Курс лекций по биотехнологии - часть 36

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  34  35  36  37   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 36

 

 

 

281

целому  организму,  однако,  реально  детерминируется  только  одна  из 400-

1000  клеток,  что,  по-видимому,  определяется  как  физиологическим 

состоянием  клетки,  так  и  ее  компетентностью.  Существенную  роль  в 

дифференциации  клеток  играют  как  генотип  растения - продуцента,  так  и 

условия культивирования.  Выращивание изолированных клеток и тканей на 

искусственных  питательных  средах  в  стерильных  условиях  происходит  

независимо  от  принадлежности  растений  к  той  или  иной  таксономической 

группе. Существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре 

in vitro. 

Асептика  является  обязательным  и  необходимым  требованием  для 

культивирования как отдельных клеток, так и каких-либо фрагментов ткани 

или  органа  растения  (экспланта).  На  растительных  тканях  может  оказаться 

эпифитная  микрофлора,  которая  в  дальнейшем  может  обнаружиться  и  в 

культуре  ткани.  Что  касается  внутреннего  инфицирования  самой 

растительной  ткани,  то  чаще  всего  оно  встречается  у  тропических  и 

субтропических  растений.  Поэтому,  кроме  поверхностной  стерилизации  с 

использованием  дезинфицирующих  веществ,  применяются  и  антибиотики, 

которые убивают микробную флору внутри ткани, однако,  здесь существует 

серьезная проблема подбора антибиотика направленного действия. 

Для успешного культивирования клеток и тканей какой-либо культуры 

растений необходимо учитывать влияние физических факторов на рост и 

физиологические характеристики этой культуры на уровне фенотипа и 

 

282

генотипа (рис.18). 

 

 

Рис. 18.     Физические факторы, влияющие на рост клеточной культуры 
 

Большинство  каллусных  тканей  растут  в  условиях  слабого  освещения,  так 

как они не способны к фотосинтезу. Но, в тоже время свет  может выступать 

и  как  фактор  морфогенеза,  активирующий  процессы  вторичного  синтеза.  В 

качестве источника света используются люминисцентные лампы. Примером 

влияния  освещенности  на  метаболизм  каллусных  клеток  является  культура 

чайного растения, у которого под действием света увеличивается биосинтез 

полифенолов. С другой стороны, в культуре клеток Scopolia parviflоra, тот же 

свет  подавляет  образование  алкалоидов.  Для  большинства  каллусных 

культур также важно оптимальное значение температурного фактора (около 

26

о

С).  

Из-за  низкой  интенсивности  дыхания  этих  клеток,  потребность  их  в 

кислороде,  соответственно,  понижена  и  поэтому  необходимость  в 

обеспечении  данных  культур  системой  интенсивной  аэрации  отпадает.  В 

Физические 
факторы

 

Температура 

Освещенность 

рН 

Аэрация 

Влажность 

 

283

связи  с  этим  при  внедрении  технологии  суспензионного  культивирования 

надо  подбирать  соответствующие  типы  биореакторов  с  объемом  не  более 

2000 литров и с системами особого перемешивания (турбинное, восходящим 

потоком  воздуха,  встряхиванием)  для  того,  чтобы  не  разрушить 

растительные  клетки.  При  сравнении  различных  типов  ферментеров  было 

установлено,  что  максимальный  синтез  вторичных  метаболитов  в 

суспензионной  культуре  происходит  при  подаче  воздуха  снизу.  Если  же 

выращивают  клетки  в  колбах  малого  объема,  то  аэрация  достаточна  при 

постоянном  перемешивании  суспензии.  Оптимальная  влажность  для  роста 

культуры  обычно  составляет 60-70%.  Весьма  существенным  в  вопросе 

обеспечения  роста  и  синтеза  продуктов  вторичного  метаболизма  является 

подбор  ингредиентов  среды  культивирования.  Особое  значение  для 

культивирования  изолированных  клеток  и  тканей  имеют  жидкие  и  твердые 

питательные  среды.  Они,  как  правило,  многокомпонентны,  имеют 

определенные  различия  по  составу  но,  в  тоже  время,  в  них  обязательно 

должны быть включены:  

- микроэлементы, 

- источники железа, 

- органические добавки - витамины, фитогормоны, 

- источники углеводов - сахароза или глюкоза,  

- органические добавки - ауксины и цитокинины (регуляторы роста растений, 

играющие роль пусковых механизмов). 

Сахароза  или глюкоза особенно необходимы для каллусных тканей, так как 

они  лишены  хлорофилла  и  не  способны  к  автотрофному  питанию. 

