Курс лекций по биотехнологии - часть 24

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  22  23  24  25   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 24

 

 

 

185

перестающей  связывать  антибиотик.  Мутировавшие  хромосомные  гены 

могут быть, согласно принятому термину, «мобилизованы», то есть оказаться 

в    плазмидах  и  быть  переданы  в  другие  клетки  за  счет  механизмов 

распространения  плазмид.  Однако,  переноса  резистентности  при  этом,  в 

большинстве случаев не происходит. В новой клетке-хозяине будут работать 

(экспрессироватъся)  как    свои  хромосомные    так  и    чужие  (плазмидные) 

структурные  гены  и,  в  результате,  часть  мишеней  для  антибиотика  будет 

«чувствительной»  к  нему,  то  есть  будет  его  связывать,  а  часть – 

резистентной.  В  таких  случаях  антибиотикочувствительность  доминирует 

над  антибиотикорезистентностью.  Именно  поэтому    при  выявлении 

резистентности  за  счет  изменения  конформации  мишеней,  гены 

резистентности  оказываются  локализованными  в  хромосомах.  Исключения 

здесь  связаны  с  теми  случаями,  когда  изменения  конформации  мишени 

происходят  не  вследствие  мутации  в  ее  структурном  гене,  а  в

 

результате 

ферментативной модификации yжe синтезированной мишени. Ген фермента 

модифицирующего  мишень  может  иметь  не  только  хромосомную,  но  и 

плазмидную  локализацию.  Особенно  часто  плазмидная  локализация  генов 

резистентности 

встречается 

при 

ферментативной 

инактивации 

антибиотитиков.  Иногда  в  одной  плазмиде  оказываются

 

локализованными 

несколько  генов,  кодирующих  ферменты,  воздействующие  на  антибиотики 

разных 

групп. 

Отсюда 

возникло 

понятие 

полирезистентности 

микроорганизмов.  Полирезистентные  штаммы  возбудителей  инфекций 

представляют серьезную проблему в инфекционной клинике. 

Мишени,  на  которые  направлены  антибиотики,  располагаются  или  в 

цитоплазматической  мембране  (ферменты  биосинтеза  пептидогликана),  или 

в  самой  цитоплазме  (рибосомы,  ферменты  биосинтезa  белка,  ферменты 

биосинтеза нуклеиновых кислот и т.д.). Для того,  чтобы достигнуть мишени 

антибиотик  должен  проникнуть  через  внешнюю  мембрану  и  клеточную 

стенку,  а  иногда - через  цитоплазматическую  мембрану  (если  мишени 

 

186

находятся  в  цитоплазме).  Резистентность  к  антибиотикам  нередко 

обусловлена  особыми  изменениями  в  оболочке  бактериальной  клетки.  Под 

оболочкой

 

подразумевается совокупность, состоящая из: 

1) внешней мембраны (только у грамотрицательных бактерий); 

2) клеточной стенки; 

3) цитоплазматической мембраны. 

Клеточная  стенка,  хотя  и  является  жесткой, «решетчатой»  структурой, 

построенной  из  пептидогликана,  не  может  препятствовать  проникновению 

небольших молекул антибиотиков.  

За  последние  десятилетия  неоднократно  отмечалось  возрастание  роли 

грамотрицательной микрофлоры в инфекционной патологии.  Это относится 

к  инфекционным  осложнениям  при  хирургическом  вмешательстве,  к 

урологическим  инфекциям  и  т.д.  Большую  роль  в  инфекционном  процессе 

играют грамотрицательные, не ферментирующие бактерии.  Возрос интерес 

к  присущей  всем  этим  микроорганизмам  внешней  мембране.  Основными 

компонентами  последней  являются:  липополисахариды,  липопротеиды, 

фосфолипиды  и  специфические  белки - порины  (от  слова  пора);  тримеры 

этих белков формируют поры или водные каналы, через которые из внешней 

среды  в  клетку  диффундируют  низкомолекулярные  питательные  вещества  

(аминокислоты,  небольшие  пептиды,  моно-,  ди-,  трисахара,  неорганические 

ионы  и  т.п).  Пориновые  каналы  «осциллируют»,  то  есть    находятся  то  в 

открытом,  то  в  закрытом  состоянии.  В  бедной  среде - канал  в  открытом 

состоянии  находится  дольше,  чем  в  богатой  среде.  Этими  же  пориновыми 

каналами  «пользуются»  и    антибиотики  при  проникновении  в  клетку. 

