Курс лекций по биотехнологии - часть 31

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  29  30  31  32   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 31

 

 

 

241

недостаточно и конечный продукт (аминокислота) всё равно присутствует в 

избытке,  включается  второй  механизм  регуляции,  и  в  результате, 

подавляется  (репрессируется)  образование  всего  комплекса  ферментов 

соответствующей  биосинтетической  цепи.  На  примере  биосинтеза 

аминокислоты треонина  

 

можно показать, как реализуется эти принципы в клетках кишечной палочки. 

Треонин,  а  также  лизин  и  метионин  относятся  к  семейству  аспарагиновой 

кислоты.  То  есть  в  клетках  бактерий  сначала  синтезируется  аспарагиновая 

кислота,  

 

а затем на ее основе синтезируются треонин, метионин и лизин (поэтому они 

и  объеденены  в  семейство  аспарагиновой  кислоты).  Синтез  каждой  из  этих 

аминокислот  осуществляется  в  несколько  этапов  с  образованием 

промежуточных соединений. Каждый из этих этапов катализируется белком-

ферментом, синтез которого контролируется (кодируется) соответствующим 

геном,  в  нуклеотидной  последовательности  которого  записана  структура 

этого белка.  

Первая  реакция  синтеза  этих  аминокислот - превращение  аспарагиновой 
кислоты  под  влиянием  фермента  аспартокиназы  (киназы - это  ферменты  
"навешивающие"  фосфорную  группу)  в  аспартил-фосфат.  У  кишечной 
палочки  существуют  два  гена,  которые  кодируют  соответствующие 
комплексные  ферменты.  Условно  их  можно  подразделить  на  треонин  А-1, 
который несет домен аспартокиназы и треонин А-2, несущий  домен фосфата 
гомосерин-дегидрогиназы.   
Следующий  этап - превращение  аспартил-фосфата  в  полуальдегид 
аспарагиновой  кислоты  (промежуточное  соединение).  Эту  реакцию 
катализирует фермент дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты. 
Ген, контролирующий синтез этого фермента локализуется в другом участке 

 

242

хромосомы  и  называется  АSD.  Под  влиянием  фермента  гомосерин-
дегидрогеназы,  кодируемого  геном  треонин  А-2,  синтезируется  гомосерин, 
который  является  предшественником  для  синтеза  треонина  и  метионина.  В 
свою  очередь,  гомосерин  под  влиянием  фермента  гомосерин-киназы 
превращается в гомосерин-фосфат (ген, кодирующий эту реакцию - треонин 
В).  И,  наконец,  гомосерин-фосфат  под  воздействием  фермента  треонин-
синтетазы  превращается  в  треонин.  Ген,  кодирующий  образование  (синтез) 
этого фермента - треонин С. При добавлении в среду пирувата, из треонина 
образуется изолейцин (рис.15).   
Все  эти  гены  (структурные  гены)  в  хромосоме  кишечной  палочки 
расположены    в  определенной  последовательности  в  общей  регуляторной 
области, которая включает: промотор (участок связывания РНК-полимеразы, 
которая 

считывает 

информацию, 

в 

результате 

чего 

образуется 

информационная  РНК,  которая  затем  присоединяется  к  рибосомам  и 
транслируется - при  этом  образуется  каждый  из  указанных  белков-
ферментов) и, так называемый, аттенуатор - регуляторный элемент, который 
воспринимает сигналы обратной связи.  
Необходимо  подчеркнуть,  что  синтез  треонина  происходит  одновременно  с 
ростом биомассы и после остановки её роста, синтез треонина замедляется и 
постепенно затухает. 
Регулируется  биосинтез  треонина  в  клетках  кишечной  палочки  следующим 
образом:  когда  треонин  в  клетках  бактерий  накапливается  в  количестве 
большем,  чем  его  нужно  для  метаболичеких  процессов  и  синтеза  белка,  и 
появляется  в  свободном  состоянии - он  подавляет  активность  фермента 
аспартокиназы.  

 

243

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 
 

 

 
 
 
 
 
 

 

Рис. 15.               Схема биосинтеза треонина у бактерий Esheriсhia Coli 
 

   Аспарагиновая
         кислота
 

Аспартил-фосфат

Полуальдегид 
аспарагиновой
     кислоты 

Гомосерин 

Гомосерин 
-фосфат
 

Треонин

Изолейцин

Метионин 

Аспартокиназа 

Лизин 

Дегидрогеназа  
полуальдегида 
аспарагиновой 
      кислоты
 

  Гомосерин 
дегидрогеназа
 

  Гомосерин
     киназа
 

Треонин 
синтетаза
 

  Треонин 
дезаминаза
 

Пируват

      Ген 
Треонин А1

  Ген 
  ASD
 

  Ген 
Треонин А2

     Ген 
Треонин С

Ген 
Треонин В

 

