Курс лекций по биотехнологии - часть 21

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  19  20  21  22   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 21

 

 

 

161

антибиотика, 

не 

принадлежащие 

к 

ферментам, 

катализирующим 

превращения первичных метаболитов в обычных метаболических циклах. 

Затем  LLD-трипептид превращается в моноциклический беталактам, то есть 

происходит замыкание беталактамного кольца. Слeдующий этап - появление 

пятичленного 

серусодержащего 

кольца, 

сконденсированного 

с 

беталактамным.  Все  это  означает  участие  в  биосинтезе  антибиотика  новых 

ферментов.  В    случае  образования  бензилпенициллина    необходимо 

присутствие    фенилуксусной    кислоты  (в  активированной  форме),  в 

результате чего освобождаются аминоадипиновая кислота и кофермент А.  

Во  втором  случае  происходит  «экспансия» - расширение  пятичленного 

кольца  до  шестичленного,  что  катализируется  специфическим  ферментом, 

получившим  название  «экспандазы».  Далее,  в  результате  еще  ряда  реакций 

формируется молекула цефалоспорина С. 

Вышеперечисленные  реакции  биосинтеза  демонстрируются  как  пример, для 

того,  чтобы  еще  раз  подчеркнуть  основополагающий  тезис  -  молекула 

любого  антибиотика  синтезируется  с  обязательным  участием  ряда (5-10 и 

более) ферментов. 

На  основании  анализа    структурных  формул    аминогликозидов – 

(стрептомицина  и  гентамицинов  и  др.),  можно  сделать  предположение,  что 

их  предшественником  является  глюкоза.  Действительно,  как  показали 

многочисленные исследования, из глюкозы синтезируются не только остатки 

сахаров  в  молекулах  аминогликозидов,  но  и  их  аминоциклитольный 

фрагмент.  Два  других  фрагмента  молекулы  стрептомицина:  пентоза 

(стрептоза)  и L-глюкозамин,  также  образуются  из  глюкозы  за  счет  ряда 

ферментативных реакций. Наконец, сборка молекулы стрептомицина из трех 

компонентов - стрептидина,  стрептозы  и L-глюкозамина  (замыкание  между 

ними гликозидных связей) требует специфических ферментов. В биосинтезе 

стрептомицина  и  большинства  других  аминогликозидных  антибиотиков 

участвуют не менее двадцати ферментов. 

 

162

Описывая ферментативные реакции биосинтеза тетрациклиновой структуры, 

обычно проводят аналогию с биосинтезом первичных метаболитов - жирных 

кислот,  из  остатков  ацетатных  или  пропионатных  единиц  по  принципу 

«голова  к  хвосту»,  когда  формируется  связь  между  углеродом 

карбоксильной  группы  и  углеродом  метильной  группы  (или  метиленовой 

группы)  следующей  единицы.  В  этих  ферментативных  реакциях  участвует 

кофермент А.                    

Существуют,  однако,  и  принципиальные  отличия  между  синтезом  жирных 

кислот  и  антибиотиков - вторичных  метаболитов.  При  биосинтезе  

антибиотиков  не  происходит  восстановления  карбонильных  групп  после 

реакции  конденсации  или  такое  восстановление  происходит  до образования 

гидроксильной  группы  или  двойных  связей.  При  полном  восстановлении 

образуются  ароматические  структуры;  при  неполном - макроциклические 

лактоны.  Таким  образом,  имеется  определенная  связь  между  «биогенезом» 

таких  соединений  как  тетрациклины  и  антибиотики-макролиды.  Скелет 

молекулы  тетрациклинов  строится  из  одной  малонамидной  единицы  и 

восьми малонатных. 

Основа  структуры  лактонного  макроциклического  кольца  эритромицина 

образуется  как  результат  ферментативной  полимеризации  одной  единицы 

пропионата  и  шести  единиц  метилмалоната.  Сахара  эритромицина 

происходят  из  глюкозы  за  счет  ряда  ферментативных  превращений.             

Далее,  в  биосинтезе  участвуют  ферменты  сборки  молекулы  из 

макроциклического лактона и сахаров. 

