Курс лекций по биотехнологии - часть 35

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  33  34  35  36   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 35

 

 

 

273

кислых  протеаз  характерны  некоторые  общие  признаки.  Они  стабильны  в 

кислой  среде  (рН  2.0 - 5.0); оптимум

   

действия  при  рН 1.5 – 5.0 и  быстро 

инактивируются при

 

нейтральном значении рН.

 

Пепсин и химозин не имеют  

α-спиралей,  но  характеризуются  наличием  антипараллельной    β-структуры.

  

Японские  исследователи  полагают,  что  устойчивость  кислых  протеаз  при 

низких  значениях  рН    связана  именно  с  этой  особенностью  их  вторичной 

структуры.

 

      

Тиолзависимые  или  цистеиновые  протеазы  в  медицинской  практике 

представляют  папаин  из  дынного  дерева,  фицин  из  латекса  растений, 

бромелин  из  плодов  ананаса  и  ряд  ферментов  из  микроорганизмов. 

Цистеиновые  протеазы  содержат  в  активном  центре  триаду  аминокислот - 

цистеин-гистидин-аспарагиновая  кислота.  Активность  тиоловых  протеаз 

подавляется  специфическими  блокаторами  сульфгидрильных  групп 

(йодацетатом,  йодацетамидом,  П-хлормеркурибензоатом,  ионами  тяжелых 

металлов).  Их  максимальная  активность  проявляется  при

 

рН

 

от 6.0 до 9.5. 

Папаин  и  химопапаин  устойчивы

 

к  действию  температуры.  Отличительной 

особенностью  этих  ферментов  является  их  высокая  устойчивость

 

к 

денатурирующим  веществам,  например,  в 6-8М  мочевине  или  в 70% 

метиловом  спирте  их  активность  не  изменяется.  При  изучении  их 

гидролитической  активности  было показано, что  эти  ферменты  расщепляют 

белки  глубже,  по  сравнению  с  ферментами  животного  и  бактериального 

происхождения.  Так  папаин  способен  гидролизовать  практически  любые 

пептидные  связи.  Кроме  пептидных  связей  тиолзависимые  ферменты 

гидролизуют  также  амидные  и  эфирные  связи.  Бромелин,  папаин  и  фицин 

используются 

в 

медицине 

для 

лизирования 

нежизнеспособных 

некротических  тканей  при  лечении  гнойно-воспалительных  процессов.  В 

результате энзиматического очищения ран, сроки заживления сокращаются в 

1,5-2  раза.  Бромелин,  папаин  и  фицин  применяются  в  заместительной 

терапии  при

 

нарушении  пищеварения,  а    также  как  отмечалось  выше,  в 

 

274

акушерской  практике  при

 

выявлении  и  предотвращении  резус-конфликтных 

ситуаций.  

Класс нейтральных или металлопротеаз - это группа ферментов, в основном, 

микробного  происхождения.  Нейтральные  протеазы  в  активном  центре 

содержат  ионы  металлов  Са

2+

  и Zn

2+

.

 

Эффективные  при  нейтральных 

значениях рН, металлопротеазы проявляют 

строго 

эндопептидазную 

активность 

и 

не 

расщепляют 

пептидные 

связи, 

образованные 

аминокислотными  остатками  со  свободной  NН

2

  и  СООН  группами. 

Нейтральные протеазы гидролизуют казеин, желатин, яичный альбумин и, в 

отличие от субтилизинов,  не  

обладают  эстеразным 

действием. 

В 

медицинской  практике  широко

 

используется  террилитин

 

из Aspergillus 

terricola для лечения острых

 

гнойных заболеваний и трофических язв. В виде 

ингаляций террилитин применяется для лечения воспалительных процессов в 

легких.  Другая  нейтральная  протеаза  микробного  происхождения - 

коллагеназа  применяется  в  глазной  хирургии

 

для  рассасывания  рубцовой 

ткани. 