Антибиотики,  быстро  проникающие  через  водные

 

каналы  поринов, 

относятся  к  препаратам  широкого  спектра  действия - подавляют  рост  и 

грамотрицательных и грамположительных бактерий. Антибиотики, молекула 

которых имеет большие размеры, например, эритромицин, через пориновые 

каналы не  проникают и поэтому, не эффективны против грамотрицательных 

 

187

бактерий,  хотя  высокоактивны  против  грамположительных.  Следует 

отметить,  что на проникновение молекулы влияют не только ее размеры, но 

и  стерические  особенности,  включая  те,  которые  обусловливают  eе  

«гибкость». Учитывается не только диаметр водных каналов, но и свойства 

формирующих  их  белков-поринов.  Существует  катионоселективные  и 

анионоселективные  каналы.  Применительно  к  антибиотикам  это  означает, 

что  в  случае  бактерии,  у  которой  во  внешней  мембране  преобладают 

катионоселективные  каналы,  в  клетку  лучше  будут  проникать  антибиотики 

основной  природы.  Демонстративным  примером  в  данном  случае  является 

бензилпенициллин.  Его  относительно  небольшая  молекула  очень  слабо 

проникает  через  пориновые  каналы  кишечной  палочки,  так  как  у  этого 

организма,  как и у многих других грамотрицательных бактерий, пориновые 

каналы  катионоселективны.  В  тоже  время,  у  относительно  небольшой 

группы  грамотрицательных  кокков  пориновые  каналы  анионоселективны, 

что  способствует  проникновению  в  их  клетку  бензилпенициллина.  Отсюда 

следуют  общеизвестные  врачам  факты:  бензилпенициллин  непригоден  для 

лечения  кишечных  инфекций,  но  высокоактивен  при  лечении  гонорреи. 

Катионоселективность 

и 

анионоселективность 

пориновых 

каналов 

определяется  средой  обитания  вида  бактерии.  Так,  катионоселективность 

пориновых  каналов  у  кишечной  палочки  позволяет  этой  обитающей  в 

кишечнике  бактерии  избежать  неблагоприятного  действия  поступающих  в 

кишечник желчных кислот.  

Не только размеры молекулы антибиотика, стерические особенности и заряд, 

определяют  возможность  и  скорость  ее  проникновения  через  пориновые 

каналы. Учитывая то обстоятельство, что каналы заполнены водой, большое 

значение  имеет  степень  гидрофобности  молекулы,  то  есть  при  высокой 

гидрофобности,  проникновение антибиотика заметно снижается. 

Помимо  пориновых  каналов - главного  пути  проникновения  антибиотиков 

через барьер внешней мембраны в клетку существуют и другие возможности 

 

188

транспорта:  

1) за счет специфической системы первичного метаболита, если молекула 

антибиотика сходна по

 

структуре или является  аналогом  метаболита;  

2)  за  счет  липидных  участков  внешней  мембраны  бактерий,  если  это 

липофильные вещества (в том числе и антибиотики). 

Некоторые антибиотики нуклеозидной природы используют специфические 

системы транспорта нуклеозидов через внешнюю мембрану. Например, был 

получен 

полусинтетический 

цефалоспорин 

с 

катехолоподобной 

группировкой,  который  в  соответствии  с  размерами    своей  молекулы  не 

должен был проникать через пориновые каналы. Однако, благодаря наличию 

вышеуказанной группировки,  он образовывал комплексы с ионами железа и 

проникал  в  грамотрицательную  клетку,  используя  специфическую  систему 

транспорта  железа.  Иными  словами,  данный  цефалоспорин,  имитируя  пе-

реносчик  железа,  преодолевал  барьер  мембраны  тем  же  путем,  что  и 

переносчик.  Вместе  с  тем,  антибактериальная  активность  определенных 

полусинтетических 

липофильных 

пенициллинов 

и 

тетрациклинов 

обусловлена  их  проникновением  через  липидные    участки  внешней 

мембраны.  

Изучение 

механизмов 

антибиотикорезистентности 

штаммов 

грамотрицательных  бактерий,  выделенных  из  клинического  материала 

показало, что нередко резистентность обусловлена уменьшением количества 

пориновых  белков  в  мембране,  и,  соответственно,    количества  пориновых 

каналов.  В результате, происходит замедление проникновения антибиотиков 

в клетку. 

Еще  один  механизм  резистентности  связан  с  изменением  уже  самих 

пориновых белков и сужением диаметра пориновых каналов. 

