Курс лекций по биотехнологии - часть 22

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  20  21  22  23   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 22

 

 

 

169

на  биосинтез  обязательно  учитывается  при  подборе  сред,  а  также 

осуществляется контроль количества таких соединений.  

С    одной  стороны,  некоторые  первичные  метаболиты  являются  прямыми 

предшественниками  антибиотиков,  например,  валин    включается  в 

трипептид,  из  которого  формируются  беталактамные  структуры.  При 

избытке  валина  и  высокой  концентрации  его  в  мицелии  происходит 

подавление  валином  собственного  биосинтеза  по

 

принципу  обратной  связи. 

Находясь  в  избытке,  он  подавляет  активность  ацетогидроксисинтетазы  

первого  фермента  своего  биосинтетического  пути.  Однако,  в  результате, 

снижается    и  образование  трипептида,  то  есть,  в  конечном  счете,  

соответственно, и беталактамного антибиотика. 

С  другой  стороны,  некоторые  первичные  метаболиты  являются  конечными 

продуктами разветвленного метаболического пути. Одно «ответвление» или 

один  конец  этого  пути  заканчивается  первичным  метаболитом,  другое 

«ответвление» - антибиотиком. Так, альфа-аминоадипиновая кислота с одной 

стороны,  является  прямым  предшественником  лизина,  с  другой  

беталактамного  антибиотика, так как включается в исходный для его синтеза 

трипептид. При избытке лизина происходит подавление образования альфа-

аминоадипиновой  кислоты  по  принципу  обратной  связи    и,  таким  образом, 

снижается  синтез  не  только  лизина,  но  и  беталактамного  антибиотика  (см. 

главу 3, рис.8). 

Эти  примеры  показывают,  что  у  высокоактивных  штаммов  продуцентов 

антибиотиков,  полученных  генетическими  методами,  должны  быть 

нарушены  механизмы  обратной  регуляции  биосинтеза  тех  первичных 

метаболитов,  которые  необходимы  для  образования  антибиотической 

молекулы.  Можно  отметить,  например,  что  лизин  подавляет  биосинтез 

пенициллина у низкоактивных продуцентов. Полученные из них же, то есть  

«изогенные» высокоактивные штаммы, уже не отвечают на избыток лизина в 

среде снижением биосинтеза антибиотика.  

 

170

Важность  аэрации  для  обеспечения  роста  продуцентов  на  стадии 

ферментации  обусловлена  тем, что  большинство из  них - аэробы. Кислород 

необходим    для  биосинтеза  ряда  антибиотиков,  так  как  последний 

расходуется  при  замыкании  беталактамного  и  тиазолидинового  колец  во 

время  биосинтеза  беталактамной  структуры.  Например,  для  образования 

изопенициллина-N из LLD-трипептида молекулярный кислород необходим в 

стехиометрическом  отношении 1:1 (предельная  величина  насыщения 

кислородом  культуральной  жидкости - 30%).   Когда  ферментация  идет 

успешно,  О

2

  потребляется  со  скоростью 1 Ммоль/литр/мин

В  целом, 

потребность  в  О

2

  зависит  от  концентрации  биомассы  и  ее  метаболической 

активности.  Оптимизация  снабжения  кислородом  достигается  увеличением 

скорости его переноса.   

После  завершения  стадии  ферментации  культуральная  жидкость  содержит 

растворенный  антибиотик,  мицелий  продуцента,  продукты  его  лизиса,  ряд  

компонентов неиспользованной питательной среды, в том  числе, высоко- и 

низкомолекулярные  органические  вещества  и  неорганические  соли.  Иногда  

антибиотик  содержится  не  только  в  культуральной  жидкости,  но  и  в 

мицелии.  Культуральная  жидкость  нередко  отличается  высокой  вязкостью. 

Поэтому, выделить антибиотик из столь сложной,  гетерогенной системы - не 

просто.  В  историческом  аспекте  можно  отметить,  что  именно  неудача 

химиков при выделении и очистке пенициллина отдалила на десятилетие его 

внедрение  в  медицинскую  практику.  Используемые  в  настоящее  время 

методы 

и 

последовательность 

операций 

выделения 

и 

очистки 

разрабатываются 

применительно 

к 

конкретному 

антибиотику 

и 

определяются его физико-химическими свойствами:  локализацией, составом 

культуральной жидкости ее реологическими и другими характеристиками. 

