Курс лекций по биотехнологии - часть 40

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  38  39  40  41   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 40

 

 

 

313

концах (H) и (L) цепей.  Для CDR характерна  очень  высокая  изменчивость 

последовательности аминокислот, поэтому их называют ещё  

гипервариабельными.  

Легкие x и 

λ-цепи идентичны у всех всех видов животных, а тяжелые цепи 

представлены пятью типами (

µ,δ,γ,ε и α), которые и определяют пять классов 

иммуноглобулинов  обнаруженных  у  млекопитающих: IgM, IgD, IgG, IgE и 

IgA. 

При  контролируемом  ферментативном  гидролизе  иммуноглобулинов 

образуются 2 типа  фрагментов: Fab и Fc, причем N-концевая  часть Fab 

фрагмента,  называемая  F

V

  фрагментом,  обладает  антигенсвязывающей 

активностью,  присущей  интактной  молекуле  антитела.  Существуют  около 

миллиона различных специфических антител, что обеспечивает определение 

практически  любых  биологически  активных  веществ  как  природного  так  и 

синтетического  происхождения.  Например,  в  антителах  класса IgM все 

тяжелые  цепи  имеют  одинаковую  постоянную  область 

µ,  а  легкие  цепи 

содержат x или 

λ-постоянную  область;  вариабельные  же  области  у  разных 

молекул  антител  различны  и  отражают  их  антигенные  свойства.  Таким 

образом,  константная  (постоянная)  область  тяжелых  цепей  определяет 

способ  действия  антитела  в  организме:  если  она,  например, 

δ-типа,  то  есть 

антитело  принадлежит  к  классу IgD, то  оно  является  связанным  с 

поверхностью  синтезирующей  его  клетки;  если  же  тяжелая  цепь,  например, 

ε-типа, то соответствующее антитело IgE может связываться с поверхностью 

специализированной  клетки,  способной  выделять  гистамин,  что  приводит  к 

появлению 

симптомов 

астмы 

или 

лихорадки, 

когда 

антитело 

взаимодействует с антигеном (например, с пыльцой какого-либо растения).  

Моноклональные  антитела  с  успехом  применяются  для  дифференциальной 

диагностики многих инфекционных и неинфекционных заболеваний, а также 

для  стандартизации  определения  групп  крови  путем  иммунохимического 

анализа. 

Именно 

с 

помощью 

моноклональных 

антител 

были 

 

314

идентифицированы  индивидуальные  маркеры  многих  возбудителей 

инфекционных  заболеваний  как  вирусной,  так  и  бактериальной  природы. 

Изучение  генетических  механизмов  многих  заболеваний  стало  возможным 

благодаря  уникальной  специфичности  моноклональных  антител.  Так 

методом  иммуносцинтиграфии  опухолей  можно  идентифицировать 

локализацию опухоли с ее метастазами размером 0,5-1,0 см. 

Самыми  важными  областями  использования  иммунохимического  анализа 

являются: 

- контроль банков крови и продуктов из донорской крови; 

- обнаружение возбудителей в объектах внешней среды; 

- диагностика инфекционных заболеваний; 

- диагностика диабета. 

Сегодня количество проводимых иммунохимических анализов в мире растет 

настолько 

стремительно, 

что 

производство 

иммунодиагностикумов 

совместно  с  приборами  и  вспомогательными  материалами  можно 

рассматривать 

уже 

как 

отдельную, 

самостоятельную 

область 

биотехнологической промышленности.  

Принципы  иммунохимического  анализа  можно  представить  реакцией 

растворимого антигена (АГ) с антителом (АТ), зная о двухвалентности АТ и 

поливалентности АГ. Антитело, образуя комплекс с антигеном, обеспечивает 

уникальное  по  специфичности  узнавание  определяемого  вещества  в  любых 

сложных многокомпонентных системах. 

Этот процесс описывается системой уравнений двух стадий: 

(1) АГ+АТ=АГАТ 

(2) n(АГАТ)=(АГАТ)n 

Первая  стадия  характеризует  взаимодействие  активного  центра  антител  с 

антигенной  детерминантой,  которая  представляет  участок  молекулы 

антигена,  способного  связываться  с  активным  центром  специфического 

антитела.  Здесь  проявляется  свойство  (АТ) «склеивать»  антигены  (АГ). 