Следует  отметить,  что  в  обоих  случаях  резистентность  является 

неспецифической и ослабляется, хотя и в разной степени, при проникновении 

в клетку антибиотиков, диффундирующих через пориновые каналы. В то же 

 

189

время  надо  отметить  и  тот  факт,  что  при  указанных  механизмах 

резистентности, полного прекращения проникновения антибиотиков в клетку 

произойти  не  может,  поскольку  пориновые  каналы  жизненно  необходимы 

для  транспорта  в  клетку  питательных  веществ  и  их  полное

 

исчезновение  в 

мембране  привело  бы  к    гибели  клетки.  Показано,  что  уровень 

резистентности  бактерий  за  счет  изменений  в  их  внешнeй  мембране  ниже, 

чем,  например,  при  наличии  защитных,  инактивирующих  антибиотики 

ферментов.  Однако,  среди  штаммов,  выделяемых  в  клинике,  часто 

обнаруживаются  такие,  у  которых  выявляются  сразу  два  механизма 

резистентности:      ослабление  проникновения  антибиотика  через  внешнюю 

мембрану  и  ферментативная  инактивация  антибиотика.  В  этом  случае 

уровень антибиотикорезистентности особенно высок. 

     Одна  из  основных  причин,  вызывающих  потребность  в  создании  и 

внедрении  в  медицинскую  практику  новых  беталактамных  антибиотиков - 

распространение 

среди 

патогенных 

микроорганизмов 

способности 

продуцировать  ферменты,  катализирующие  расщепление    беталактамного 

кольца  у  пенициллинов  и  цефалоспоринов,  внедренных  в  медицинскую 

практику.  Они  получили    название  пенициллиназ  и  цефалоспориназ    в 

соответствии  с  их  субстратной  специфичностью  и  избирательностью 

действия 

на 

пенициллины 

или 

цефалоспорины. 

Ферментативное  

расщепление (гидролиз) беталактамного кольца ведет к полной инактивации 

беталактамного 

антибиотика. 

Это 

было 

показано 

на 

примере 

бензилпенициллинов  еще  в 40-х  годах  Э.Чейном,  впервые  очистившим 

пенициллин.  Продукт  ферментативного  расщепления  бензилпенициллина 

пенициллоиновая кислота 

 

 

190

 -  полностью  не  активна.  Это  легко  объяснимо,  так  как  механизм  действия 

беталактамных антибиотиков связан именно с расщеплением беталактамного 

кольца  и  ацилированием  гидроксильной  группы  серина  в  активном  центре 

ферментов-мишений.  В  случае  же  пенициллиназ  и  цефалоспориназ 

беталактамное

 

кольцо  также  расщепляется  и  антибиотик  быстро 

освобождается из активного

 

центра этих ферментов с присоединением атома 

водорода и гидроксила.  

В  настоящие  время  пенициллиназы  и  цефалоспориназы  составляют 

обширную группу одинаковых по механизму действия, но различающихся по 

субстратной  специфичности  ферментов  и  объединяются  под  общим 

названием  «беталактамазы».  Известно,  что  беталактамазы    произошли  от 

транспептидаз  и D,D-карбоксипептидаз  пептидогликана,  то  есть    из 

ферментов-мишеней  в  бактериальной  клетке    необратимо  инактивируемых 

беталактамами.  

Гены  беталактамаз,  особенно  цефалоспориназ,  локализуются  как  в 

бактериальной хромосоме, так и в плазмидах,которые не находятся под столь 

строгим  регуляторным  контролем  в  клетке  как  хромосомный  генетический 

материал и могут существовать во многих копиях, что  повышает количество 

генов  беталактамаз  и  уровень  самих  ферментов  в  клетке.  Между 

хромосомами и плазмидами  нередко  происходит обмен генами, в частности, 

генами беталактамаз. Очень важно, что гены беталактамаз, локализованные в 

плазмиде, могут передаваться при конъюгации вместе с плазмидой в другую 

клетку.  Это  означает,  что  плазмидные  гены  быстро  распространяются  по 

клеточной популяции, для чего не нужно даже деления клеток. Возможен и 

межвидовой  перенос  плазмидных  генов  беталактамаз,  например,  из  клетки 

кишечной палочки в клетку сальмонеллы и т.п. 

Беталактамазы  могут  быть  как  конституитивными  у  одних  штаммов 

бактерий, так и индуцибельными,  у других штаммов. Иногда в одной клетке 

могут  оказаться  две  разных  беталактамазы,  причем  одна  из  них  образуется 

 

191

постоянно, то есть  конституитивно,  в то время как другая  обнаруживается, 

когда клетка попадает в среду с беталактамным антибиотиком. 