Обязательным  компонентом  питательной  среды  должны  быть  ауксины - 

индолилуксусная  кислота,  нафтилуксусная  кислота  и 2,4 дихлорфенокси- 

уксусная  кислота  и  цитокинины - 6-бензиламинопурин; N-изоптен, 6-

фурфуриламинопурин.  Ауксины  вызывают  дедифференцировку  клеток 

экспланта  и  повышают  продуктивность  культур  клеток,  являясь  пусковыми 

 

284

механизмами  первичного  и  вторичного  метаболизма.  Индуцируя  клеточное 

деление,  цитокинины  по-разному  влияют  на  накопление  вторичных 

метаболитов - одни не реагируют на внесение в среду цитокинина, например, 

(культура клеток Datura tatula); а другие, например, Scopolia maxima, активно 

образуют алкалоиды.    

Высокое  содержание  нитратов,  ионов  аммония,  калия,  фосфора 

координирует  скорость  роста  клеток  в  среде.  Истощение  среды  приводит  к 

снижению  как  роста  клеток,  так  и  процессов  вторичного  метаболизма.  Для 

синтеза  вторичных  метаболитов  весьма  существенным  является  внесение  в 

питательную  среду  предшественников,  стимулирующих    определенные 

ферментативные  пути  метаболизма.  Например,  внесение  фенилаланина  в 

среду  для  культивирования  клеток  увеличивает  выход  диосгенина  на 100%. 

При приготовлении твердых питательных сред для выращивания каллусных 

тканей  используют  очищенный  агар-агар,  представляющий  собой 

полисахарид, выделенный  из морских водорослей.   

При 

получении 

каллусных 

культур, 

сначала 

готовят 

эксплант, 

представляющий  собой  маленькие  кусочки  растительной  ткани (2-4 мм), 

которые  не  утратили  способность  к  репродукции.  Этот  растительный 

материал  тщательно  моют,  стерилизуют 96% спиртом  или 0,1% сулемы,  а 

затем снова тщательно промывают дистиллированной водой и помещают на 

синтетическую агаризованную питательную среду. Сосуды закрывают ватно-

марлевыми  тампонами.  Для  образования  каллуса  и  роста  ткани  сосуды 

переносят  в  темное  помещение,  где  поддерживают  определенную 

температуру (24-26

о

)  и  влажность (65-70%), при  этом  через 2-3 недели  на 

раневой  поверхности  образуется  первичный  каллус.  Каллусная  клетка 

развивается  аналогично  другим  клеткам,  проходя  соответственно,  такие 

циклы,  как  деление,  растяжение,  дифференцировка,  старение  и  отмирание. 

Кривая  роста  каллусной  ткани  имеет S-образный  характер  и  включает  пять 

фаз различной длительности у разных растений (Рис.19).  

 

285

Не существует однозначного ответа на вопрос, как связан синтез вторичных 

метаболитов с ростовыми процессами. У большого числа культур  вторичные 

метаболиты  синтезируются  и  накапливаются  в  значительных  количествах 

либо  во  время  экспоненциальной  фазы,  когда  ростовые  процессы  особенно 

активны,  либо  в  период  стационарной  фазы  роста  культуры  клеток,  когда 

прирост  клеточной  массы  прекращается.  Однако  есть  культуры, (например, 

культура  клеток Catharanthus roseus), у  которых  синтез  вторичных 

метаболитов сопровождает весь период роста. Синтез вторичных соединений 

может  коррелировать  с  процессом  дифференцировки  в  культуре  клеток. 

Например, в суспензионной культуре Papaver somniferum синтез алкалоидов 

начинается  после  того,  как  в  ней  дифференцируется  достаточно    большое 

количество    специализированных  клеток  млечников,  предназначенных  для 

депонирования метаболитов.  

С другой стороны, культуры клеток табака и моркови синтезируют большое 

количество  никотина  и  антоцианина,  соответственно,  хотя  их  клетки  слабо 

дифференцированы.  Синтез  вторичных  метаболитов  в  культивируемых 

клетках связан с внутриклеточными органеллами, в основном с пластидами и 

эндоплазматическим  ретикулумом.  В  клетках,  не  способных  к  транспорту 

метаболитов,  продукты  вторичного  синтеза  обычно  накапливаются  в 

вакуолях и свободном пространстве  клеток. 

Важная  особенность  культивируемой  популяции  клеток - ее  стабильность  в 

отношении  синтеза  и  накопления  вторичных  метаболитов.  Необходимо 

отметить,  что  клетки  каллусной  культуры  обычно  не  транспортируют 

синтезируемые  метаболиты  в  питательную  среду  или  другие  клетки,  хотя 

некоторые  культуры  составляют  исключение,  в  частности,  культура  клеток 

мака,  которые  депонируют  алкалоиды  в  млечники.  Очень  важно,  что 

каллусные  культуры  сохраняют  многие  физиологические  особенности 

растения,  из  которого  они  были  получены  (например,  морозостойкость, 

устойчивость  к  внешним  воздействиям,  способность  к  синтезу  вторичных 

метаболитов и т.д.). 

