Курс лекций по биотехнологии - часть 27

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  25  26  27  28   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 27

 

 

 

209

стигмастерин,  который  в  значительных  количествах  присутствует  в  соевом 

масле  и  сахарном  тростнике.  Весьма  близок  к  нему  по  структуре  β-

ситостерин,  отличаясь  лишь  отсутствием  двойной  связи  в  боковой  цепи  (в 

формуле показано стрелкой).  

 

 

Ситостерины  присутствуют  в  больших  количествах  в  хлопковом  масле,  в 

зародышах  пшеницы,  в  натуральном  каучуке,  в  сахарном  тростнике.  Кроме 

того,  ситостерин  получают  при  переработке  древесины  в  целлюлозно-

бумажном производстве.  

В  условиях  промышленного  производства  из  ситостерина  получают 

андростендион (АД) путем окисления боковой цепи стерина с образованием 

17-кетоандростана  с  помощью  мутантных  штаммов Mycobacterium vacca 

(штаммы, у которых блокированы системы ответственные за полный распад 

стероидного  скелета).  В  этой  комплексной  технологии  помимо  химических 

стадий  используются  методы  микробиологической  трансформации  для 

введения  гидроксильной  группы  в 11-положение  стероидной  структуры  и 

 

210

двойной  связи  в 1,2-положение.  Хотя  для  этих  групп  известны 

альтернативные  химические  варианты,  но  они  уступают  по  эффективности 

биотрансформации  из-за  многостадийности,  более  низкого  выхода  и  по 

экологическим 

показателям. 

О 

высокой 

региоселективности 

микробиологического  отщепления  боковой  цепи  ситостерина  (без 

эатрагивания стероидного скелета) свидетельствует высокий выход (70-80%) 

продукта трансформации.  

Кроме  выхода  целевого  продукта,  важным  показателем  определяющим 

экономичность  процесса  микробиологической  трансформации  стероидного 

субстрата  является  концентрация  стероида  в  культуральной  жидкости.  В 

даннном процессе концентрация ситостерина составляет 10-15 г/л, при этом 

стерин  вносится  в  культуральную  жидкость  в  микронизированном  виде. 

Поскольку  стероиды  трудно  растворимы  в  воде,  то  и  целевой  продукт 

трансформации - АД  на 99% выделяется  в  виде  кристаллов.  Это  свойство 

стероида,  определяет  метод  его  извлечения.  Сначала  методом  фильтрации 

культуральную  жидкость  отделяют  от  биомассы  и  кристаллов  АД.  Затем 

последние  растворяют  в  ацетоне  и  еще  раз  фильтруют  для  отделения  от 

биомассы. Концентрированием ацетонового раствора выделяют АД, который 

на  конечной  стадии  перекристаллизовывают.  Аналитический  контроль 

реакции  трансформации  ведется  путем  отбора  проб  через  определенные 

временные интервалы и анализа их методом тонкослойной хроматографии на 

силуфоле  в  присутствии  «свидетелей» - исходного  стероида,  целевого 

продукта  трансформации  и  некоторых  промежуточных  и  побочных 

продуктов, которые участвуют в данном процессе. При помощи дальнейшей 

химической  модификации  АД  получают  такие  препараты,  как  тестостерон, 

метилтестостерон, оксипрогестерона капронат, спиронолактон и др.  

Биотрансформация  стероидов - аэробный  процесс  глубинной  ферментации, 

для  проведения  которой  используется  оборудование,  отвечающее  высокой 

степени  массообмена.  Трансформация  может  осуществляться  как  растущей 

 

211

на  среде  культурой,  так  и  отмытыми  от  питательной  среды  клетками 

микроорганизма. Последний вариант предпочтительнее, поскольку облегчает 

выделение и очистку целевого продукта. Но, как показала производственная 

практика,  не  все  микроорганизмы  переносят  промышленное  сепарирование 

без  потери  активности;  так  представители  мукоровых  грибов  очень 

чувствительны  к  сепарированию,  тогда  как  представители  несовершенных 

грибов теряют свою активность незначительно. 