Способность к индукции беталактамаз является отрицательным свойством 

беталактамных антибиотиков с точки зрения медицинской практики, поэтому 

новые  беталактамные  структуры  оцениваются  при  изучении  их  свойств  не 

только на устойчивость к ферментативной инактивации, но и на способность 

индуцировать беталактамазы. Последняя зависит от того, с какой мишенью, 

то  есть  с  каким  из  РВРs  связывается  беталактамный  антибиотик,  так  как 

именно  РВРs  являются  «сенсорами»,  запускающими  сложный  механизм 

индукции  беталактамаз.  Схематически  этот  механизм  выглядит  следующим 

образом:  беталактамный  антибиотик,  находящийся  в  среде,  реагирует  с 

одним из белков принадлежащих к РВРs. Его взаимодействие с белком ведет 

к  изменению  конформации  этого  белка.  Меняются    биофизические 

параметры  белка    и  сигнал  об  этом  передается  на  специальный 

трансмембранный 

белок, 

молекула 

которого 

пересекает  

цитоплазматическую  мембрану  и  выходит  на  ее  внешнюю  поверхность. 

Далее  сигнал  последовательно  передается  на  первый  и  второй 

цитоплазматические  белки,  включенные  в  систему  индукции  ферментов  и, 

наконец,  на  белок-репрессор,  уже  непосредственно  регулирующий 

экспрессию  именно  гена  беталактамазы.  В  результате,  репрессор  перестает 

подавлять экспрессию этого гена. Соответственно, начинается его экспрессия 

и  синтез  молекул    информационной  РНК,  которая  далее  поступает  в 

рибосомную  систему,  где  на  ней  как  на  матрице  синтезируются  молекулы 

беталактамазы.  Система  индукции  беталактамаз  специфична:  на  своем 

начальном  участке  РВРs  являются  первичными  сенсорами,  в  отличие  от  

других  белков  мембраны,  а  на  конечном  участке -  белок  репрессор 

специфичен только для гена беталактамазы.  

Среди  беталактамных  антибиотиков  обнаружены  как  очень  активные 

индукторы  беталактамаз,  так  и  малоактивные,  которые  являются  более 

 

192

предпочтительными для использования в клинике. 

Учитывая  несомненное  сходство  многих  беталактамаз  с  ферментами-

мишенями  для  них,  был  предпринят  поиск  специфических  ингибиторов 

беталактамаз.  Среди  природных  беталактамов  и  продуктов  их  химической 

трансформации    были  отобраны  ингибиторы  беталактамаз,  которые 

воздействуют  и  на  беталактамазы,  и  на  транспептидазы  пептидогликана,  то 

есть  обладают  антибактериальной  активностью.  Практическая  ценность 

ингибиторов  беталактамаз  обусловлена  тем,  что  их  используют  вместе  с 

беталактамными  антибиотиками,  которые  чувствительны  к  беталактамазам. 

Ингибиторы  беталактамаз  защищают  эти  антибиотики  от  ферментативной 

инактивации.  Широкую  известность  получили  такие  ингибиторы  как 

клавулановая кислота,  

 

сульбактам  и  некоторые  другие.  Однако,  необходимо  учитывать  то 

обстоятельство,  что  любой  конкретный  ингибитор  не  может  воздействовать 

на  все  многочисленные  типы  беталактамаз.  Спектр  действия  каждого 

ингибитора  ограничен  лишь  частью  типов  беталактамаз,  распространенных 

среди бактерий. 

За  рубежом  выпускается  смесь  полусинтетического  пенициллина 

(ампициллина) с сульбактамом (2:1) под фирменным названием «уназин», а 

также препарат «сультамициллин», представляющий химическое соединение 

ампициллина  с  сульбактамом.  Получил  практическое  применение  и 

препарат,  являюшийся  смесью  амоксициллина  (полусинтетического 

пенициллина)  с  клавулановой  кислотой - «огментин».  При  подборе 

комбинаций  ингибиторов  беталактамаз  с  беталактамными  антибиотиками 

важно  иметь  в  виду  и  соблюдать  следующее  условие:  фармакокинетика 

ингибитора  и  антибиотика  должна  быть  сходной.  Иными  словами,  их 

распределение  по  органам  и  тканям  организма,  пути  выведения  (например, 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  22  23  24  25   ..