Курс лекций по биотехнологии - часть 39

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  37  38  39  40   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 39

 

 

 

305

не  решает  проблему,  поскольку  при  этом  часто  возникают  побочные 

эффекты.  Более  того,  чтобы  избежать  этих  эффектов,  многие 

терапевтические  средства  заведомо  вводят  в  дозах,  не  достигающих 

оптимальных,  что  дополнительно  снижает  их  эффективность.  Для 

облегчения  доставки  лекарственного  вещества  к  месту  его  действия 

используют несколько приемов: 

1.  Заключают его в липосомы, липидная оболочка которых имеет высокое 

сродство к нужным органам. 

2.  Встраивают гены специфических токсинов в инфильтрующие опухоль 

лимфоциты,  которые  высвобождают  эти  токсины  непосредственно  в 

опухоли. 

3.  Присоединяют  молекулы  лекарственных  веществ  к  моноклональным 

антителам,  специфичным  по  отношению  к  белкам,  находящимся  на 

поверхности  строго  определенных  клеток,  например,  опухолевых  

(рис.20 А). 

4.  Используют лекарственные вещества в неактивной форме, переводя их 

в  активное  состояние  при  помощи  ферментов.  Чтобы  такое 

превращение  происходило  только  вблизи  клетки-мишени,  фермент 

присоединяют  к  моноклональному  антителу,  специфичному  к 

поверхностному антигену этой клетки (рис.20 Б). 

 

306

 

 

 
 
 
Рис. 20 (А,Б).       Схема целевой доставки лекарственного вещества,   

                              основанная на использовании моноклональных антител 

 

 

 

307

Несмотря на весьма существенные достижения применения моноклональных 

антител  в  терапии  различных  заболеваний  имеются  все-таки  и  некоторые 

ограничения их использования в клиниках. Прежде всего, они, как продукты 

гибридом,  могут  быть  контаминированы  генетическим  материалом 

ретровирусов,  т.к.  все  миеломы,  как  опухолевые  партнеры  гибридизации, 

имеют  в  своем  геноме  гены  ретровирусов,  являющиеся  онкогенными  и, 

соответственно,  опасными  для  человека.  Поэтому  все  препараты 

моноклональных  антител  обязательно  тестируются  на  отсутствие  вирусного 

генетического материала. 

Для получения антител используют мышей, морских свинок, кроликов, кур, 

овец,  коз,  лошадей,  которым  делают  инъекции  антигена.  В  присутствии 

стимуляторов  иммунного  ответа  в  сыворотке  крови    накапливаются 

специфические  антитела.  Обычно  антитела  выделяют  из  сыворотки  крови 

сульфатом аммония, спиртом или полиэтиленгликолем. Эти антитела имеют 

много  примесей  белков.  Высокоочищенные  антитела  выделяют  с  помощью 

ионообменной 

хроматографии 

и 

аффинной 

хроматографии 

на 

иммуносорбентах. 

Для  организации  масштабного  производства  моноклональных  антител 

ключевую  роль  сыграл  метод  гибридомной  технологии.  Хорошо  известно, 

что  в  результате  иммунного  ответа  на  какой-либо  антиген,  образуется 

высокогетерогенный  продукт - антисыворотка  со смесью  антител.  Антитела 

продуцируются разными линиями В-лимфоцитов и направлены к различным 

антигенным  детерминантам  антигена.  Проблема  получения  определенной 

линии  лимфоцитов,  которые  не  растут  на  искусственной  среде in vitro в 

культуре,  была  решена,  как  только  стало  возможным  получение 

соматических  гибридов.  Известно,  что  миеломы  (злокачественные  опухоли 

костного мозга, клетки которых обладают способностью к неограниченному 

росту) продуцируют большое количество аномальных иммуноглобулинов.  

 

308

В 1975 году  Г.Келер  и  К.Мильштейн  сумели  впервые  выделить  клоны 

клеток, способные секретировать только один тип молекул антител и в тоже 

время  расти  в  культуре.  Этот  клон  клеток  был  получен  путем  слияния 

антителообразующих  и  опухолевых  клеток.  Эти  клетки-химеры  назвали 

гибридомами,  так  как  с  одной  стороны,  они  наследовали  способность  к 

практически  неограниченному  росту  в  культуре,  а  с  другой  стороны, 

способность 

к 

продукции 

антител 

определенной 

специфичности 

(моноклональных антител).  

