энцефалита, лихорадка денге, желтой лихорадки. Минус-однонитевая РНК. Буньявирусы Вирусы Буньямвера, крымской геморрагической лихорадки Аренавирусы Вирусы лимфоцитарного хориоменингита, болезни Лассо Рабдовирусы Вирусы бешенства, везикулярного стоматита Двунитевая РНК. Наличие внешней облочки Парамиксовирусы Вирусы парагриппа, паротита, кори, РСВ Ортомиксовирусы Вирусы гриппа человека, животных, птиц
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||