Как известно, методы генетической инженерии с успехом используются  при 

создании  продуцентов  рекомбинантных  белков.  Это  объясняется  тем,  что 

белки - прямые  продукты  трансляции.  В  целом  остается  справедливым 

правило: один ген - один белок. То есть, один «структурный» ген определяет 

структуру (последовательность аминокислот) одного белка. 

 

163

Антибиотики не являются  прямыми продуктами трансляции в отличие от  

ферментов биосинтеза антибиотиков. Количество таких ферментов достигает  

нескольких  десятков.  Таким  образом,  в  биосинтезе  молекулы  антибиотика 

принимают участие десятки «структурных»  генов.   

7.3.  Биотехнология антибиотиков  

Фактически  ни  один  продуцент,  выделенный  из  почвы  или  другого 

природного  источника,  непосредственно  в  производстве  использован  быть 

не  может.  Природный  штамм  образует  лишь  незначительные  количества 

антибиотиков.  Путем  обработки  мутагенами  и  многоступенчатого  отбора 

(селекции)  активных  вариантов  обычно  удается  повысить  активность 

штамма,  так  как  количество  образуемого  им  антибиотика  увеличивается  в 

сотни,  тысячи  и  даже  десятки  тысяч  раз.  Например,  у  продуцента 

пенициллина  в  результате  десятков  лет  селекционной  работы  во  многих 

лабораториях  разных  стран  мира,  активность  повысилась  от  нескольких 

десятков мкг антибиотика в мл среды до 100.000 мкг. 

У 

промышленных 

мутантных 

штаммов 

(рабочий 

термин 

«суперпродуценты»)  антибиотик,  образуемый  в  огромном  количестве  не 

должен влиять:  

1) 

на собственный биосинтез,  

2) 

на жизнедеятельность своего продуцента. 

Как известно, избыточное образование метаболита ведет к прекращению  его 

биосинтеза по принципу обратной связи, о чем подробно рассказано в главе 3 

п.3.2.  «Ретроингибирование  и  преодоление  этого  явления».  В  случае 

суперпродуцентов механизм обратной связи исключен.                                                 

Жизнедеятельность  суперпродуцентов  сохраняется  в  результате  различных 

причин: 

1. Максимум концентрации антибиотика достигается, когда рост   культуры 

либо завершается, либо практически  уже  завершен. 

 

164

2. Антибиотик синтезируется в тех местах клетки, которые отделены от мест 
локализации жизненно-важных метаболических процессов. 
3.  После  выхода  антибиотика  из  мицелия  в  среду,  вновь  в  мицелий  он  не 
проникает, то есть транспорт антибиотика через оболочку продуцента имеет 
одностороннее направление.  
Однако,  свойство  образовывать  избыточные  количества  антибиотиков - не 
стойко.  Оно  легко  теряется  полностью  или  частично,  поэтому 
промышленные  продуценты  хранят  в  особых  условиях,  периодически 
проверяя  их  активность.  В  случае  необходимости  производится  рассев  на 
отдельные колонии, из которых затем отбираются наиболее активные.        
При  разработке  биотехнологии  антибиотиков  учитываются  общие  свойства 
продуцентов,  а  также  то  обстоятельство,  что  каждый  антибиотик    является  
конечным    продуктом  длинной  цепи  специфических  ферментативных 
реакций.   
Продуценты  большинства  антибиотиков,  в  том  числе  важнейших  для 
медицинской  практики,  являются  аэробами  или  (реже)  факультативными 
анаэробами.  В  связи  с  этим,  в  первые  годы  после  получения  пенициллина, 
грамицидина С и некоторых других веществ, их продуценты выращивали на 
поверхности  жидкой  питательной  среды  в  стационарных  условиях  в 
микробиологических  матрацах  или  колбах,  помещаемых  в  термостат  или 
термостатные  комнаты.  Культура  продуцента  росла  только  на  поверхности 
среды.  Этот  способ  был  трудоемок,  не  экономичен  и  не  позволял 
нарабатывать  антибиотик  в  больших  количествах.  Очень  скоро 
поверхностная  ферментация  была  заменена  на  глубинную.  Через 
питательную  среду  пропускали  воздух  и  среду  непрерывно  перемешивали. 
Это позволило использовать для роста продуцента весь объём среды. Только 
глубинная 

