Курс лекций по биотехнологии - часть 37

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  35  36  37  38   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 37

 

 

 

289

иммобилизации каллусной культуры клеток Digitalis lanata) или адсорбируют 

в них. Носитель с клетками помещают в питательную среду, клетки при этом 

остаются  живыми.  Они  прекращают  рост,  но  продолжают  синтез 

метаболитов,  выделяя  их  в  среду.  Основными  условиями  иммобилизации 

являются  выделение  метаболитов  в  питательную  среду  и  свободное 

извлечение метаболитов, например, алкалоидов из питательной среды. 

Иммобилизованные  клетки  по  сравнению  с  суспензионными  культурами 

имеют следующие преимущества: 

- многократное использование 

- четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма 

- увеличение продолжительности культивирования на стадии активного  

биосинтеза  

- получение большего количества вторичных метаболитов 

- сокращение времени ферментации 

-  увеличение  срока  работы  клеток  (иммобилизованные  клетки  с  низкой 

скоростью роста, способны к интенсивной выработке метаболитов). 

Довольно  часто  синтез  метаболитов  в  суспензионной  культуре 

останавливается  на  промежуточных  этапах,  не  доходя  до  получения 

необходимого  целевого  продукта.  В  этом  случае  получение  конечного 

продукта  возможно  благодаря  процессу  биотрансформации,  суть  которого 

состоит  в  изменении  промежуточных  метаболитов  с  помощью  культур 

других  растений  или  клеток  бактерий,  с  целью  повышения  биологической 

активности  конкретной  химической  структуры.  Несмотря  на  то,  что 

биотрансформация  очень  эффективна  в  случае  применения  бактериальных 

клеток,  однако  растительные  клетки  также  используют,  когда  процесс  по 

каким-либо причинам не может осуществляться в клетках микроорганизмов.  

В  качестве  примера  можно  привести  превращение  дигитоксина  в  дигоксин 

клетками Digitalis lanata. Недифференцированные  культуры  клеток Digitalis 

lanata  сами  по  себе  не  образуют  сердечных  гликозидов,  но  могут 

 

290

осуществлять  реакции  биотрансформации  субстратов,  добавленных  в 

питательную  среду.  Растения  наперстянки (Digitalis lanata) в  большом 

количестве  синтезируют  дигитоксин  вместо  необходимого  дигоксина.  Для 

соответствующей 

биотрансформации 

с 

успехом 

используют 

недифференцированную 

суспензионную 

культуру 

наперстянки. 

Иммобилизованные  клетки  этой  культуры  способны  долгое  время  с 

постоянной  скоростью  трансформировать 

β-метилдигитоксин  в  β-

метилдигоксин  (за  счет  реакции 12-гидроксилирования,  катализируемой 

ферментом, находящимся в клетках Digitalis lanata). 

Второй  пример, - культура  клеток  жень-шеня  корневого  происхождения 

способна  биотрансформировать  (гликозилировать)  фенольные  соединения 

(продукты  жизнедеятельности  суспензионной  культуры  клеток  корня Panax 

ginseng).  

Еще  один  пример - это  биотрансформация  карденолидов,  в  которых 

содержатся  гликозиды,  используемые  в  медицине  для  лечения  болезней 

сердца.  

Для  того,  чтобы  успешно  осуществлять  процессы  биотрансформации, 

необходимо  постоянно  проводить  селекцию  специализированных  линий 

клеток и оптимизировать условия культивирования. 

В  заключение  можно  привести  отдельные  примеры  использования  в 

клинической  практике  лекарственных  средств,  полученных  на  основе 

каллусных  и  суспензионных  культур  клеток  растений:  шиконин  (кожные 

заболевания),  дигоксин  (сердечно-сосудистые  заболевания),  берберин 

(кишечные  растройства – в  качестве  бактерицидного  средства),  диосгенин 

(противозачаточное  средство),  панаксозиды  (адаптогены,  укрепляющие 

иммунитет).  При  производстве  настоек  женьшеня,  плантационное 

выращивание  этой  культуры  по  выходу  панаксозидов  имеет  преимущество 

перед  каллусным  сырьем,  однако,  препараты,  получаемые  из  каллусного 

сырья - менее токсичны. 

 

291

9.2.   Трансгенные растения. 