Несмотря на то, что уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов - 

рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома С, трудно ожидать, что 

синтетическое  получение  ферментов  получит  широкое  распространение  в 

ближайшие  десятилетия  ввиду  его  сложности  и  дороговизны,  поэтому 

единственный  реальный  в  настоящее  время  способ  получения  ферментов – 

это  выделение  их 

из 

биологических  объектов.  Выделяют 

ферменты  так  же,  как  и  другие  белки,  хотя  есть  приемы,  применяемые 

преимущественно  для  ферментов.  Из  них  можно  отметить  экстракцию 

глицерином,  в  котором  сохраняются  нативные  свойства  ферментов,  а  также 

метод  ацетоновых  порошков,  заключающийся  в  осаждении  и  быстром 

обезвоживании (при температуре не выше 10°С ) тканей или вытяжек из них, 

содержащих  ферменты.  Также  к  числу  таких  методов  относится  получение 

ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. 

 

275

Сейчас  адсорбционный  метод  выделения  и  очистки  ферментов  разработан 

детально.  Одна  из  модификаций  адсорбционного  метода - афинная 

хроматография,  где  адсорбентом  служит  вещество,  с  которым  фермент 

взаимодействует  избирательно.  В  результате,  лишь  этот  фермент 

задерживается  на  колонке,  а  все  сопутствующие  ему  вещества  выходят  с 

током проявителя. Изменяя характер проявителя, нужный фермент элюирует 

с  колонки.  Этим  методом  достигают  очистки  фермента  в  несколько  тысяч 

раз,  применяя  всего  лишь  одноступенчатую  (аффинная  сорбция - элюция) 

схему  выделения.  Наряду  с  ним  широко  применяют  метод  ионообменной 

хроматографии,  метод  молекулярных  сит,  электрофорез  и,  особенно, 

изоэлектрофокусирование.  Для  успешного  выделения  ферментов  из 

клеточного  содержимого  необходимо  очень  тонкое  измельчение  исходного 

материала,  вплоть  до  разрушения  субклеточных  структур:  лизосом, 

митохондрий,  ядер  и  др.,  которые  несут  в  своем  составе  многие 

индивидуальные  ферменты.  Особое  внимание  при  выделении  ферментов 

уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию 

белка, которая ведет к потере ферментативной активности. Поэтому, данные 

технологические  операции  проводят  в  присутствии  защитных  добавок,  в 

частности, SH-содержащих 

соединений 

(цистеина, 

глутатиона, 

меркаптоэтанола,  цистеамина  и  др.).  Очень  важно  поддерживать  на  всех 

этапах  выделения  ферментов  низкую  температуру,  так  как  некоторые  из 

ферментов даже при 80°С теряют  активность. 

Для  оценки  гомогенности  ферментного  препарата  прибегают  к  обычным 

методам  белковой  химии.  О  степени  чистоты  ферментного  препарата,  как 

правило,  судят  по  его  биологической  активности - если  активность  при 

дальнейшей очистке не возрастает, препарат можно считать гомогенным.  

В  качестве  примера    можно  привести  краткие  технологические  схемы 

получения трех ферментов: террилитина, стрептокиназы и липазы. 

 

276

Протеолитический  ферментный  препарат  террилитин  получают  путем 

культивирования штамма Aspergillus terricola с последующим отделением от 

мицелия.  Затем  полученный  нативный  раствор  освобождают  от  пигментов 

пропусканием 

через 

анионит 

(продукт 

поликонденсации 

феноксипроизводных  формальдегида  при  нейтральном  рН).  Далее,  методом 

ультрафильтрации  раствор  ферментов  обессоливают  и  концентрируют; 

полученный концентрат лиофилизируют. С целью сокращения длительности 

процесса  и  увеличения  выхода  целевого  продукта,  депигментированный 

нативный  раствор  дополнительно  очищают  от  высокомолекулярных 

балластных веществ. 

