Курс лекций по биотехнологии - часть 34

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  32  33  34  35   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 34

 

 

 

265

(витамины,  аминокислоты,  пуриновые  и  пиримидиновые  основания, 

микроэлементы).  Для  культивирования  этих  бактерий  используют  такое 

сырье,  которое  разрешено  к  применению  в  пищевой  промышленности,  так 

как  препарат,  выращенный  на  этих  средах  впоследствии  используется  для 

внутреннего  применения.  Источником  аминокислот  обычно  служит  белок 

молока  (казеин),  который  гидролизуют  с  помощью  ферментов  (трипсина  и 

пепсина)  и  получают,  соответственно,  триптол  или  пептол.  В  качестве 

источников  витаминов,  а  также  пиримидиновых  и  пуриновых  оснований, 

используют  дрожжевой  экстракт,  который  получают  из  дрожжей  рода 

Saccharоmyces - пивные  дрожжи  (либо  пекарские  дрожжи),  то  есть  те 

дрожжи,  которые  используются  в  пищевой  промышленности.  В  качестве 

микроэлементов  используют  соли  магния,  марганца,  цинка,  которые 

добавляют  в  питательную  среду  для  культивировния  молочнокислых 

бактерий. Источником энергии, как правило, служит лактоза или глюкоза.  

Обычно молочнокислые бактерии культивируют от 8 до 16 часов (довольно 

короткая  ферментация).  Собирают  штаммы  в  той  фазе  роста,  при  которой 

выживание клеток культуры будет наиболее длительным, что в свою очередь, 

при  дальнейшем  получении  препарата,  обеспечивает  его  длительное 

хранение.  Находится  это  экспериментальным  путем  и  часто  бывает  «ноу-

хау»  фирмы  производителя.  Как  правило,  берется  конец  логарифмической 

фазы или начало стационарной, в зависимости от культуры (штамма). После 

завершения процесса культивирования получается бактериальная суспензия, 

которая в 1 мл содержит 10

9

 и более клеток. Эти клетки собирают, используя 

поточные  центрифуги  или  сепараторы.  При  этом  получается  похожая  на 

сметану  с  кремоватым  оттенком  масса  со  специфическим  запахом  кислого 

молока  (напоминает    прессованные  дрожжи).  Раствор  криопротекторов 

(вещества белковой природы - обезжиренное молоко или желатин;  углеводы 

–  лактоза,  сахароза)  добавляют  в  проточную  массу  и  получают  густую 

суспензию  клеток,  которую  разливают  в  ампулы.  Затем  их  замораживают  в 

 

266

атмосфере жидкого азота и  подвергают лиофильной сушке. При этом сухая 

масса  приобретает  пузырчатый  вид.  Ее  измельчают  и  определяют  титр,  в 

соответствии с которым вносят во флаконы (стеклянные, пластмассовые) или 

смешивают  с  культурой  другого  штамма.  В  последнем  случае  получают 

несколько видов микроорганизмов симбионтов.  

Форма  выпуска - флаконы  (бифидумбактерин)  или  ампулы  (бификол - 

содержит  бифидобактерии  и  кишечную  палочку),  или  капсулы  (индийский 

препарат  "Нутролин  В",  который  содержит  штаммы  лактобацилл),  или 

пакетики (бифидумбактерин - фирма "Партнер" Россия). 

8.5.   Ферменты  

   Ферменты  или  энзимы (fermentum – «закваска», enzyme – «в  дрожжах») - 

высокомолекулярные 

соединения 

белковой 

природы, 

являющиеся 

катализаторами  биохимических  реакций  в  живых  организмах  и    вне    их.  К 

настоящему  времени  найдена  лишь  одна  ферментативная  реакция 

небелковой  природы,  когда  молекула  РНК  катализирует  собственное 

«разрезание» на части. 

В  живой  клетке  множество  разнообразных  соединений,  но  реакции  между 

ними  не  беспорядочны,  а  образуют  строго  определенные  метаболические 

пути, характерные  для  данной  клетки.  Индивидуальность  клетки в большой 

степени  определяется  уникальным  набором  ферментов,  который  она 

генетически  запрограммирована  производить.  Отсутствие  даже  одного 

фермента  или  какой-нибудь  его  дефект  могут  иметь  очень  серьезные 

отрицательные последствия для организма. 