На 

стадии 

предварительной 

обработки 

культуральной 

жидкости 

осуществляют отделение растворенного антибиотика от суспензии мицелия и 

компонентов  культуральной  жидкости,  находящихся  в  коллоидном 

 

171

состоянии.  В  том  случае,  если  часть  антибиотика  находится  в  мицелии,  его 

переводят  в  водную  фазу,  например,  изменяя  рН  культуральной  жидкости 

(это используется в случае тетрациклинов). Иногда, наоборот, растворенный 

и  связанный  с  мицелием  антибиотик  объединяют  в  общем    осадке,  из 

которого  антибиотик  затем  экстрагируют.  Отделение  нативного  раствора  от 

мицелия  и  коллоидных  частиц  осуществляют  методами  фильтрации  или 

центрифугирования,  для  чего  используются  барабанные  вакуум-фильтры, 

фильтр-прессы,  сепараторы различных конструкций и т.д.  

На следующей стадии работы ставится задача получения антибиотика в виде 

индивидуального  вещества.  При  этом  необходимо  учитывать  довольно 

высокую  лабильность  многих  антибиотиков,  что  ограничивает  условия  их 

выделения.   

Принцип экстракции органическим  растворителем используется при очистке 

таких  важнейших  антибиотиков  как  пенициллин, эритромицин  и некоторых 

других.  При  переходе  в  органический  растворитель  происходит 

освобождение  соответствующих  антибиотиков  сразу  от  многих  примесей. 

Варьируя  рН  и  меняя,  таким  образом,  растворимость  антибиотика  в  воде 

(точнее  буферном  растворе),  можно

 

многократно  переводить  антибиотик  из 

одной  фазы  в  другую,  освобождаясь,  каждый  раз  от  определенного 

количества  примесей.  Один  из  примеров  окончания  процесса  при 

экстракционном методе выделения и очистки - это извлечение пенициллина 

из  органического  растворителя  бутилацетата,  где  он  находится  в  виде 

свободной кислоты: к бутил-ацетату добавляют насыщенный водный

 

раствор 

ацетата калия. Выпадает калиевая соль пенициллина. Кристаллы промывают 

бутанолом и высушивают. 

Также  при  очистке  антибиотиков  широко  используются  ионообменные 

смолы (катиониты и аниониты).  Особое значение эти сорбционные методы 

сыграли  в  свое  время  в  решении  проблемы  получения  в  высокоочищенном 

 

172

виде  аминогликозидных  антибиотиков - стрептомицина  и  других,  имеющих 

свойства  оснований.  Аминогликозиды  слабо    растворимы  в  органических 

растворителях  и  вследствие  этого  экстракционный  метод,  применительно  к 

ним не может  быть использован. В производстве стрептомицина могут быть, 

например,  успешно  использованы  карбоксильные  катиониты  в  натриевой 

форме.  Десорбция  осуществляется  раствором  серной  кислоты.  После 

дополнительной процедуры, связанной с пропусканием стрептомицина через 

сульфокатионит  (для  удаления  ионов  натрия),  получают  сульфат 

стрептомицина.                                      

Помимо  традиционных  экстракционных  и  сорбционных  методов,  при 

выделении  и  очистке  антибиотиков  все  большее  значение  приобретает 

комплекс приемов, объединяемых под названием мембранной технологии.  

При  обезвоживании  препаратов  антибиотиков  в  зависимости  от  свойств 

антибиотика  используют  или  лиофильную  или  распылительную  сушку.  В 

последнем случае, раствор антибиотика распыляется с помощью форсунок до 

частиц размером 5-25 мкм в диаметре  в токе нагретого воздуха (до 160 С). 

Сушка  происходит  в  течение  долей  секунды.  Затем  препарат  фасуется  в 

стерильные флаконы, с соблюдением условий, гарантирующих стерильность. 

Так  как  биосинтез  антибиотиков  ведется  в  асептических  условиях,  то  при 

выделении,  очистке  и  получении  лекарственных  форм  также  соблюдаются 

максимально  возможные  предосторожности  против  контаминации.  Тем  не 

менее,  проблема  стерильности  инъекционных  препаратов  и  обсемененности 

препаратов  для  наружного  применения  остается  одной  из  самых  сложных 

для  производства  как  антибиотиков,  так  и  лекарственных  средств  в  целом. 

Поэтому, при обнаружении расфасованных, нестерильных серий препаратов 

иногда 

применяют 

метод 

радиационной 

стерилизации, 

учитывая 

нестандартность сложившейся ситуации. Определенные виды ионизирующей 

радиации 

допустимы 

для 

стерилизации 

лекарственных 

средств. 