Стрептокиназу  получают  путем  непрерывного  культивирования  продуцента 

Streptococcus egyisimilis на питательной среде, включающей мясопептонный 

бульон,  содержащий  настой  из  говяжьих  сердец,  глюкозу  и  бикарбанат 

калия.  Подачу  питательной  среды   регулируют  в  зависимости  от  изменения 

рН  культуральной  взвеси.  Далее  целевой  продукт  выделяют  и  очищают.  С 

целью  повышения  выхода  целевого  продукта,  питательную  среду  перед 

культивированием нагревают до  заданного значения рН. 

Липазу  получают  из  семян  хлопчатника,  которые  облучают  в  течение 

определенного  времени  импульсным  концентрированным  светом.  Затем 

семена  проращивают  в  темноте.  Проросшие  семена  измельчают  и 

обрабатывают  ацетоном.  Далее,  путем  последовательного  осаждения  

раствором  сульфата  аммония  и  ацетона,  липазу  выделяют  из  ацетонового 

экстракта. С целью увеличения выхода целевого продукта и повышения его 

активности, перед облучением семена предварительно замачивают. 

Контрольные вопросы к главе 8 

 

1.  Какие 

химические 

модификации 

стероидной 

молекулы 

осуществляются с помощью биотрансформации? 

 

277

2.  Что  служит  основным  источником  сырья  для  производства 

стероидных препаратов и почему? 

3.  На 

чем 

основан 

выбор 

микроорганизмов, 

способных 

трансформировать стероиды? 

4.  Что лежит в основе классификации витаминов? 

5.  Какие методы доминируют в производстве витаминов? 

6.  Какая 

стадия 

получения 

аскорбиновой 

кислоты 

является 

биотехнологическим методом? 

7.  Какие лекарственные препараты на основе аминокислот существуют? 

8.  В чем отличие биосинтеза треонина от лизина? 

9.  Каковы причины развития дисбактериоза? 

10. Какие  требования  предъявляются  к  производственному  штамму 

микроорганизма симбионта? 

11. Какие основные классы ферментов существуют? 

12. Каковы особенности методов очистки и выделения ферментов? 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

278

Глава  9.      Биотехнология  лекарственных  средств  на  основе  культур 

растительных клеток и тканей 

9.1.   Общая характеристика 

   Одним  из  главных  механизмов,  поддерживающим  стабильность  жизни 
на  Земле,  является  сохранение  разнообразия,  взаимосвязанного  и 

взаимозависимого  сосуществования  человека  и  природы.  Так  академик 

Г.Ф.Гаузе  доказал,  что  устойчивость  сообщества  тем  выше,  чем  больше 

число  составляющих  его  видов.  Рост  городов,  вырубка  лесов,  ухудшение 

экологии, усиленная эксплуатация дикорастущих и плантационных растений, 

как традиционного источника лекарственных средств, приводят к растущему 

дефициту  сырья.  Многие  виды  растений  находятся  на  грани  вымирания. 

Использование  культур  клеток  и  тканей  растений  помогает  спасти  от 

уничтожения,  ставших  уже  редкими,  тысячи  дикорастущих  растений, 

которые  синтезируют  необходимые  для  жизнедеятельности  человека 

вещества. Культивирование растительных клеток и тканей на искусственной 

питательной  среде  в  биореакторах,  помимо  решения  ряда  экономических, 

экологических  и  технологических  задач  позволяет,  в  частности,  преодолеть 

ряд проблем: 

-  свести  к  минимуму  влияние  климатических,  сезонных  и  географических 

условий; 

- уменьшить количество посевных площадей почвы в хозяйственном обороте 

страны; 

-  получать  уже  известные,  присущие  интактному  растению  вещества, 

например,  никотин,  кодеин,  хинин,  диосгенин  и  синтезировать  новые 

биологически активные соединения. 

-  использовать  культуры  растительных  клеток  для  биотрансформации 

конечных продуктов. 