Все  ферменты  относятся  к  глобулярным  белкам,  причем  каждый  фермент 

выполняет  специфическую  функцию,  связанную  с  присущей  ему 

глобулярной  структурой.  Однако,  активность  многих  ферментов  с  большой 

молекулярной  массой (в  диапазоне  от 10 000 до 1 000 000 дальтон и более,  

для сравнения  молекулярная  масса глюкозы – 180, диоксида углерода – 44, 

аминокислот – от 75 до 204)

 

зависит  от  небелковых  низкомолекулярных 

 

267

соединений,  называемых  кофакторами.  Молекулярный  комплекс  белковой 

части  (апофермента)  и  кофактора  называется  холоферментом.  Роль 

кофактора могут выполнять ионы металлов (Zn

2+

, Mg

2+

, Mn

2+

, Fe

2+

, Cu

2+

, K

+

Na

+

)  или  сложные  органические  соединения.  Органические  кофакторы 

обычно  называют  коферментами,  некоторые  из  которых    являются 

производными  витаминов.  Тип  связи  между  ферментом  и  коферментом 

может  быть  различным.  Иногда  они  существуют  отдельно  и  связываются 

друг  с  другом  только  во  время  протекания  реакции.  В  других  случаях 

кофактор  и  фермент  связаны    постоянно  и  иногда  прочными  ковалентными 

связями.  В  последнем  случае  небелковая  часть  фермента  называется 

простетической группой. Важнейшими коферментами являются производные 

витаминов,  кофакторами - минералы  (макро-  и  микроэлементы).  При 

дефиците витаминов и минералов активность ферментативных реакций резко 

падает, с чем связаны многие патологические процессы в организме. 

Ферменты  делятся  на  простые  и  сложные.  Простые  состоят  только  из 

аминокислот,  а  сложные  (их  большинство)  помимо  белка  включают 

небелковую группу (кофактор или кофермент). 

     

Особенностью ферментов является их исключительно высокая активность 

(они  ускоряют  реакции  в  миллиарды  раз).  Так  одна  единственная  молекула 

фермента  может  катализировать  при  обычной  температуре  превращение  от 

тысячи  до  миллиона  молекул  вещества  в  минуту.  Эта  скорость  катализа 

недостижима  для  небиологических  катализаторов.  Другое,  не  менее  важное 

свойство  ферментов – специфичность  (избирательность)  их  действия  в 

отношении  структуры  субстрата,  типа  реакций  и  условий  ее  проведения. 

Ферменты,  обладая  высокой  специфичностью,  направляют  превращение 

вещества в строгое русло. Они катализируют реакции в мягких условиях, то 

есть  при  обычном  давлении,  небольшой  температуре  и  значениях  рН, 

близких  к  нейтральным,  однако,  они  весьма  чувствительны  к  сдвигам  рН 

среды  и  изменению  температуры.  Так  как  максимальная  активность 

 

268

фермента  обусловлена  оптимальной  конформацией  молекулы  фермента  в 

целом  и  активного  центра  в  частности,  то  даже  небольшие  изменения 

окружающих  условий,  которые  затрагивают  связывание  субстрата  или 

конформацию третичной структуры белка,  будут, соответственно,  влиять на 

скорость ферментативной реакции. Оптимальное  рН для каждого фермента 

означает,  что  состояние  его  ионизации  соответствует  наилучшей 

комплементарности.  Изменение  температуры  вызывает  противоречивый 

эффект: с одной стороны, при повышении температуры до 37 - 40

о

 скорость 

ферментативной  реакции  увеличивается,  что  закономерно  для  катализа;  с 

другой  стороны,  при  температуре  более 50

о

  начинается  денатурация 

фермента.  Ферментативные  процессы  не  дают  побочных  реакций,  для  них 

характерен 100% выход целевого продукта. Ферменты регулируемы, то есть 

они  могут  изменять  свою  активность  под  воздействием  ряда  факторов,  при 

этом  выход  целевого  продукта  будет  разным.  Этим  обеспечивается 

скоординированность всех метаболических процессов 

во 

времени. 

Скорость  ферментативной  реакции  прямо  пропорциональна  количеству 

фермента,  поэтому  недостаток  фермента  в  организме  означает  низкую 

скорость превращения какого-либо соединения, и наоборот, одним из путей 

приспособления  организма  к  изменениям  внешней  среды  является 

увеличение количества требуемого фермента.  

В  настоящее  время  известно  более 6000 ферментов,  многие  из  которых 

катализируют только одну реакцию; 150 из них выделены в кристаллическом 

виде.

 

Энзимы  классифицируются  не  как  индивидуальные  вещества,  а  как 

катализаторы определенных химических превращений или групп химических 

превращений,  в  соответствии  с  этим  их  подразделяют  на  шесть  основных 

классов:  

1.  Оксидоредуктазы - катализаторы  окислительно-востановительных 

реакциий 

 

269

2. 