 

286

 

  

 

              

- Латентная (лаг-фаза -  клетки адаптируются и готовятся к делению)

       

 

              

- Линейная (рост каллусной ткани идет с постоянной скоростью)

 

 
              

-

 Э

кспоненциальная (время максимальной митотической активности; рост 

                   клетки ускорен, масса каллуса увеличивается)

            

                      
              -

 Стационарная (интенсивность деления резко снижается)

      

                                               
               - 

Отмирания

          

                                  
                

Рис. 19.              Кривая роста каллусной ткани 

1

3

4

5

Фазы 
культивирования

Количество 
клеток 

 

287

 
Стабильность  синтеза  вторичных  метаболитов  как  целевого  продукта,  как 

правило, зависит от стадии культивирования и дифференцировки клеток. 

Например,  дифференцированные  корневые  каллусы Atropa belladonna 

синтезируют    тропановые  алкалоиды,  а - недефференцированные  уже  не 

способны  к  их  синтезу.  Но,  с  другой  стороны,  недифференцированные 

клетки Rauwolfia serpentina способны синтезировать индолиловые алкалоиды 

с  достаточно  большим  выходом  метаболитов.  Исходя  из  этого,  можно 

сделать  вывод,  что  морфологическая  специализация  клеток  не  является 

основной предпосылкой для синтеза  БАВ. 

В настоящее время промышленный синтез вторичных метаболитов на основе 

суспензионных культур клеток является перспективным и рентабельным, так 

как  производство  растительного  сырья  для  него  не  зависит  ни  от 

климатических  факторов,  ни  от  повреждения  насекомыми.  Каллусные 

культуры выращивают на малых площадях  и в дальнейшем используют для 

синтеза  практически  всех  классов  соединений.  Причем  выход  вторичных 

метаболитов - несопоставимо  более  высок  по  сравнению  с  их  синтезом  в 

целых растениях.  

Использование  технологий  получения  каллусных  культур  из  растительного 

сырья  даёт  такие  преимущества  как  надежность  и  стабильность  по  выходу 

биомассы  и  продуктов  вторичного  метаболизма,  а  также  возможность 

использования  каллусной  системы  для  иммобилизации  с  последующей 

биотрансформацией.  Недостаток  только  один - необходимость  применения 

ручного труда. 

Если  сравнивать  между  собой  каллусные  и  суспензионные  культуры,  то 

оказывается,  что  выход  продуктов  вторичного  метаболизма  выше  именно  в 

каллусных  культурах, но при этом управление процессом культивирования 

легче осуществлять при работе с суспензионными культурами.  

 

288

При  промышленном  выращивании  суспензионных  культур  применяют 

биореакторы,  в  которых  процессы  глубинного  культивирования  ведут  к 

увеличению  биомассы  и  синтезу  вторичных  соединений.  В  зависимости  от 

культуральной  жидкости  различают  биореакторы,  в  которых  суспензионная 

культура  перемешивается  только  за  счет  подачи  воздуха  и  биореакторы,  в 

которых  суспензионная  культура  перемешивается  механическим  способом 

(см.п.4.1.рис.10). 

Выращивание культур растительных клеток в биореакторах проводят в двух 

режимах: 

Первый - периодическое  культивирование,  при  котором  по  окончании 

процесса биосинтеза откачивают и используют всю суспензию клеток. 

Второй - полупериодическое  культивирование,  при  котором  в  биореактор 

постоянно  добавляют  определенный  объём  свежей  питательной  среды  и 

одновременно  забирают  тот  же  объем  либо  клеточной  суспензии  (открытое 

проточное  культивирование),  либо  тот  же  объем  отработанной  питательной 

среды,  оставляя  при  этом  клеточную  массу  в  реакторе  (закрытое  проточное 

культивирование). 

Причем  существуют  также  две  разновидности  открытого  проточного 

культивирования: 

1.  Турбидостат – автоматическое  поддержание  концентрации  клеточной 

биомассы в реакторе на одном уровне путем изменения скорости протока.  

2.  Хемостат - в  биореактор  с  постоянной  скоростью  подаётся  питательный 

раствор  при  одновременном  откачивании  с  той  же  скоростью  клеточной 

суспензии.  

В  настоящее  время  существует  также  технология  получения  вторичных 

метаболитов с помощью иммобилизованных клеток каллусной культуры. Их 

помещают  (встраивают)  в  определенные  носители:  альгинат  кальция; 

агарозные шарики; трехмерные сетчатые структуры из нейлона, порошкового 

металла,  полиуретана  (в  частности,  такие  системы  используются  для 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  34  35  36  37   ..