        Возможности  современной  биотехнологии,  в  отличие  от  традиционных 

методов  генетики  и  селекции,  позволяют  комбинировать  гены  разных 

биологических  видов  и  получать  трансгенные  растения.  Трансгенными  

называются те виды растений, в которых успешно функционируют гены (или 

ген),  пересаженные  из  других  видов  растений  или  животных.  Делается  это 

для  того,  чтобы  растение  реципиент  получило  новые  удобные  для  человека 

свойства:  повышенную  устойчивость  к  вирусам,  гербицидам,  вредителям  и 

болезням 

растений. 

Пищевые 

продукты, 

полученные 

из 

таких 

генноизмененных  культур,  могут  иметь  улучшенные  вкусовые  качества, 

лучше  выглядеть  и  дольше  храниться.  Также  часто  такие  растения  дают 

более богатый и стабильный урожай, чем их природные аналоги. Если взять 

ген устойчивости к заболеваниям из вирусов, морозоустойчивости – из рыбы, 

сопротивляемости  вредителям - из  бактерий  и  внести  этот  «коктейль»  в 

геном  какого-нибудь  растения,  то  такая  комбинация  придаст  растению 

совершенно  новые  свойства,  хотя  его  биологический  вид  не  изменится. 

Картофель  останется  картофелем,  просто  теперь  он  станет  неуязвимым  для 

колорадского  жука.  Уже  получены:  морозоустойчивая  свекла;  светящаяся  в 

сумерках газонная трава; и даже банан, съев который, получаешь «прививку 

от тропических болезней».  

Поиски  путей  введения  чужеродных  генов  в  клетки  высших  растений 

интенсивно ведутся во всем мире с начала 70-х годов. Так было обнаружено, 

что  опухолеобразующие    Ti  плазмиды  агробактерий (Ti - tumor inducing), 

представляющие  собой  мини-кольцевые  ДНК,  являются  великолепной 

природной векторной системой, которую в настоящее время используют для 

переноса  генов  в  растения.  Плазмида  содержит  Т-ДНК (transferred DNA)  

состоящую  из 12-22 тыс. пар оснований и  кодирующую ферменты синтеза 

фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые используются 

бактерией  как  источник  углерода,  азота  и  энергии.  Кроме  Т-ДНК,  в Ti-

 

292

плазмиде содержатся: vir-область, отвечающая за перенос Т-ДНК в растение; 

гены  утилизации  опинов;  а  также  локусы,  контролирующие  размножение 

плазмиды  в  бактериальной  клетке  и  ее  перенос  при  бактериальной 

конъюгации.  Плазмида  агробактерии  переносит  часть  своей  ДНК  в  ДНК 

растительной клетки, то есть в ДНК последней - встраивается «нужный» ген. 

Весь  процесс  вырезания  и  интеграции  Т-ДНК  в  растительную  хромосому 

осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Индукция vir-

генов  обратима,  что  очень  важно  для  патогена:  в  случае,  если  хозяин - 

больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется. 

Внедрение  Т-ДНК  в  растительный  геном  является  многоступенчатым 

процессом,  при  этом  в  геном  растения  могут  встраиваться  несколько  копий 

Т-ДНК. После встраивания в хромосому, Т-ДНК становится обычной частью 

генома  растения  и  транскрибируется  в  растительных  клетках  РНК-

полимеразой    растения-хозяина.  Сама  бактерия  в  клетку  не  проникает,  а 

остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со 

встроенной 

Т-ДНК 

как 

фабрику, 

продуцирующую 

опины.             

Т-ДНК Ti-плазмид  обладает  двумя  свойствами,  делающими  ее  по  существу 

идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-

первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки 

практически  всех  двудольных  растений  (иногда,  даже  однодольных,  в  том 

числе злаков). Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК 

наследуется  как  простой  доминантный  признак  в  соответствии  с  законами 

Менделя,  а  ее  гены  имеют  собственные  промоторы  (регуляторная  область 

гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых 

могут экспрессироваться  вставленные в Т-ДНК чужеродные гены. В целом 

идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна:  

-  содержать  все  сигналы,  необходимые  для  переноса  и  стабильной 

интеграции в ядерную ДНК растений;  

 

293

-  содержать  систему  для  экспрессии  чужеродных  генов  в  растениях 

(узнаваемый растительными полимеразами регулируемый промотор);  

-  содержать маркер (репортерный ген), который необходим для селекции 

трансформированных клеток;  

-  не  содержать  онкогенов,  то  есть  генов,  которые  подавляют 

дифференцировку растительных клеток.  

