Курс лекций по биотехнологии - часть 14

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  12  13  14  15   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 14

 

 

 

105

Если источником целевого продукта является микроорганизм (например, при 
производстве  антибиотиков),  то  для  его  культивирования  обязательны 
асептические  условия,  соответствующее  оборудование  и  специальная 
подготовка к проведению процесса. 

Свои 

особенности 

имеет 

биотехнологическое 

производство, 

основанное 

на 

использовании 

микроорганизмов-рекомбинантов, которое требует усиленного  контроля  за  
стабильностью  продуцента,  и,  кроме  того,  тщательного  и  постоянного 
соблюдения  мер,  предотвращающих  возможность  попадания  этого 
биообъекта  в  окружающую  среду.  Такие  меры  предусматривают 
использование  специального  оборудования    и    соблюдения    определенных 
правил, относящихся  непосредственно к технологическому режиму. 
 

В современном биотехнологическом производстве наиболее частым 

биообъектом, то есть продуцентом целевого продукта, является штамм 
микроорганизма, выращиваемый в специальных ферментационных аппаратах 
(ферментерах или ферментаторах) различных типов (рис.10). Ферментер 
снабжен приспособлениями (так называемая «обвязка» ферментера), 
позволяющими создавать оптимальные условия для роста биообъекта и 
биосинтеза целевого продукта (не всегда эти условия совпадают). 
 

Ферментационные аппараты, используемые фармацевтической 

промышленностью, в основном,  изготавливаются из нержавеющей стали. Их 
объем  варьирует от нескольких десятков до нескольких сотен кубометров. 
Обычно ферментер, установленный в цехе ферментации, выглядит как 
вертикально расположенный цилиндр с полукруглым дном, в котором 
имеется приспособление для слива культуральной жидкости. В верхней 
части ферментера имеется   полукруглая крышка с рядом входных устройств 
(вводов): для питательной среды, для посевного материала, для 
пропускаемого через специальное устройство воздуха (аэрация) и выходного 
устройства  для вывода  воздуха, прошедшего через толщу питательной 
среды и т.д. В центре ферментера по его вертикальной оси находится 
мешалка (одноярусная, многоярусная), обеспечивающая  массообмен. Во 
внутреннем пространстве ферментера находятся «отбойники», 
предотвращающие возникновение «застойных» (мертвых) зон при работе 
мешалки. Этим  обеспечивается равномерность концентрации растворимых 
веществ и коллоидных частиц в среде.

 

 
 
 

 

106

 

 
 

А - реактор с механическим перемешиванием 
Б – барботажная колонна 
В – эрлифтный реактор с внутренней рециркуляцией 
Г - эрлифтный реактор с внешней системой рециркуляции 

Стрелки – направление потока культуральной жидкости    

 

Рис. 10.              Типы ферментеров

   

 

 

107

Постоянство  оптимальной  для  процесса  температуры  в  ферментере  обычно 

поддерживается его наружной «рубашкой», через которую пропускается вода 

с заданной температурой. 

Важнейшим  условием  успешного  осуществления  ферментации  является 

соблюдение  стерильности  процесса.  В  реальных  условиях  добиться 

стерильности  не  просто.  Этому  мешают  большой  объем  ферментера  и 

сложность  состава среды, а также большой объем пропускаемого через него 

воздуха  и    сложность  конструкции  самого  ферментера.  Попадание  в 

культуральную  среду  и  размножение  в  ней  различных  микроорганизмов  во 

время ферментации приводит к изменению ее состава,  рН и реологических 

свойств, что, в конечном счете, ведет к снижению выхода целевого продукта. 

Также,  в  нем  могут  присутствовать  в  виде  примесей  (или  микропримесей) 

новые  соединения,  образовавшиеся  в  результате  жизнедеятельности 

посторонней микрофлоры. 

Не  стерильные  ферментации  недопустимы.  Ввиду  этого  перед  проведением 

каждого ферментационного цикла  проводятся следующие подготовительные 

мероприятия:  

-стерилизация всех внутренних поверхностей ферментера и входящих в него 

трубопроводов; 

-  стерилизация  пропускаемого  через  ферментер  воздуха  (так  называемого 

«технологического воздуха», подаваемого  в ферментер под давлением); 

- стерилизация питательных сред. 

Как правило, ферментер заполняется питательной средой только на две трети 

своей  емкости.  Вносимый  в    ферментер  посевной  материал,  должен  быть 

представлен  чистой  культурой  биообъекта  (не  зараженной  другими 

микроорганизмами).  

Следует  иметь  в  виду,  что  при  нарушении  стерильности  в  одном  месте 

контаминируется  вся  система  и  содержимое  ферментера  по  жаргонному 

выражению производственников «сливается в трап», то есть выбрасывается. 