Трансферазы - реакции  переноса  отдельных  групп  с  одной  молекулы 

на другую

 

3. 

Гидролазы - гидролитическое расщепление связей (с участием воды)

 

4. 

Лиазы  (синтазы) - реакции  соединения  или  расщепления  молекул 

(присоединения-отсоединения воды, аммиака, СО

2

 и т.д.)

 

5. 

Изомеразы - взаимопревращение  различных  изомеров  (изменение 

строения  внутри 

одной 

молекулы)

 

     6.   Лигазы (синтетазы) - образование связей в реакции конденсации двух  

           различных  соединений 

с 

участием  энергии 

АТФ

 

Осознание ключевой роли ферментов во всех клеточных процессах привело к 

широкому их применению в различных отраслях народного хозяйства, в том 

числе  при

 

производстве  лекарственных  средств,  а  также  в  медицинской 

практике в качестве лечебных и диагностических препаратов.  

В  настоящее  время    для  фармацевтических  целей    применяется  свыше 40 

ферментных  препаратов  животного,  растительного  и  микробного 

происхождения.  Получен  ряд  препаратов  протеолитического  действия 

(трипсин, химотрипсин  и  др.); специальные  фибринолитические  препараты 

(фибринолизин,  стрептолиаза  и  др.);  препараты,  деполимеризующие  РНК  и 

ДНК  (рибонуклеаза,  дезоксирибонуклеаза);  препараты,  уменьшающие 

вязкость гиалуроновой кислоты (лидаза, ронидаза) и др. Эти препараты часто 

используются  при  лечении  заболеваний,  сопровождающихся  гнойно-

некротическими процессами, при тромбозах и тромбоэмболиях, нарушениях 

процессов  пищеварения  и  др.  Ферментные  препараты  находят  также 

применение при лечении онкологических заболеваний (аспарагиназа). Новые 

перспективы  успешного  применения  ферментных  препаратов  открывает 

разработка  новых  лекарственных  форм - иммобилизованных  ферментов 

(стрептодеказа).  Одновременно  стал  расширяться  круг  лекарственных 

средств,  действие  которых  связано  с  инактивированием  ферментов.  К  ним 

относятся ингибиторы протеолитических ферментов (пантрипин, ингитрил и 

 

270

др.),  широко  применяемые  при  лечении  острых  панкреатитов  и  других 

заболеваний;  избирательно  действующие  ингибиторы  фибринолиза 

(аминокапроновая 

кислота 

и 

др.), 

применяемые 

в 

качестве 

антигеморрагических  средств;  также  большая  группа  антихолинэстеразных 

препаратов; 

ингибиторы 

моноаминоксидазы, 

применяемые 

как 

психотропные  средства;  ингибиторы  карбоангидразы,  используемые  в 

качестве  диуретиков.  Эффективность  аллопуринола  при  гиперурикемии 

связана с ингибированием им фермента ксантиноксидазы. Действие тетурама 

при  лечении  алкоголизма  связано  с  угнетением  им  фермента 

ацетальдегидоксидазы.  Важную  группу  лекарственных  веществ  составляют 

реактиваторы  ферментов,  восстанавливающие  инактивированную  функцию 

ферментов (реактиваторы холинэстеразы). 

Путем  микробиологического  синтеза  для  медицинских  целей  получают 

следующие ферментные препараты: 

-  солизим,  гидролизующий  жиры  липолитический  фермент,  который

 

применяется при

 

хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта;  

-  α  амилаза,  сахаролитический  фермент,  гидролизующий    крахмал,  ис-

пользуется  в  составе  лечебного  препарата  «фестал»  при

 

недостаточной 

функции поджелудочной железы; 

-  террилитин  (протеолитический  фермент),  который  рекомендуется  для 

лечения гнойных ран ожогов, трофических язв; 

-  стрептокиназа  (фибринолитический  фермент),  эффективна  при

 

лечении 

тромбозов; 

-  галактозидаза  (сахаролитический  фермент)  хорошо

 

зарекомендовавшая 

себя для лечения лактазной недостаточности. 

Традиционные  биотехнологии,  основанные  на  переработке  тканей 

животных,  поставляют в медицинскую практику: 

- трипсин, химотрипсин (протеолитические ферменты), используемые для 

рассасывания рубцов и спаечных процессов; 

 

271

-  урокиназу  (протеолитическмй  фермент)  предназначенную  для  лечения 

тромбозов; 

-  пепсин  (протеолитический  фермент),  незаменим  при  расстройствах 

пищеварения. 