Соответствующие  указания  имеются  в  официальных  фармакопейных 

 

173

документах. Хорошо известно, что ионизирующей радиацией стерилизуются 

хирургические  инструменты,  резиновые  перчатки,  шприцы  одноразового 

пользования  и  т.п.  Следует  подчеркнуть,  что  при  такой  стерилизации  (в 

минимальных  дозах),  загрязняющие  препарат  микроорганизмы,  теряют 

способность  к  размножению  и  гибнут  вследствие  повреждения  ДНК 

(происходят сшивки между нуклеотидами, а также разрывы ДНК). В отличие 

от  радиационной,  при  термической  стерилизации    происходит  денатурация 

многих  белков  клетки,  в  результате  чего    ее  повреждения  становятся  более 

многочисленными;  при  стерилизации  путем  мембранной  фильтрации

 

микробные клетки не убиваются, а удаляются из лекарственного препарата.   

Как  уже  говорилось  выше,  радиационная  или  лучевая  (жаргонный  термин) 

стерилизация используется  на отдельных производствах ввиду объективных 

трудностей  при    внедрении    технологии  получения  нового  препарата,  а 

иногда - по экономическим причинам. Установлено, что стерилизующая доза 

ионизирующего  облучения - 2,5 миллиона  рад,  то  есть 2,5 мегарад (2,5 

Мрад); 1 рад или 1 rad (radiation absorbed dose) соответствует 100 эрг/г. 

Специалист  с  высшим  фармацевтическим  образованием  должен  занимать  

четкую  и  грамотную  позицию  в  отношении  бытующей  радиофобии, 

конкретно  выражающейся  в  том,  что  радиационная  стерилизация  может, 

якобы,  привести  к  наведенной  радиоактивности  облученных  препаратов. 

Разрешенные  для  стерилизации  лекарств - гамма  лучи  изотопа  кобальта 

(Со

60

)  и  быстрые  электроны  с  энергией  не  выше  пяти  миллионов 

электроновольт,  получаемые  на  ускорителях,  наведенной  радиации,  у 

обработанных  ими  препаратов,  вызвать  не  могут,  независимо  от 

поглощенной  дозы  облучения,  так  как  неспособны  вызвать  расщепление 

атомного ядра. 

Гамма-лучи  (Со

60

)  распространяются    в  воздухе  на  несколько  десятков 

метров, в воде - на несколько десятков сантиметров, в свинце - на несколько 

сантиметров.  На  промышленной  установке  защитный  слой  воды, 

 

174

окружающий  герметическую  стерилизационную  камеру,  где  находятся 

стандартные  стержни  с  (Со

60

),  длиной  до  одного  метра  и  упаковки  со 

стерилизуемым  лекарственным  препаратом,  должны  составлять  несколько 

метров. 

Стерилизационная 

камера 

снабжена 

автоматизированным 

дистанционным управлением, позволяющим вдвигать в нее и удалять из нее 

стержни  с  кобальтом,  разъединяя,  таким  образом,  источник  облучения  и 

упаковки  со  стерилизуемым  препаратом.  Режим  стерилизации  обычно 

подбирается  с  таким  расчетом,  чтобы  стерилизующая  доза (2,5 Мрад) 

набиралась  облучаемым  препаратом  примерно  за  сутки.  При  этом  следует 

иметь  ввиду,  что  период  полураспада  (Со

60

)  составляет  около  пяти  лет. 

Естественно,  что  работа  на  установках  с  радиоактивным  кобальтом  

постоянно требует особых мер предосторожности. 

Установка,  где  для  стерилизации  используются  быстрые  электроны  во 

многом  принципиально  отличается  от  указанной  выше.  Проникающая 

способность    электронов,  разогнанных  до  разрешаемого  для  стерилизации 

лекарств  показателя,  невелика.  Электроны  не  могут  «пронизать»  несколько 

рядов флаконов или ампул. Однако, чтобы набрать стерилизующую дозу (2,5 

Мрад), требуются секунды или доли секунд. Поэтому флаконы подаются по 

одному с помощью транспортера к соответствующему «окошку» и набирают 

стерилизующую  дозу.  После  выключения,  стерилизационная  установка 

такого  рода  становится  абсолютно  безопасной  в  отношении  радиации. 

Значительный  опыт  по  использованию  радиационной  стерилизации 

биотехнологических  препаратов  накоплен  на  примере  антибиотиков.  