Весьма  существенным  для  биотехнолога  является  то  обстоятельство,  что 

отобранные  клоны  могут  длительно  храниться  в  замороженном  состоянии, 

так  как  в  случае  необходимости  можно  взять  определенную  дозу  такого 

клона  и  ввести  животному,  у  которого  будет  развиваться  опухоль, 

продуцирующая моноклональные антитела заданной специфичности. Вскоре 

в  сыворотке  животного  будут  обнаружены  антитела  в  очень  высокой 

концентрации  от 10 до 30 мг/мл.  Клетки  такого  клона  можно  также 

выращивать in vitro, а  секретируемые  ими  антитела  получать  из 

культуральной  жидкости.  В  настоящее  время  гибридомная  технология 

получила широкое применение. Создание гибридом, которые можно хранить 

в  замороженном  состоянии  (криоконсервирование),  позволило  организовать 

целые  гибридомные  банки,  что,  в  свою  очередь,  открыло  большие 

перспективы  по  применению  моноклональных  антител.  Сфера  их 

применения,  помимо  количественного  определения  различных  веществ, 

включает  самую  разнообразную  диагностику,  например,  идентификацию 

определенного  гормона,  вирусных  или  бактериальных  антигенов,  антигенов 

группы крови и тканевых антигенов (табл. 5).  

 

309

Таблица 5. Области применения моноклональных антител.  

Диагностика 

Терапия 

Технология  Научные 

исследования 

1. Иммунохимические 

анализы 

биологических 

жидкостей, клеток 

организма, микроорга-

низмов, вирусов и т.д. 

2.Иммуногистохимиче

ские методы. 

3. 

Иммуносцинтиграфия 

опухолей. 

4. Типирование групп 

крови и тканей. 

 

1. Воздействие на 

определенные клеточ-

ные популяции. 

2. Влияние на 

иммунные 

регуляторные меха-

низмы с помощью  

антител к 

лимфокинам. 

3. Иммунорегуляция 

с помощью антиидио-

типических антител. 

4. Направленный 

транспорт лекарств с 

помощью моноклона-

льных антител. 

5. Элиминация 

токсинов, иммуногло-

булинов из класса IgE 

аллергенспецифическ

их IgE-антител. 

1. Иденти-

фикация 

молекул. 

2.Очистка 

молекул и 

клеток, 

несущих 

специфи-

ческий 

антиген. 

1. Исследова-

ние этиологии 

и патогенеза 

различных  

заболеваний. 

2. Исследова-

ние системных 

и межсистем-

ных механиз-

мов  

регуляции. 

3. Создание 

новых лекарст-

венных 

средств и 

биопрепаратов.

 

Только  благодаря  использованию  моноклональных  антител,  полученных  в 

результате  иммунизации  животных  лекарствами,  стало  возможно 

определение  дозы  этих  лекарств.  Такая  «иммунодозировка»  надежна  и 

экономична.  В  начале 90-х  годов  в  США  «Управление  по  контролю  за 

 

310

качеством  пищевых  продуктов,  медикаментов  и  косметических  средств» 

(FDA)  впервые  утвердило  к  продаже  коммерческий  набор  для 

диагностического  скрининга  на  основе  гибридом,  предназначенный  для 

установления аллергена.  

С  помощью  моноклональных  антител  возможно  выделение  биологически 

активных  веществ  (белков,  гормонов,  токсинов)  из  сложных  смесей. 

Например,  при  использовании  иммуноадсорбции  для  очистки  интерферона, 

был получен препарат высочайшей степени очистки (до 99%). Только после 

одного  пассажа  через  колонку  с  иммобилизованными  моноклональными 

антителами, препарат очищался в 5000 раз!  

Можно  использовать  моноклональные  антитела  и  в  качестве  меток  для 

точной  идентификации  специализированных  клеток,  например,  таких  как 

нейроны.  Существует  также  технология  использования  моноклональных 

антител  для  изучения  клеточных  мембран,  позволяющая  выделять 

мембранные белки в чистом виде и измерять их биологическую активность. 