Способность  трансформировать  стероиды  обнаружена  в  самых  разных 

группах  микроорганизмов.  Используются,  как  правило,  естественные 

штаммы,  выделенные  из  почвы  или  из  других  объектов.  Условно  можно 

сказать,  что  процессы  гидроксилирования  наиболее  распространены  среди 

грибов.  Так  процесс 11 α-гидроксилирования  способны  осуществлять 

представители 300 видов  микроорганизмов,  причем 50 % из  них  приходтся 

на несовершенные грибы и 20 % на фикомицеты. Для бактериальных культур 

больше  присущи  процессы  окисления  гидроксильных  групп  до  кетонов, 

восстановление  кетонов  до  оксигрупп,  введение  в  кольцо  стероидной 

молекулы двойных связей. 

Наиболее  известные 11 α-гидроксилирующие  культуры  относятся  к  родам 

Absidia, Beanveria, Curvularia, Cunninghamella. Для  дегидрирования  в 

положении 1,2 монопольное  положение  занимает Corynebacterium simplex. 

Для процесса изомеризации с одновременным окислением 3-оксигруппы в 3-

кетогруппу, широко используются штаммы Corynebacterium mediolanum (sin. 

Flavobacterium dehydrogenans). Следует  отметить  важность  этой  реакции, 

поскольку источники сырья (диосгенин, соласодин) содержат 3β-оксигруппу, 

в то время как активные стероидные препараты должны иметь 3-кетогруппу. 

Специфической  особенностью  процесса  биотрансформаций  является 

использование  чистых  культур  микроорганизмов.  Поэтому  все  операции  по 

подготовке  и  выращиванию  трансформирующих  культур  проводят  в 

стерильных  условиях.  Используют  культуру-трансформатор  в  стадии 

 

212

замедления  роста,  когда  питательные  компоненты  среды  в  значительной 

степени  израсходованы,  а  сильно  разросшаяся  культура  подавляет  рост 

посторонней  микрофлоры.  Что  касается  микробиологического  контроля,  то 

он  осуществляется  только  на  стадии  выращивания  трансформирующей 

культуры. 

Стероиды - малорастворимые  в  воде  соединения:  их  растворимость 

колеблется  от 0,3 г/л  (гидрокортизон)  до 0,01 г/л  (ацетонид 

фторкортексолона).  В  тоже  время  важным  аспектом  эффективности 

процессов  трансформации  является  выбор  оптимальной  концентрации 

субстрата,  что,  в  свою  очередь,  зависит  от  биологической  доступности 

последнего.  Поэтому  трансформационные  процессы  осуществляют  обычно 

при  концентрации  субстрата  в  пределах 1-10 г/л,  что  предполагает 

нахождение  основной  массы  стероида  в  твердой  фазе.  В  этом  случае 

необходимым  условием  является  высокая  степень  предварительного 

измельчения стероидного субстрата (поступает в среду в микронизированном 

виде),  которая  достигается  путем  использования  ультразвуковых  или 

механических измельчителей.  

В  случае,  когда  растворимость  стероидного  субстрата  слишком  мала  для 

проявления  присущей  микроорганизму  ферментативной  активности, 

используются методы, повышающие водорастворимость стероидов. 

1.  Подача  стероида  в  растворителях,  смешивающихся  с  водой  (ацетон, 

метанол, 

этанол, 

диметилформамид, 

диметилсульфоксид 

и 

др.). 

Ограничением  для  этого  метода  является  токсичность  определенных 

концентраций растворителей. 

2.  Использование  водорастворимых  форм  стероидов  в  виде  натриевых 

солей 2,1-гемисукцинатов  или  фосфатов.  Осложняющим  моментом  для 

широкого  использования  таких  модификаций  является  высокая  степень 

избирательности  по  отношению  к  ним  со  стороны  микроорганизмов, 

например, для дегидрирующего микроорганизма Corynebacterium simplex эти 

 

213

формы стероидов оказались недоступны. 