 

315

Причем,  размеры  антигенных  детерминант  (эпитопов),  например,  для 

белковых антигенов составляют всего несколько аминокислот.  

Вторая  стадия  характеризуется  образованием  комплексов  сложного  состава, 

когда  двухвалентная  молекула  (АТ)  способна  связаться  лишь  с  двумя 

молекулами  антигена  в  комплекс,  который  в  свою  очередь,  может  связать 

еще  одно  (АТ)  и  т.д.  Образующиеся  агрегаты  таких  комплексов 

обнаруживаются  либо  по  возникающей  мутности  раствора,  либо  по 

выпадению в осадок. 

Такая  реакция  взаимодействия  белковых  антигенов  с  антителами  лежит  в 

основе  определения  групп  крови,  когда  происходит  «склеивание» 

эритроцитов антителами той или иной специфичности. Эта реакция получила 

название  гемагглютинации  и  очень  широко  используется  на  практике.  Этот 

метод  также  широко  применяется  при  определении  белков  плазмы  крови  в 

концентрации  до 10

-6

  г/мл.  Однако,  методы  агглютинации  вследствие 

довольно  низкой  точности  относятся  только  к  качественным  или 

полуколичественным методам анализа.  

Для  расширения  пределов  чувствительности  и  повышения  специфичности 

иммунохимических  тестов  в  один  из  компонентов  системы  вводят  маркер, 

концентрацию  которого  можно  легко  определять.  После  отделения 

продуктов реакции от исходных компонентов находят концентрацию (АГАТ) 

и по калибровочному графику рассчитывают содержание (АГ). 

Концентрацию  антигена  определяют  исходя  из  принципа  конкурентного 

связывания  антителами  меченного  и  немеченого  антигенов.  Происходит 

следующая реакция: 

АГ+АГ*+АТ=АТАГ+АТАГ* 

АГ* и АГ - определяемый антиген с меткой и без метки;  

АТ - антитела;  

АТАГ и АТАГ* - соответствующие комплексы. 

 

316

Итак, если в пробирку с раствором, содержащим постоянную концентрацию 

антител  и  меченного  антигена,  добавить  различные  количества  немеченого 

антигена,  то  концентрация  комплекса  АТАГ*  с  меткой  будет  обратно 

пропорционально  концентрации  немеченого  антигена.  Для  того,  чтобы 

отделить  комплексы  АТАГ  от  несвязавшихся  компонентов  анализируемой 

смеси,  АТ  или  АГ  ковалентно  связывают  с  твердой  фазой,  например,  с 

полистероловыми  шариками.  После  промывки  твердой  фазы  отделяют 

связавшиеся  и  не  связавшиеся  компоненты.  Такой  тип  анализа  называют 

гетерогенным (принцип 2-х фаз: твердой и жидкой). 

С  большим  успехом  в  гинекологическую  практику  вошел  экспресс-метод 

определения  беременности  по  уровню  хориогонического  гонадотропина  в 

моче. Такие типы тестов могут быть использованы не только в специальных 

лабораториях,  но  и  в  домашних  условиях  самостоятельно.  В  качестве 

практического  примера  использования  твердофазного  иммуноферментного 

анализа (ELISA- enzyme linked immunosorbentassay) можно  рассмотреть 

метод  определения  хорионического  гонадотропина.  В  этом  методе  на 

полистерольные  шарики  сорбируются  моноклональные  антитела  к 

хорионическому 

гонадотропину.  К  сенсибилизированным 

шарикам 

добавляют  исследуемую  пробу  (мочу)  и  коньюгат,  состоящий  из  маркера  и 

моноклональных 

антител, 

меченных 

пероксидазой. 

В 

результате 

иммунологической реакции хорионический гонадотропин связывается одной 

детерминантой  с  моноклональными  антителами,  иммобилизованными  на 

поверхности шариков, а другой - с моноклональными антителами коньюгата 

с  маркером.  Затем  шарики  отмывают  от  всех  не  связавшихся  компонентов 

мочи и определяют активность фермента в составе иммунных комплексов  с 

помощью  субстрат-хромогенной  смеси.  При  этом  степень  окраски  раствора 

будет  прямо  пропорциональна  количеству  хорионического  гонадотропина  в 

образце мочи.  