Сейчас  используют  широкий  арсенал  методов  для  получения  трансгенных 

растений.  Одним  из  способов  введения  Т-ДНК  в  клетки  растения    является 

использование бинарных векторных систем, создание которых заключается в 

том,  что  агробактериальная  клетка  должна  содержать  по  крайней  мере  две 

разные  модифицированные Ti-плазмиды.  Одна  из  них  должна  содержать 

только vir-область,  гены  которой  будут  участвовать  в  вырезании  Т-ДНК.  

Такие  плазмиды  называют  плазмидами-помощницами.  Вторая Ti-плазмида 

должна  содержать  область  Т-ДНК  с  нужным  встроенным геном.  Продукты 

vir-генов  способны  вырезать  Т-ДНК  как  на  собственной  плазмиде,  так  и  на 

соседней,  то  есть vir-гены  могут  работать  вне  зависимости  от  их 

местоположения.  Таким  образом,  если  клетки  агробактерии  содержат Ti-

плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный 

ген,  эти  бактерии  могут  трансформировать  клетки  растений.  Существуют  и 

другие  способы  введения  чужой  ДНК  в  клетки  растения.  Например,  можно 

ферментами  растворить  толстую  клеточную  оболочку  растительной  клетки, 

мешающую  прямому  проникновению  чужой  ДНК,  поместить  такие 

очищенные  клетки  в  раствор,  содержащий  ДНК  и  какое-либо  химическое 

вещество,  способствующее    проникновению  ДНК  в  клетку  (чаще  всего 

применяется  полиэтиленгликоль).  Иногда  в  мембране  клеток  короткими 

импульсами  высокого  напряжения  проделывают  микроотверстия,  через 

которые  в  клетку  могут  проходить  отрезки  ДНК.  В  некоторых  случаях 

применяют  даже  непосредственно  «впрыскивание»  ДНК  в  клетку 

микрошприцем  под  микроскопом.  Несколько  лет  назад  предложено 

 

294

покрывать  молекулами  ДНК  сверхмалые  металлические  «пули»,  например, 

шарики  из  вольфрама  диаметром 1-2 микрона,  а  затем  из  специального 

прибора «Shotgun» «стрелять» ими в растительные клетки. Проделываемые в 

стенке  клетки  отверстия  быстро  заживляются,  а  застрявшие  в  протоплазме 

«пули»  так  малы,  что  не  мешают  клетке  функционировать.  Часть  «залпа» 

приносит  успех - некоторые  «пули»  внедряют  свою  ДНК  в  нужное  место, 

осуществляя,  таким  образом,  трансформацию  растительных  клеток.  В 

последние  годы  ученые  используют  новый  подход  для  получения 

трансгенных растений с «antisense RNA» (перевернутой или антисмысловой 

РНК),  который  позволяет  управлять  работой  интересуемого  гена.  В  этом 

случае при конструировании вектора копию ДНК (кДНК) встраиваемого гена 

переворачивают  на 180

0

.  В  результате,  в  трансгенном  растении  образуется 

нормальная 

молекула 

мРНК 

и 

перевернутая, 

которая 

в 

силу 

комплементарности  нормальной  мРНК  образует  с  ней  комплекс  и 

закодированный белок не синтезируется.  Такой подход был использован для 

получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. 

В  вектор  была  включена  кДНК  гена PG, контролирующего  синтез 

полигалактуроназы (polygalacturonase) - фермента,  участвующего  в 

разрушении  пектина,  основного  компонента  межклеточного  пространства 

растительных  тканей.  Продукт  гена PG синтезируется  в  период  созревания 

плодов  томатов,  а  увеличение  его  количества  приводит  к  тому,  что  томаты 

становятся более мягкими, что, в свою очередь, значительно сокращает срок 

их хранения. Отключение этого гена  позволило получить растения томатов с 

новыми  свойствами  плодов,  которые  не  только  значительно  дольше 

сохранялись,  но  и  сами  растения  были  более  устойчивы  к  грибным 

заболеваниям. 

Наиболее  остро  стоит  вопрос  о  получении  растений,  устойчивых  к 

вредителям сельского хозяйства (прежде всего, к фитопатогенным грибам и 

насекомым),  так  как  болезни  растений  стали  основным  лимитирующим 

 

295

фактором получения урожая. Было обнаружено, что устойчивость растений к 

вредителям может быть запрограммирована генетически - введением в геном 

растений чужеродных генов, продукты которых вызывают гибель вредителя. 