 

279

Использование  новых  технологий  получения  биомассы  лекарственных 

растений  (содержащих  то  или  иное  активное  начало)  в  виде  каллусных  и 

суспензионных культур имеет следующие преимущества: 

1. стандартность накапливаемого сырья; 

2. высокий выход активного начала (на примере культивироавния женьшеня: 

рентабельность  производства  стала  возрастать  при  внедрении  технологии 

получения  «бородатых  корней»,  где  по  условиям  роста  и  скопления  клеток 

возникают  субпопуляции  с  повышенной  дифференцировкой - это  самые 

продуктивные клетки по биоактивным веществам); 

3.  сокращение  сроков  культивирования  для  накопления  растительной 

биомассы; 

4.  возможность  промышленного  производства  биомассы  экзотических 

растений,  малодоступных  для  нашей  страны,  например,  таких  как 

раувольфия, диоскорея, унгерия и др.; 

5. использование разных технологических режимов; 

6.  использование  методов  иммобилизации  и  биотрансформации  для 

повышения  выхода  продуктов  вторичного  метаболизма  применительно  к 

растительным клеткам. 

Однако,  растительные  клетки  и  ткани  имеют  свои  особенности,  которые 

затрудняют  работу  с  их  культурами  (по  сравнению  с  клетками 

микроорганизмов).  Специфика  растительных  клеток  заключается  в 

следующем: 

1.  клетки  растений  имеют  размеры  от 15 до 1000 мкм,  что  в 50-100 раз 

больше, чем у клеток бактерий;  

2. в результате роста клеток растений у них появляется большая вакуоль, при 

этом все физические и химические константы клеток изменяются; 

3. суспензионные культуры состоят из клеток - агрегатов разного размера; 

4.  культуры  клеток  растений  имеют  целлюлозную  стенку,  что  существенно 

затрудняет работу биотехнолога с такими культурами. 

 

280

Промышленный  способ  выращивания  изолированных  культур  дает 

возможность  за  сравнительно  короткий  срок (30-45 суток)  получить 

значительный  объем  ценного  лекарственного  сырья,  используя  каллусные  и 

суспензионные культуры. 

Метод получения лекарственных средств на основе культур клеток растений 

начинается  с  процесса  получения  культуры  каллусной  ткани  или  каллуса. 

Впервые каллусная культура была получена в 1902 г. Каллус (от латинского 

callus- толстая кожа, мозоль) - представляет собой ткань, которая образуется 

в местах  повреждения органов растения  (спонтанная  пролиферация клеток 

растения)  и  используется  для  получения  изолированных  тканей  и  клеток 

растения.  Культура  куллусной  ткани  состоит  из  сообщества  клеток, 

выращиваемых на искусственной питательной среде. До середины 50-х годов 

прошлого  века  культуры  каллусных  тканей  использовали  как  модельную 

систему  для  исследования  физиологических  и  биохимических  процессов  в 

работе  с  изолированными  клетками  и  органами  растений.  Через  некоторое 

время  было  доказано,  что  культуры  клеток  растений  на  искусственных 

питательных  средах  могут  синтезировать  различные  вещества,  присущие 

интактному растению, то есть могут быть продуцентами БАВ (биологически 

активных веществ). В этой связи необходимо рассмотреть такое понятие как 

тотипотентность - способность  любой  клетки  образовывать  полноценное 

растение,  что  предопределено  её  генетическим  потенциалом.  Все  типы 

дифференцировки:  образование  отдельных  дифференцированных  клеток; 

образование  тканей;  образование  органов  (органогенез) - возможны 

благодаря  тотипотентности,  то  есть  любая  растительная  клетка  содержит 

полный  набор  генов  того  организма,  из  которого  она  была  выделена.  В 

культуре  каллусных  тканей  морфогенезом  называют  возникновение 

организованных  структур  из  неорганизованной  массы  клеток,  поэтому  

морфогенез  в  них  можно  рассматривать  как  проявление  тотипотентности 

растительных клеток. Каждая клетка каллусной культуры может дать начало 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  33  34  35  36   ..