 

317

Лекарственный 

мониторинг 

также 

осуществляется 

посредством 

использования  методов  иммунохимического  анализа.  Необходимость 

контроля  за  концентрацией  лекарственного  препарата  в  процессе  терапии  у 

больного возникает при следующих ситуациях: 

1. Длительных курсовых приемах лекарственных средств 

2. Низком терапевтическом эффекте или полном его отсутствии 

3. Возникновении побочных явлений, в случае превышения терапевтической  

дозы препарата 

4. Трудно определяемом фармакологическом эффекте 

5. Особых обстоятельствах (например, при лечении новорожденных). 

Например,  лекарственный  мониторинг  используется  при  терапии  такими 

препаратами  как  бронхолитик  теофиллин,  сердечный  гликозид  дигоксин  и 

т.д.  Известно,  что  успешный  клинический  результат  зависит  не  от  дозы 

препарата, а от его концентрации в плазме крови. Поэтому при достижении 

одного  и  того  же  лечебного  эффекта  у  разных  больных  лекарственная 

дозировка  препарата  может  различаться  в  десятки  раз.  Совершенно 

очевидно,  что  в  этих  случаях  необходим  индивидуальный  подбор  доз  для 

каждого  пациента.  Кроме  того,  мониторинг  лекарственных  средств 

исключает  передозировку  лекарственного  препарата  и,  соответственно, 

проявления токсических эффектов. 

В  настоящее  время  рентабельными,  экспрессными  методами  определения 

низкомолекулярных 

соединений 

в 

плазме 

крови 

являются 

иммуноаналитические  методы,  которые  отличаются  универсальностью 

(применимы к любому веществу, способному к индукции антител), высокой 

селективностью  и  чувствительностью;  не  требуют  предварительной 

обработки образцов и имеют сравнительно низкую стоимость. 

Известно,  что  иммунизация  низкомолекулярными  веществами  не  может 

вызывать  иммунный  ответ,  поэтому  для  получения  антител  нужно 

предварительно 

лекарственный 

препарат 

ковалентно 

связать 

с 

 

318

иммуногенным  высокомолекулярным  носителем.  Сначала  лекарственное 

вещество  делают  реакционноспособным,  вводя  различные  функциональные 

группы, 

которые 

затем 

взаимодействуют 

с 

соответствующими 

функциональными  группами  белка  и  образуют  так  называемый 

синтетический  коньюгированный  антиген.  При  иммунизации  животного 

таким 

комплексным 

антигеном 

будет 

происходить 

образование 

поликлональных  антител,  то  есть  антител  к  антигенным  детерминантам 

самого  белка  и  антител  к  антигенным  детерминантам  лекарственного 

средства.  В  настоящее  время  иммунодиагностические  тест-системы  с 

использованием  поликлональных  антител  созданы  практически  для  всех 

лекарственных  препаратов.  При  проведении  лекарственного  мониторинга  с 

использованием методов иммунохимического анализа в качестве «маркеров» 

применяются: 

1.  Радиоактивные  метки  (радиоиммунный  анализ  с  использованием 

радиоактивных атомов - тритий, радиоактивный йод и другие). 

2.  Ферментные  метки  (если  ферменты  стабильны,  активны  и  действуют  в 

минимальных концентрациях). 

3.  Субстратные  метки  (АТФ  и  НАД),  которые  «пришиваются»  к  молекуле 

антигена 

через 

адениновый 

остаток 

и 

сохраняют 

способность 

взаимодействия с ферментом. 

Существуют  гетерогенные  и  гомогенные  иммуноферментные  методы:  с 

разделением  компонентов  после  проведения  иммунохимической  реакции 

(роль  пассивного  маркера  выполняет  фермент,  не  меняющий  своей 

активности  в  ходе  реакции)  и  без  разделения  компонентов  (также 

используется  ферментная  метка,  активность  которой  в  ходе  иммунной 

реакции меняется). 