Традиционно  для  этого  используют  ген bt, продуктом  которого  является 

бактериальный токсин, продуцируемый бактерией Bacillus thuringiensis. Этот 

крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt,  попадая в кишечник 

личинок  насекомых, разрушается  под  действием ферментов, а  его  фрагмент 

(эндотоксин)  приводит  к  гибели  насекомых.  Трансгенные  растения 

картофеля,  хлопка,  кукурузы  с  геном bt уже  производятся  фирмами 

«Monsanto», «Ciba Seeds» и успешно продаются на мировом рынке. 

Известно  также,  что  растения,  подобно  животным,  способны  вырабатывать 

иммунитет.  Однако,  этим  замечательным  свойством  обладают  только 

устойчивые  растения,  у  которых  при  атаке  патогенов  резко  меняется 

метаболизм. В результате, у этих растений накапливаются такие химические 

соединения,  как  перекись  водорода,  салициловая  кислота  и  фитоалексины. 

Повышенное  содержание  этих  соединений  способствует  противостоянию 

растения  в  борьбе  с  патогенами.  Например,  трансгенные  растения  табака, 

которые  содержат  бактериальный  ген,  контролирующий  синтез  салицилат 

гидролазы  (этот  фермент  разрушает  салициловую  кислоту),  были 

неспособны  к  иммунному  ответу.  Поэтому,  изменение  генно-инженерным 

путем  уровня  салициловой  кислоты  или  выработки  в  растениях  в  ответ  на 

патоген  перекиси  водорода,  может  быть  перспективным  для  создания 

устойчивых  трансгенных  растений.  Многообещающим  направлением  в 

генной  инженерии  растений  является  получение  трансгенных  растений 

содержащих  комбинацию  определенных  гормональных  генов  бактерий.  

Оказалось,  что  плоды  некоторых  из  таких  трансгенных  растений  являются 

партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Эти плоды 

характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их 

количеством, что позволяет решить проблему «лишних косточек», например 

 

296

в арбузе,  у цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, 

которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат 

семян. 

В  настоящее  время  во  всем  мире  активно  ведутся  работы  по  созданию  на 

основе трансгенных растений так называемых «съедобных вакцин», которые 

в  дальнейшем  можно  будет  использовать  для  предупреждения  наиболее 

опасных  болезней  человека.  Так,  например,  российскими  учеными 

Сибирского 

отделения 

РАН 

успешно 

ведется 

разработка 

противотуберкулезной  вакцины.  При  создании  вакцины  ученые  используют 

гены  человека,  кодирующие  синтез  специфических  антител  к  белкам 

возбудителя  болезни - Mycobacterium tuberculosis. Эти  антитела  и 

обеспечивают  иммунитет  к  данному  заболеванию.  Гены,  кодирующие 

антитела  против  туберкулеза,  встроили  в  геном  растительных  клеток.  Из 

клеток,  в  которых  удачно  произошло  встраивание  защитных  генов, 

регенерировали  полноценные  растения,  которые  обладают  способностью 

синтезировать антитела против туберкулеза. Традиционные методы лечения 

туберкулеза оказываются не всегда безвредными и эффективными, и ученые 

надеются,  что  использование  трансгенных  растений  дает  шанс  не  только 

избавиться от болезни, но и избежать побочных эффектов. Также в институте 

физиологии и биохимии растений СО РАН проводятся работы по созданию 

вакцины  против  СПИДа  и  гепатита  на  основе  трансгенеза  томата  и  огурца. 

Одновременно,  группе  немецких  ученых-генетиков  из Giessen University, 

Frankfurt  удалось  вырастить  генетически  модифицированную  морковь, 

которая  содержит  вакцину  против  гепатита  В,  что  позволяет  значительно 

снизить  затраты  на  профилактику  этого  заболевания  (по  официальной 

статистике  ВОЗ  около 350 млн.  человек  в  мире  инфицированы  вирусом 

гепатита В, который приводит к тяжелым повреждениям печени, хронизации 

процесса  и  смертельным  исходам,  ежегодно  унося  один  миллион 

человеческих  жизней).  Трансгенная  морковь  может  расти  в  разных 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  35  36  37  38   ..