Моноклональные антитела можно использовать как в качестве стандартного 

реагента  для  обнаружения  определенных  молекул  на  клеточной  мембране, 

так  и  для  разделения  популяции  клеток,  несущих  на  поверхности  разные 

антигены. 

Кроме  того,  с  помощью  моноклональных  антител  можно  создавать 

высокоспецифичные  вакцины,  особенно  против  определенных  вирусных 

штаммов  и  паразитов.  Моноклональные  антитела  способны  также  к 

нейтрализации  действия  лимфоцитов,  ответственных  за  отторжение 

трансплантанта  и  аутоантител,  образующихся  при  аутоиммунных 

заболеваниях 

(некоторые 

формы 

диабета, 

рассеянный 

склероз, 

ревматические  болезни).  В  сочетании  с  лекарственными  средствами  они 

могут значительно усиливать эффективность действия последних на клетки-

мишени,  позволяя  избегать  серьезных  побочных  явлений,  весьма  обычных, 

например, при химиотерапии рака. 

 

311

Некоторое  время  назад  считалось,  что  геном  эмбриональных  клеток  в 

процессе  дифференцировки  соматических  клеток  (стадия  образования 

различных  тканей  организма)  не  изменяется,  а  все  разнообразие  форм  и 

функций  дифференцированных  клеток  относится  к  различиям  в  экспрессии 

одних  и  тех  же  генов.  Однако,  в  дальнейшем  было  показано,  что 

разнообразие  молекул  антител,  которые  образуются  зрелыми  лимфоцитами, 

связано с так называемой «активной перетасовкой» нескольких сотен генов в 

клетках-предшественниках лимфоцитов. Причем именно степень активности 

этой «перетасовки» и обусловливает широчайшее разнообразие антител.  

Было  также  показано,  что  рекомбинация  ДНК  позволяет  изменять  геном 

клетки, направляя ее метаболизм (клеточную специализацию) на увеличение 

генетического  разнообразия.  Как  известно,  молекула  антитела  является 

результатом  сборки  из  нескольких  белковых  цепей,  а  синтез  любого  белка 

определяется  соответствующим  геном.  Соответственно,  предпологали,  что 

должны  существовать  миллионы  генов,  кодирующих  синтез  определенных 

молекул  антител,  вырабатываемых  организмом  млекопитающих.  Однако, 

было  установлено,  что  в  геноме  клеток  последних  из  сотен  тысяч  генов 

только незначительная их часть вызывает синтез антител. Это происходит в 

результате того, что, так называемые, стволовые (эмбриональные) клетки не 

содержат  полного  набора  генов  всех  антител,  а  обладают  лишь  набором 

генетических элементов, которые способны очень быстро перестраиваться в 

процессе  дифференцировки  и  созревания  клеток  иммунной  системы  (В-

лимфоцитов),  что,  собственно,  и  приводит  к  образованию  миллионов 

клеточных линий, вырабатывающих различные антитела.  

Что  касается  молекулы  самого  антитела (иммуноглобулина), то она  состоит 

из  двух  «легких» (L) и  двух  «тяжелых» (H) белковых  цепей,  которые 

соединены расположенными в строго определенных местах дисульфидными 

мостиками и водородными связями (рис.21). Каждая цепь имеет постоянную 

(константную) и вариабельную области. N-концевые участки (L) и (H) цепей 

 

312

образуют антигенсвязывающий сайт. Отдельные домены (области) молекулы 

антитела  выполняют  разные  функции,  что  облегчает  манипуляции  с  генами 

антител.  

 

 

H- и L-цепи состоит из вариабельных (V

H

 и V

L

) и константных (постоянных) 

доменов (C

L

, C

H1

, C

 H2

, C

 H3

). Вариабельные домены содержат CDR-участки 

(CDR1, CDR2 и CDR3).   
 
 
Рис. 21.              Строение молекулы антитела 
 
 

Антигенсвязывающие  сайты  состоят  из  трех  участков,  определяющих 

комплементарность  антител  к  антигену (CDR - от  анл. complementarity-

determining regions) и  образующих  вариабельные (V

H

  и  V

L

)  области  на N-

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  37  38  39  40   ..