    3.  Заключение  стероидов  в  растворимый  комплекс  с  циклодекстрином. 

Использование  комплекса  стероидов  с  циклодекстрином  не  имеет 

ограничений предыдущих методов. 

Микробиологическое 

гидроксилирование 

является 

наиболее 

часто 

применяемым  методом  получения  стероидных  препаратов,  так  как 

присутствие  гидроксильных  групп  в 3,11,16,17 положениях  молекулы 

стероида,  как  правило,  обусловливает  физиологическую  активность  для 

большинства гормональных стероидных препаратов.  

Широко  используемым  в  промышленности  является  микробиологический 

синтез одного из основных кортикостероидов - гидрокортизона (кортизола) и 

его  синтетических  аналогов  преднизолона  и  дексаметазона.  В  этом  случае 

исходным продуктом для 11β-гидроксилирования может служить вещество S 

Рейхштейна  (кортексолон),  которое  для  краткости  принято  называть 

«вещество S». 

 

214

 

Само  по  себе  «вещество S» является  модифицированным  продуктом 

биотрансформации  моноацетата  «вещества R» с  помощью  культуры 

Corynebacterium mediolanum. Процесс  ферментативного  превращения 

моноацетата  «вещества R» в  «вещество S» с  помощью  вышеуказанной 

культуры  состоит  из  гидролиза 21-ацетогруппы  и  окисления  3β-

гидроксигруппы в 3-кетогруппу с одновременной миграцией двойной связи. 

 

 

215

 

Надо отметить, что данная трансформация имеет принципиальное значение в 

производстве  кортикостероидов,  так  как  практически  определяет 

количественный  выход  «вещества S», что  в  свою  очередь,  в  значительной 

степени влияет на конечный выход продуктов следующих трансформаций.  

Так  применение  в  качестве  субстрата  не  вещества «S», а  моноацетата 

«вещества R», позволило увеличить выход гидрокортизона с 50% до 70-73%. 

Вместе  с  тем  было  установлено,  что  использование  в  производстве 

гидрокортизона промышленного штамма грибной культуры Curvalaria lunata 

имеет  преимущество  по  выходу  целевого  продукта  и  по  наименьшему 

количеству  примесей  перед  другими  микроорганизмами,  например, Absidia 

ovchidis.  Необходимо  также  отметить,  что  гидроксилирование  в 11β 

положении сопряжено с образованием 11α, 14α и 6β - гидроксипроизводных 

в качестве нежелательных, побочных продуктов данной реакции.  

 

216

Широкую  субстратную  специфичность  гидролаз  демонстрируют  многие 

микроорганизмы.  Например,  штамм Cunninghamella blakesleeana вводит 

оксигруппу  в 11β-положение  большого  набора  стероидов - различных 

производных эстрана, тестостерона, кортексолона, прогестерона и т.д.  

Главным  препятствием,  стоящим  на  пути  развития  промышленного 

микробиологического  гидроксилирования  стероидов  является  низкая 

производительность  ферментаций,  несмотря  на  высокий  процентный  выход 

по  субстрату.  Причиной  этого  является,  с  одной  стороны,  практическая 

нерастворимость  стероидных  субстратов  в  воде,  а  с  другой - токсичность 

применяемых растворителей и, следовательно, невозможность использования 

достаточно высоких концентраций субстрата. 

Микробиологическое  дегидрирование  стероидов  также  имеет  большое 

значение,  поскольку  введение 1,2 двойной  связи  способствует  повышению 

физиологической активности. Например, преднизолон  

 

являясь 1,2 дегидроаналогом  гидрокортизона,  превосходит  последний  по 

противовоспалительной и антиаллергической активности, проявляя при этом 

значительно  меньше  побочных  эффектов.  В  реакции 1,2 дегидрирования 

принимает 

участие 

внутриклеточный 

фермент 3-оксистероид-1,2 

дегидрогеназа,  локализованный  на  внешней  стороне  цитоплазматической 

мембраны.  В  процессе  реакции  электроны  с  фермента  переносятся  на 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  25  26  27  28   ..