 

108

Сложность  ситуации  заключается  еще  и  в  том,  что  для  обнаружения 

заражения 

воды, 

воздуха 

и 

компонентов 

питательных 

сред 

микробиологическим путем, необходимо  длительное время (от 24-х часов до 

нескольких  суток).  Такой  период  времени  нужен  для  того,  чтобы 

концентрация  посторонних  клеток    увеличилась  до 10

3

  клеток/мл,  что 

составляет их видимое количество в микробиологическим мазке.    

4.2.   Подготовка и стерилизация технологического воздуха. 

 

Эта  подготовительная  операция  требуется  для  обеспечения  дыхания 

микроорганизмов – биообъектов,  большинство  которых  являются  аэробами. 

Использовать для аэрации  кислород целесообразно, но не экономически, ни 

с  точки  зрения  техники  безопасности.  Используется  воздух.  Забор  воздуха, 

который  под  давлением  поступает  в    ферментер,  производится 

непосредственно на территории предприятия. 

 

Для  того,  чтобы  получить  представление  о  том,  какое  количество 

воздуха  нужно  для  обеспечения  одной  ферментации  в  промышленном 

масштабе  достаточно  такого  примера:  в  ферментер  объемом 50 м

3

  подается 

стерильного воздуха порядка 3000 м

3

 в час, а  время ферментации измеряется 

несколькими сутками. 

Для  очистки  и  стерилизации  воздуха  используется  его  многократная 

фильтрация (рис.11). 

На  первом  этапе  получения  пригодного  для  пропускания    через  ферментер 

(«технологического») воздуха производится его очистка от пыли  в фильтре 

предварительной  очистки.  Далее,  принципиальная  схема  получения 

стерильного  воздуха  включает:  компрессор  с  системой  холодильников, 

фильтр  грубой  очистки,  а  также  систему  стерилизации  (головной  фильтр, 

фильтры    для  тонкой  очистки).  Таким  образом,  воздух  подвергается  не 

менее,  чем  трехкратной  фильтрации  и,  как  минимум,  дважды  пропускается 

через  стерилизующие фильтры.  

 

109

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Стрелки – направление потока воздуха 

 

Рис. 11.              Схема очистки технологического воздуха 

 

При этом,  если головной фильтр является общим для всех аппаратов в цехе 

или  вне  цеха    ферментации,  то  фильтры    тонкой    очистки  являются 

индивидуальными, то есть каждый из них относится к конкретному аппарату.  

На  стадии  грубой  очистки  (головной  фильтр)  используются  волокнистые 

фильтрующие материалы с диаметрами волокон от 15 до 50 мкм из стекла и 

базальта  и    грубозернистые  пористые  перегородки.  Эффективность  очистки 

на этой стадии достигает 98%. 

фильтр 
предварительной 
очистки  

компрессор

 

 

холодильник 

(теплообменник) 

 

влагоотделитель

головной фильтр или 
фильтр грубой 
очистки 

фильтр индивидуальной 
очистки, характерный для 
каждого ферментера  

за пределами цеха ферментации находятся: 

в цехе ферментации располагается  

 

110

На  стадии  тонкой  очистки  (индивидуальные  фильтры)  применяются 

тонковолокнистые материалы с диаметром 0,5 мкм в виде картона и бумаги; 

зернистые    жесткие  фильтрующие  перегородки – керамические  и  

металлокерамические  из  различных  полимеров.  Используются  также 

мембранные фильтры. 

При  выборе  фильтрующих  материалов  принимается    во  внимание  размер 

бактериальной  клетки  (например,  для  кокковых  форм    выбирается  диаметр   

1  мкм,  а    для    такой  широко  распространенной  бактерии,  как    кишечная 

палочка - 2 мкм).   Естественно,  возникает  вопрос  о  защите  находящихся  в 

ферментере биообъектов  - бактерий,  актиномицетов, грибов от фагов. Это 

трудная 

задача, 

которая 

решается, 

прежде 

всего, 

получением 

фагоустойчивых штаммов биообъекта. 

Постоянное  использование  фильтров,  стерилизующих  технологический 

воздух, требует также периодической стерилизации самих фильтров, так как 

задержанные фильтром микроорганизмы могут при благоприятных условиях 

размножаться.  Слои  фильтрующего  материала  будут  при  этом  прорастать, 

микроорганизм появляется на «чистой стороне» фильтра и затем, с потоком 

воздуха,  проходящего  через  фильтр,  распространиться  по  воздуховодам  и 

внутренней  поверхности  ферментера.  В  принципе,  стерилизация  фильтров 

может  быть    проведена  разными  путями:  обработкой  антисептиками, 

обработкой  ионизирующим  облучением  и,  наконец,  тепловой  обработкой. 