244

Фермент  аспартокиназа - это  аллостерический  фермент  (аллос - другой), 

который  кроме  активного  центра,  имеет  еще  один,  так  называемый, 

аллостерический 

центр, 

который 

может 

взаимодействовать 

с 

низкомолекулярными  эффекторами.  И  таким  эффектором  в  данном  случае 

является  треонин.  При  присоединении  к  аллостерическому  центру  треонин 

изменяет  конформацию  аспартокиназы,  в  результате  чего  активный  центр 

становится недоступным для субстрата и фермент утрачивает активность. В 

свою  очередь,  подавление  активности  аспартокиназы  ведет  к  прекращению 

синтеза  аспартил-фосфата  и,  соответственно,  прекращается  синтез  всех 

промежуточных соединений пути биосинтеза треонина.  

Когда  одного  механизма  оказывается  недостаточно  и  треонин  продолжает 

накапливаться  в  избытке,  у  кишечной  палочки  включается  еще  один 

механизм  регуляции  биосинтеза – репрессия.  При  этом,  если  треонин 

накапливается  в  избытке,  он  превращается  в  изолейцин,  который,  в  свою 

очередь,  также  накапливается  в  избытке.  В  тот  момент,  когда  треонин  и 

изолейцин  накапливаются  в  избытке  одновременно,  они  опосредованно 

взаимодействуют  с  аттенуатором  и  подавляют  транскрипцию,  вызывая  её 

терминацию.  В  этом  случае  синтез  всех  белков-ферментов  данного 

синтетического пути прекращается.  

Как  уже  говорилось  выше,  у  природных  микроорганизмов  контроль  за 

скоростью  биосинтеза  исключает  аминокислот  их  перепроизводство, 

поэтому выделение аминокислот из клетки в среду возможно лишь у культур 

с  нарушенной  системой  регуляции.  Советскими  учеными  в  конце 20-го 

столетия  был создан штамм-суперпродуцент треонина. Использование его  в 

промышленных масштабах позволило увеличить синтез треонина до 100 г/л, 

а время ферментации сократилось до одних суток. При этом клеточная масса 

составляет  всего 10% от  всего  количества  синтезированных  клеткой 

конечных продуктов или иными словами - 10 грамм клеток синтезируют 100 

 

245

грамм  треонина  (можно  себе  представить,  насколько  эффективен  данный 

процесс). 

В промышленном производстве лизина  

 

в  настоящее  время  используется  штамм-суперпродуцент  коринебактерий 

(Corynеbacterium glitamicum). Коринебактерии 

являются 

грамположительными,  более  древними  в  эволюционном  отношении 

микроорганизмами,  и  отличаются  от  грамотрицательной  кишечной  палочки 

также  тем,  что  у  них  очень  низкая  активность  внутриклеточных  протеиназ 

(ферментов  деградирующих  белки),  поэтому    синтезированные  клеткой 

белки-ферменты долго остаются в активном состоянии.  

Схема биосинтеза лизина представлена на рис. 16. У штамма Corynеbacterium 

glitamicum  существует  только  один  механизм  регуляции  биосинтеза  по 

принципу обратной связи - совместное (согласованное) ретроингибирование 

активности аспартокиназы. Это единственный фермент, активность которого 

регулируется  совместно  треонином  и  лизином.  Когда  треонин  и  лизин 

одновременно 

избыточно 

накапливаются 

в 

клетке, 

они 

вместе 

присоединяются  к  аллостерическому  центру;  в  результате,  активность 

аспартокиназы подавляется и этот биосинтетический путь блокируется. 

Итак, синтез лизина контролируется треонином и лизином и для того, чтобы 

получить  штамм-суперпродуцент  лизина,  нужно  «убрать»  треонин,  так  как, 

когда  треонин  и  лизин  находятся  в  избытке - они  подавляют  активность 

аспартокиназы.  Поэтому  нужно  блокировать  синтез  треонина.  Для  этого 

необходимо  получить  мутацию,  блокирующую  этот  ген,  но  в  этом  случае  в 

питательную  среду  необходимо  добавлять  чистый  треонин  (так  как 

большинство продуцентов лизина неспособны синтезировать гомосерин или 

треонин – они являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам).  