ферментация 

создала 

возможность 

современного 

биотехнологического  производства  с  выпуском  конечного  продукта  в 
большом количестве.  
Кривая накопления биомассы продуцента и кривая накопления антибиотика 
в культуральной жидкости, а также и в мицелии продуцента, не совпадают во 
времени. Вторая  кривая значительно запаздывает (рис.13). 
 

 

165

 

 

 

Рис. 13.

.                             

Особенности ферментационного процесса при получении 

                           антибиотиков 
 

Интенсивность 
процесса 

4

Биомасса 

Антибиотик 

Углеводы 

Источники 
азота 

Трофофаза 

Идиофаза 

Время
(сутки

 

166

 
Это  относится  к  продуцентам  всех  важнейших  антибиотиков:  грибам, 

актиномицетам,  споровым  бактериям.  Первая  фаза  развития  культуры 

продуцента  во  время  ферментационного  процесса  получила  название 

«трофофазы» - фазы сбалансированного роста. Вторая фаза – «идиофаза» или 

фаза  несбалансированного  роста.  В  течение  трофофазы  антибиотик  в 

культуральной  жидкости  не  обнаруживается  или  обнаруживается  в 

незначительных  количествах.  Во  время  идиофазы  прирост  биомассы 

замедляется.  Наступает  быстрое  накопление  антибиотика  в  культуральной 

жидкости.  Источники  углерода  и  азота  в  среде  быстро  потребляются  вo 

время  трофофазы  и  количество  их  в  среде  уменьшается.  При  протекании 

идиофазы - их  потребление  замедляется.  Следует  отметить,  что  в  конце 

идиофазы  происходит  частичный  лизис  густой  культуры  мицелия. 

Одновременно в культуре можно обнаружить и некоторое количество новых 

гиф,  то  есть  нитей  молодого  мицелия,  который    находится  уже  в  условиях 

среды,  обедненной  питательными  веществами,  и  участвует  в  биосинтезе 

антибиотика. 

Таким    образом,  интенсивному  биосинтезу  антибиотика  способствует 

значительное  уменьшение  в  среде  источников  углерода  и  азота,  особенно 

легко  усваиваемых.  В  этом  случае  происходит  дерепрессия  ферментов 

синтеза  антибиотика.  Однако,  выращивание  продуцентов  с  самого  начала 

ферментации  на  обедненных  средах - нецелесообразно,  так  как 

незначительное  накопление  биомассы  в  течение  трофофазы  ведет,  в 

конечном  счете,  и  к  незначительному  накоплению  антибиотика  малым 

количеством клеток продуцента. 

Приведенный  выше  материал  показывает,  что  для  высокопродуктивной 

ферментации  необходимо  соблюдать  определенные  условия.  Продуценты 

антибиотиков  выращивают  на  разных  средах,  как  относительно  простого 

состава, так и сложного. Последние  получили название комплексных сред. В 

 

167

них могут входить соевая или хлопковая мука, кукурузный экстракт и другие 

природные  многокомпонентные  источники  питательных  веществ.  Также  в 

среды  вносят  индивидуальные  органические  соединения  и  минеральные 

соли.  Следует  отметить,  что  для  каждого  штамма-продуцента  состав 

оптимальной  для  биосинтеза  антибиотика  среды  подбирается  отдельно.  Это 

относится  даже  к  штаммам  одного  вида,  продуцирующим  один  и  тот  же 

антибиотик.  Существуют,  однако,  и  некоторые  общие  закономерности, 

которые учитываются при работе с большинством продуцентов. 

Углеродкатаболитная 

регуляция 

является 

одним 

из 

механизмов, 

воздействующих  на  биосинтез  вторичных  метаболитов.  Известно,  что 

глюкоза - лучший  источник  углерода  и  энергии  для  любых  организмов. 