   Те  же  традиционные  биотехнологии,  но  основанные  на  переработке 

растительного  сырья,

 

дают  такие  протеазы  как  бромелин,  папаин,  фицин, 

которые  используются

 

в  заместительной  терапии  при

 

нарушении 

пищеварения,  а  в  серологической  диагностике - для  выявления  резус-

фактора. 

Лекарственные  формы  на  основе  ферментов  характеризуются  большим 

разнообразием - это таблетки, капсулы, мази, аэрозоли. 

В  нашей  стране  и  за  рубежом  первое  место  по  объему  выпускаемых 

ферментных  препаратов  занимают  протеолитические  -  наиболее  глубоко 

изученные  среди  всех  известных  ферментов.  Протеазы  в  числе  первых 

белков  были  получены  в  высокоочищенном  кристаллическом  состоянии. 

Расшифрована  первичная  структура  таких  ферментов  как  химотрипсин, 

трипсин,

 

папаин, субтилизин. К настоящему времени известно четыре класса 

протеаз:  сериноные, карбоксильные, цистеиновые  и металлопротеазы. Клас-

сификация  основана  на  специфическом  строении  активных  центров  этих 

ферментов, 

которые 

представляют 

собой 

уникальное 

сочетание 

определенных  аминокислотных  остатков,  расположенных  в  различных 

точках  полипептидной  цепи.  Для  идентификации  определенных 

реакционных групп

 

используют

 

специфические ингибиторы. 

Класс 

сериновые 

или 

щелочные 

протеазы 

объединяет 

группу

 

протеолитических  ферментов    содержащих  в  активном  центре  триаду: 

аспарагин-серин-гистидин.  Специфическими  ингибиторами  этих  ферментов, 

чья максимальная активность проявляется в диапазоне рН 7.5 – 12.5 являются 

фенилметилсульфонилфторид и диизопропилфторфосфат.  

К щелочным протеазам относятся ферменты из животного сырья: трипсин и 

 

272

химотрипсин,

 

которые  широко  используются  в  медицинской    практике  как 

для  местного,  так  и  для  парентерального  применения.  Кроме  того,  их 

применяют в виде аэрозолей при воспалительных заболеваниях дыхательных 

путей (трахеиты, пневмония), а также в виде внутримышечных инъекций при 

остеомиелитах,  тромбофлебитах  и  различных  формах  пародонтоза.  По 

отношению к здоровым

 

тканям эти препараты неактивны и безопасны в связи 

с  наличием  в  них  ингибиторов  трипсина.  Из  различных  штаммов 

микроорганизмов  Васillus subtilis выделены  и  детально  изучены  внеклеточ-

ные  щелочные  протеиназы.  Субтилизины - одни  из  немногих  белков,  для 

которых  определена  трехмерная  структура  и  построена  модель  молекулы. 

Благодаря  широкой  специфичности  действия  эти  ферменты  гидролизуют

 

до 

80  связей  в  белках.  Они  обладают  эстеразной  и  амидазной  активностями; 

стабильны  в  широком

 

диапазоне  рН

 

5-10;  однако,  оптимум 

 

действия 

проявляют  при  рН 9-10. По  механизму  действия  и  субстратной 

специфичности  субтилизины  близки  к  трипсину  и  химотрипсину,

 

несмотря 

на  отсутствие  какого-то  бы  ни  было  сходства  в  структуре  между  ними.  В 

биотехнологической промышленности щелочные протеазы из бактериальных 

культур используются для гидролиза белков с последующем использованием 

гидролизатов  в  качестве  компонентов  питательных  сред,  поставляемых  в 

клинико-бактериологические лаборатории.        

Основными  представителями  

класса 

карбоксильных 

или 

кислых 

протеаз  являются  пепсин,  химозин  и  протеазы  из  грибов.  Первичная 

структура пепсина расшифрована и включает 300 аминокислотных остатков. 

Пепсин  продуцируется  клетками  слизистой  оболочки  желудка  в  виде 

зимогена.  Зимоген - неактивная форма фермента, которая активируется под 

действием  другого

 

фермента-активатора,  отщепляюшего  в  молекуле 

зимогена  аминокислоту с N-конца. В  активном центре зимогена содержатся 

две  карбоксильные  группы

 

аспарагиновой  кислоты.  Специфическим 

ингибитором  протеаз  данного  класса  является  природный  пепстатин.  Для  

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  32  33  34  35   ..