 

246

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

 

Рис. 16.              Схема биосинтеза лизина у коринебактерий 

 

   Аспарагиновая
         кислота
 

Аспартил-фосфат

Полуальдегид 
аспарагиновой
      кислоты
 

Гомосерин 

Треонин

Изолейцин

Метионин 

Аспартокиназа

Лизин 

  Гомосерин 
дегидрогеназа
 

  Гомосерин
     киназа
 

  Треонин 
дезаминаза
 

Пируват

Дигидродипико-
линат синтетаза

 

247

Если  блокировать  в  другом  месте  цепи  биосинтеза,  то  мутант  будет 

нуждаться в метионине и треонине, тогда в среду добавляют гомосерин. Если 

добавить в среду треонин и метионин в ограниченном количестве, то штамм 

будет расти до тех пор, пока они не будут израсходованы, но в клетках этого 

штамма  будут  присутствовать  также  ферменты  необходимые  для  синтеза 

лизина,  которые,  как  говорилось  выше,  длительно  сохраняются  в  клетках 

коринебактерий  в  активном  состоянии.  И  штамм  начнет  синтезировать 

лизин,  то  есть  синтез  лизина  штаммом Corynеbacterium glutamicum 

осуществляется  только  на  стадии,  когда  треонин  исчерпан.  Далее, 

экспериментальным  путем  подбирают  такое  количество  треонина  и 

метионина,  которое  при  внесении  в  питательную  среду  обеспечило  бы 

максимальный  синтез  лизина. Как  только  треонин  исчезает  из  среды  и  рост 

биомассы прекращается, начинается активный синтез лизина. Таким образом, 

данный процесс имеет две стадии развития. 

1.  рост биомассы 

2.  синтез лизина 

Продолжительность  ферментации 2-3 суток.  Уровень  накопления  целевого 

продукта составляет 50-100 г/л. 

Биотехнологи  при  разработке  микробиологической  технологии  получения 

аминокислот  в  процессе  культивирования  продуцентов  подбирают  такие 

условия, при которых скорость синтеза аминокислоты клетками продуцента 

являлась  бы  максимально  высокой  и  сохранялась  бы  максимально  долго,  а 

также  образование  побочных  продуктов  биосинтеза  сводилось  бы  к 

минимуму. Максимально высокая скорость синтеза достигается при создании 

оптимальных  условий  для  выращивания  высокоактивной  биомассы.  Для 

этого  в  ферментере  поддерживаются  определенные  (оптимальные) 

концентрации источников углерода, аммонийного азота, минеральных солей, 

pocтовых  факторов,  рН  и  температура.  Все  процессы  с  высоким  уровнем 

накопления аминокислоты (порядка 50-100 г/л) ведутся при дробной подаче 

 

248

субстратов - источников  углерода  и  азота.  В  качестве  источников  углерода 

при  биосинтезе  аминокислот  используют  углеводы  или  органические 

кислоты (например, ацетат), а в качестве источника азота необходимого для 

построения аминогруппы - аммонийные соли и аммиак. Несмотря на то, что 

аминокислоты  в  целом  нейтральны,  в  процессе  их  биосинтеза  происходит 

сильное  закисление  среды  вследствие  нарушения  ионного  баланса 

культуральной  жидкости.  Дело  в  том,  что  микроорганизмы-продуценты 

преобразуют ионы аммония  NH

4

+

 , присутствующие в питательных средах в 

форме  аммонийных coлей {NH

4

Cl,(NH

4

)

2

SO

4

  и  др.},  в  аминные  группы 

аминокислоты.  При  этом  в  среде  остаются  несбаласироваными  «лишние» 

радикалы Cl

-

, SO

4

2-

.

   

    Для  того,  чтобы  поддерживать  в  среде  оптимальную 

концентрацию  ионов  аммония  и  оптимальный  рН,  биосинтез  аминокислот 

ведут при автоматическом рН-статировании аммиаком. 

Оптимальную  концентрацию  источников  углерода  в  среде  можно 

поддерживать,  подавая  в  ферментер  раствор  углеводов  с  той  скоростью, 

которая  отражает  темп  потребления  сахаров  культурой  продуцента.  При 

промышленном  производстве  аминокислот  широко  применяют  также 

автоматический режим подачи углеводов по сигналу от датчика рН. При этом 

рН-статирование  ведут  не  аммиаком  или  аммиачной  водой,  а  смесью 

аммиачной воды и  углеводов. При правильном выборе соотношения между 

ними,   на постоянном уровне поддерживается не только концентрация ионов 

аммония, но и концентрация источников углерода.  

Для  ауксотрофов  типа  продуцента  лизина  чрезвычайно  важным 

параметром  является  начальная  дозировка  в  среде  источников  ростовых 

факторов (то есть, тех аминокислот, которые штамм не может синтезировать 

самостоятельно).  Их  избыток  приводит  к  угнетению  биосинтеза;  при  их 

дефиците - концентрация  клеток  продуцента  в  ферментере  будет 

недостаточна для обеспечения высокой скорости накопления аминокислоты. 

Поэтому  у  продуцентов,  аналогичных  продуценту  лизина,  существует 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  29  30  31  32   ..