Стерилизации  подвергались  расфасованные  по  флаконам  лиофильно 

высушенные  субстанции,  соли  антибиотиков  и  их  препараты  с  различного 

рода  наполнителями.  В  ряде  случаев  препараты  искусственно  заражались 

различными  видами  микроорганизмов  и  их  спорами.  Стерилизующая  доза 

(2,5  Мрад)  обусловливала  гарантированную  стерильность.  При  этом 

облученные 

препараты 

сохраняли 

активность 

и 

удовлетворяли 

 

175

фармакопейным  тестам.  Это  характерно  для  большинства    антибиотиков 

(природные 

и 

полусинтетические 

пенициллины, 

аминогликозиды, 

тетрациклины  и  ряд  других).  Исключение  составляли  полиены,  то  есть 

структуры  с  сопряженными  двойными  связями - например,  нистатин, 

который    при  облучении  заметно  терял  активность.  При  сравнении  их  с 

необлученными  препаратами  можно  было  выявить    некоторые  отличия: 

белые  (бесцветные)  порошки  теряли  «блестящий»  оттенок  и  приобретали 

матовый,  а  порошки  красного  цвета  (актинолицины)  и  желтого 

(тетрациклины) приобретали несколько более тусклый оттенок.  Дело в том, 
что  под  влиянием  облучения  изменяется  кристаллическая  решетка  стекла. 

Оно  темнеет,  мутнеет  и  приобретает,  таким  образом,  непривлекательный,  с 

коммерческой  точки  зрения  вид,  хотя  полностью  сохраняет  свои 

функциональные  качества.  Потемнение  обратимо,  но    при  комнатной 

температуре  происходит  медленно  (несколько  месяцев).  Не  выпускать 

облученные  препараты  в  течение  такого  срока  в  аптечную  сеть – значит, 

сократить  для  потребителя  срок  годности  облученных  серий.  Теоретически 

для  изготовления  флаконов  и  ампул  можно  использовать  стекло  с 

некоторыми  редкоземельными  элементами  (марки  стекла  такого  типа 

применяются  в  военной  технике).  Однако,  это  стекло  слишком  дорого  для 

изготовления из него сотен миллионов единиц стандартных изделий. 

7.4.   Механизмы действия антибиотиков  

Изучение  механизмов  действия  таких  высокоактивных  и  вместе  с  тем

избирательных  ингибиторов  метаболизма,  как  антибиотики  связано  с 

определенными  проблемами,  так  как,  помимо  первичного  нарушения 

метаболизма,  вызываемого  непосредственно  реагированием  антибиотика  с 

его  внутриклеточной  мишенью,  наступает  «каскад»  вторичных  реакций, 

ведущих к конечному бактериостатическому или бактерицидному, а иногда и 

литическому  эффекту. 

Применяемые  в  медицине  антибиотики  по  механизму  действия 

 

176

дифференцируются на следующие основные группы:              

7.4.1.   Ингибиторы образования клеточной стенки бактерий

   Ингибирование  происходит  вследствие  избирательного  подавления  актив-

ности  тех  или  иных  ферментов,  включенных  в  многоэтапный  синтез 

основного  полимера  клеточной  стенки – пептидогликана.  В  число 

ингибиторов  синтеза  пептидогликана  входят  цефалоспорины  и  другие 

вещества беталактамной структуры. 

Пептидогликан,  в  соответствии  со  своим  названием,  состоит  из 

принципиально  разных  частей.  Его  длинные,  параллельно  расположенные 

по  отношению  друг  к  другу  гликановые  нити    построены  из 

перемежающихся  остатков  двух  сахаров: N-ацетилглюкозамина  и 

мурамовой 

кислоты. 

Мурамовая 

кислота 

является 

эфиром N-

ацетилглюкозамина  и  молочной  кислоты  (ее  название  происходит  от  греч. 

murus - стена, так как впервые она была обнаружена в клеточкой стенке бак-

терий). Пептидная часть полимера состоит из коротких пептидных цепочек 

(3-5 аминокислотных остатков), отходящих от остатков мурамовой кислоты 

в  гликане.  Пептидные  цепочки,  ответвляющиеся    таким  образом  от  парал-

лельных  гликановых  нитей,  замыкаются  друг  с  другом  за  счет  пептидной 

связи.  Между  параллельными  нитями  гликана  образуются  поперечные 

пептидные  «мостики»  и  формируется  завершенный  или  целостный 

пептидогликан,  который  жесткой  «сетью»  охватывает  всю  бактериальную 

клетку (рис.14). 

Грамположительные  бактерии  имеют  толстый  слой  пептидогликана;  у 

грамотрицательных - он гораздо тоньше.             

Беталактамные  антибиотики  (все  без  исключения)  во  время  биосинтеза 

пептидогликана  подавляют  катализируемое  ферментами  замыкание 

пептидных  цепочек  в  пептидные  мостики.  Гликановые  нити  остаются 

разъединенными;  формирования  непрерывной  сети  пептидогликана, 

охватывающей клетку, не происходит.  

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  20  21  22  23   ..