Гетерогенный иммуноферментный анализ основан на конкурентной реакции 

антител  с  исследуемым  веществом  и  меченым  веществом  с  последующим 

 

319

отделением  антител  и  измерением  активности  фермента,  связавшегося  с 

ними.  

Гомогенный  иммуноферментный  метод  основан  на  способности  антител 

модулировать  активность  некоторых  ферментов,  ковалентно  связанных  с 

измеряемым  веществом.  Антитела  влияют  на  конформацию  активного 

центра  фермента,  а  добавление  свободного  вещества  восстанавливает 

активность  фермента.  Гомогенные  методы,  как  правило,  менее 

чувствительны, чем гетерогенные, но их чувствительность вполне достаточна 

для  определения  практически  всех  лекарственных  препаратов  и  даже 

некоторых гормонов. Они достаточно просты в работе. Анализ проводится в 

одну стадию и длится несколько минут.  

Также  в  иммуноанализе  используют  липосомы,  содержащие  метку. 

Существует  множество  модификаций  этого  метода,  например,  на  мембране 

липосом  находится  антиген,  взаимодействующий  с  антителами  в 

присутствии  комплемента  и  вызывающий  лизис  липосом  с  последующим 

высвобождением метки.  

Существуют  также  и  неинструментальные  полуколичественные  методы 

экспресс-анализа  на  бумаге,  например,  на  многослойных  целлюлозных 

полосках,  которые  пропитывают  разными  реагентами  иммунохимической 

реакции  и  затем  склеивают  их  вместе  на  пластике.  Такой  же  принцип 

последовательного  взаимодействия  находится  в  основе  еще  одного 

полуколичественного  метода - иммунохроматографического.  На  полоску 

бумаги сорбируются антитела. Затем конец этой полоски вносится в раствор 

пробы  и  коньюгата  (препарат-пероксидаза).  В  процессе  диффузии  раствора 

вверх  по  полоске  меченный  и  свободный  лекарственный  препарат 

конкурентно  взаимодействует  с  антителами,  вызывая  их  насыщение.  Чем 

больше  концентрация  препарата  в  пробе,  тем  выше  будет  зона  насыщения. 

Затем  следует  проявление  (детекция)  полоски  в  растворе  субстрата.  Высота 

 

320

окрашенного  столбика  определяет  концентрацию  препарата  в  исследуемом 

образце (пробе).  

Теперь,  более  подробно  рассмотрим  вакцины  и  сыворотки,  а  также 

биотехнологические  мотоды  их  получения.  Как  уже  говорилось  выше, 

вакцины  относятся  к  группе  активных  специфических  препаратов  и 

применяются с целью профилактики или лечения. Вакцинация способствует 

формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и 

тем  самым  защищает  его  от  инфекции.  В  ответ  на  пероральное  или 

парентеральное  введение  вакцины,  в  организме  человека  или  животного 

вырабатываются  антитела  к  патогенному  микроорганизму,  которые  при 

последующей  инфекции  приводят  к  его  инактивации  (нейтрализации  или 

гибели),  блокируют  его  пролиферацию  и  не  позволяют  развиться 

заболеванию. Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад (в 1796 году) 

врач  Эдвард  Дженнер.  Он  доказал  экспериментально,  что  человек, 

перенесший  коровью  оспу  (не  очень  тяжелую  болезнь  крупного  рогатого 

скота), становится невосприимчивым к оспе натуральной. 

Вакцины  представляют  собой  сложный  иммунобиотехнологический 

препарат, в состав которого входят:  

-  действующий  компонент,  представляющий  специфические  антигены 

(живые  ослабленные  микроорганизмы;  убитые  микробные  клетки  или 

вирусные  частицы;  извлеченные  из  микроорганизма  антигенные  структуры; 

продукты  жизнедеятельности  микроорганизмов - токсины,  как  вторичные 

метаболиты; 

- консервант, который  определяет  стабильность вакцины  при  ее хранении  и 

не  допускает  размножения  случайно  попавшей  в  препарат  микрофлоры 

(мертиолят 1:10 000, формалин и другие антимикробные препараты); 

-  стабилизатор,  предохраняющий  антиген  от  разрушения  и  продлевающий 

тем самым срок годности вакцины (сахарозо-агар-желатина и др.); 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  38  39  40  41   ..