Однако,  быстрый  катаболизм  глюкозы  резко  снижает  биосинтез 

антибиотиков.  Показано,  что  глюкоза  ослабляет  биосинтез  беталактамов, 

аминогликозидов  и  многих  других  антибиотиков,  образуемых  различными 

продуцентами.  Относительно  биосинтеза  антибиотиков  следует  отметить, 

что  глюкоза,  фруктоза,  сахароза  и  галактоза - сильные  репрессоры  этого 

процесса.  Также  необходимо  подчеркнуть,  что  продукты  катаболизма 

глюкозы  подавляют  не  активность  ферментов  биосинтеза  антибиотиков,  а 

сам  синтез  этих  ферментов.  Медленно  утилизирующиеся  полисахариды 

(крахмал  и  др.)  более  благоприятны  для  биосинтеза  антибиотиков.  Не 

является  репрессором  биосинтеза  и  лактоза,  которая  также  медленно 

утилизируется:  при  ее  гидролизе  освобождающаяся  глюкоза  репрессирует 

бета-галактозидазу  и,  в  результате,  гидролиз  лактозы  (появление  в  среде 

глюкозы) замедляется.     

Высокое  содержание  в  среде  фосфора  (в  виде    неорганических  фосфатных 

солей)  неблагоприятно  для  биосинтеза  большинства  антибиотиков.  Общая 

причина  этого - обогащение  клетки  макроэргическими  фосфорными 

соединениями  (прежде  всего  АТФ),  что  повышает  скорость  роста  мицелия. 

Накапливается  много  биомассы,  но  относительно  мало  антибиотика. 

 

168

Например,  высокоактивные  штаммы  продуцентов  тетрациклиновых 

антибиотиков    содержат  в  мицелии  меньше  АТФ  и  медленнее  растут,  чем 

исходные  низкоактивные  продуценты  тетрациклинов.  Неблагоприятное 

действие фосфора на биосинтез беталактамных антибиотиков объясняется на 

биохимическом  уровне  следующим  механизмом:  образование LLD-

трипептида  -  ключевого  соединения,  с  которого  начинается  синтез 

пенициллинов  и  цефалоспоринов,  ингибируется  глюкозо-6-фосфатом. 

Взаимодействие 

легкоокисляемого 

сахара 

и 

фосфата 

оказывает 

отрицательный  эффект  на  биосинтез.  Однако,  все  вышеизложенное  не 

означает, что фосфор может быть полностью исключен из среды. Биосинтез 

антибиотиков  снижается  при  его  избыточном  количестве,  поэтому  для 

каждого штамма-продуцента подбирается оптимальное содержание фосфора 

в среде. 

Аммоний  и  другие  легкоутилизируемые  источники  азота,  подобно  легко 

окисляемым  углеводам,  усиливают  рост  продуцентов  беталактамных, 

полиеновых  антибиотиков  (эритромицина,  рифамицинов    и  др.),  но  отрица-

тельно  влияют  на  их  биосинтез.  Соевая  и  хлопковая  мука,  БВК  (белково-

витаминный  концентрат)  медленно  расщепляются  в  процессе  ферментации, 

то  есть  из  них  медленно  высвобождаются  аминокислоты  и  ионы  аммония,  

поэтому  их  используют  в  качестве  компонентов  питательных  сред,  что 

позволяет получать высокий выход антибиотиков. Механизм отрицательного 

действия  легкоусваяемых  источников  азота  на  биосинтез  антибиотиков  не 

ясен.  Есть  данные,  что  у  продуцентов  беталактамов  он  связан  с  уровнем 

глутаминсинтетазы  в  мицелии.  Известно,  что  глутамин  является  донором 

аминогрупп  для  ряда  аминокислот,  а  сами  аминокислоты,  в  свою  очередь, 

являются предшественниками беталактамных антибиотиков. Вероятно, что у 

разных  продуцентов  механизм  этого  действия  на  биосинтез  различен.  В 

любом  случае,  неблагоприятное  действие  легкоусвояемых  источников  азота 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  19  20  21  22   ..