Последний  метод  наиболее  надежен  и  экономичен.  В  этом  случае 

стерилизация  проводится  паром.  При  выборе  режима  стерилизации 

необходимо  учитывать,  с  одной  стороны,  обязательность  уничтожения  всех 

микробных  клеток  и  всех  спор,  а,  с  другой  стороны,  желательно -  

сохранение  свойств  фильтрующего  материала  с  тем,  чтобы  продлить  срок 

службы  фильтров.  Обычно  рекомендуемая  температура  при  обработке 

паром 120-125

о  

С, время обработки - 20-30 минут. 

 

111

 

4.3.   Герметизация и стерилизация оборудования. 

 

Асептические  условия  производства  требуют  стерилизации  перед 

началом процесса всей аппаратуры (изнутри) и всех материальных потоков. 

Этого, однако, недостаточно. Стерильность должна быть сохранена в течение 

всего  рабочего  цикла.  Иными  словами,  технологический  процесс  должен 

быть защищен от контаминации за счет герметизации, то есть   обеспечения 

герметичности  всех соединений  в аппаратуре. 

 

В  монтажной  схеме  любого    ферментера  имеется  несколько  десятков 

различного рода герметизирующих элементов. Наиболее распространенными 

из них являются фланцевые соединения и запорная арматура. Это уязвимые 

места в отношении герметичности смонтированного с обвязкой  ферментера.   

В системах, работающих в асептических условиях, должна быть обеспечена 

возможность  стерилизации  всех  точек  внутренних  объектов  аппаратов  и 

коммуникаций.  Для  этого  перед  загрузкой  ферментеров,  через  них 

пропускают  насыщенный  водяной  пар  под  давлением.  Однако,  здесь 

существуют  свои  сложности.  Это  касается,  например,  открытых  трубных 

окончаний.  Так  именуются  участки  труб,  соединенные  одним  концом  с 

полостью  ферментера,  а  другим - соприкасающиеся  с  атмосферой.  К  ним 

относятся  «узел  отвода»,  отработанного,  то  есть  прошедшего  через 

ферментер,  воздуха  и  «узлы  отбора  проб».  Так  как  повышенное  давление  в 

открытом  трубном  окончании  создать  невозможно,  следовательно,  и 

температура  там  будет  не  выше 100

о

С.  Из-за  этого  приходится  увеличивать 

продолжительность обработки. Обычно в трубе делается врезка и  во  время 

работы  пар  непрерывно  подается  в  открытое  трубное  окончание.  Второй 

пример:  так  называемые  «тупиковые  полости».  В  данном  случае  трудно 

обеспечить  вытеснение  воздуха  и  циркуляцию  пара.  Обычно  в  трубопровод 

врезаются  два  вентиля,  между  которыми  подводят  пар  и  отводят 

образующийся конденсат. 

 

112

Промышленные  ферментеры  большого  объема  стерилизуют  один  час  при 

температуре 125-130

о

С. 

4.4.   Стерилизация питательных сред. 

           Используемые  в  промышленности  среды  (как  правило,  это  жидкие, 

комплексные  среды;  реже – синтетические),  стерилизуются  тепловым 

методом  (насыщенным  паром). 

Устойчивость  микроорганизмов  к  тепловому  воздействию    определяется 

многими  факторами,  к  числу  которых  относится,  например,  видовая 

принадлежность микроорганизма; также учитывается то обстоятельство, что 

споры  гораздо  устойчивее  к  нагреванию,  чем  вегетативные  клетки.  На 

эффективность  тепловой  стерилизации  влияет  количество  клеток  в  среде - 

чем  их  меньше,  тем  легче  достигается  стерилизующий  эффект.  Из  этого 

следует,  что  перед  стерилизацией  необходимо    понижать  количество 

микробных  клеток  в  среде.  Определяющее  значение    при  тепловой 

стерилизации  имеют  температура  и  время  ее  поддержания.  Чем  выше 

температура,  тем  меньше  времени  нужно  для  получения  стерилизующего 

эффекта.  Для  оценки  эффективности  процесса  стерилизации  используются 

физические (по температуре и давлению пара), химические  (по температуре 

плавления  или  изменению  цвета),  микробиологические  (высев  на 

стандартные  среды),  биоиндикаторные  (с  использованием Bacillus 

stearothermoрhilus) методы. 

При 

тепловой 

стерилизации, 

помимо 

гибели 

контаминирующих 

микроорганизмов, может происходить разрушение термолабильных веществ  

среды:  витаминов,  ферментов,  некоторых  аминокислот.  С  этим  явлением, 

ухудшающим  качество  питательных  сред  борются,  повышая  температуру  и 

уменьшая время стерилизации.  

Тепловая  стерилизация  жидкостей  может  производиться  двумя  способами: 

периодическим  и  непрерывным.  При  периодическом  способе  стерилизация 

происходит    в  самом  ферментере.  Одновременно  нагревается  весь  объем  

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  12  13  14  15   ..