Курс лекций по биотехнологии - часть 13

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  11  12  13  14   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 13

 

 

 

97

вещества  могут  выводиться  путем  пассивной  или  облегченной  диффузии. 

Однако,  вместе  с  тем  существуют  и  энергозависимые  системы.  Особый 

интерес  у  биотехнологов,  в  том  числе  работающих  в  области  получения 

рекомбинантных  белков,  вызывает  проблема  выведения  из  клетки  белка, 

синтезируемого  в  цитоплазме,  включая  чужеродный  белок,  являющийся 

целевым продуктом. В данном случае биотехнолог идет по пути повторения 

выработанного  эволюцией  механизма  секреции  таких  белков,  как 

внеклеточные  ферменты.  Когда  синтезируется  такого  рода  белок,  которому 

предстоит  пересечь  цитоплазматическую  мембрану  и  выйти  из  клетки  в 

среду,  то,  во-первых,  его  синтез  происходит  на  рибосомах,  связанных  с 

обращенной в цитоплазму поверхностью цитоплазматической мембраны, во-

вторых,  покидающая  рибосому  полипептидная  цепь  на  своем N-

терминальном  конце  содержит  сигнальный  или  лидерный  пептид (15-30 

аминокислотных  остатков).  Этот  дополнительный  участок  в  полипептидной 

цепи временно нужен для выведения внеклеточного белка из клетки и имеет 

свои особенности:  

-  конечный  аминокислотный  остаток  имеет  положительный  заряд 

(облегчается  взаимодействие  с  поверхностью  мембраны,  имеющей 

отрицательный заряд); 

- наличие протяженного участка гидрофобных аминокислотных остатков, что 

облегчает прохождение через липидные слои мембраны; 

-  наличие  специфичного  участка  для  действия  так  называемой  сигнальной 

протеазы  (или  пептидазы) - мембранного  фермента,  катализирующего 

отщепление  лидерного  пептида  от  основной  полипептидной  цепи  после  

выполнения  функции  своеобразного  проводника  новой  белковой  молекулы 

из клетки в среду.  

Таким  образом,  рекомбинантый  белок,  например,  видоспецифичный 

белковый  гормон  человека, синтезируемый  в цитоплазме  микробной  клетки 

и  не  имеющий  специфической  лидерной  последовательности,  можно  с 

 

98

помощью 

методов 

генетической 

инженерии 

снабдить 

лидерной 

последовательностью, с тем условием, чтобы она могла быть субстратом для 

микробной  сигнальной  пептидазы.  Отсюда  следует  проблема  создания 

гибридных  (химерных)  белков  с  лидерной  последовательностью, 

принадлежащей,  например,  к  внешнеклеточной  пенициллиназе.  Разумеется, 

проблема  выведения  чужеродных  белков,  не  решается  однозначно  и  только 

за  счет  присоединения  лидерной  последовательности,  так  как  существует 

много других факторов, влияющих на экскрецию белков. 

 

В  заключение  этого  краткого  рассмотрения  проблем  транспорта 

веществ в клетку и из клетки следует обратить особое внимание на мутации. 

Так  как  такие  мутации  могут  затрагивать  ферментные  системы  транспорта, 

молекулы  переносчиков,  структурные  компоненты  цитоплазматической  и 

внешней  мембран,  то  это  дает  биотехнологу  богатый  набор  мутантов  с 

самыми  разнообразными  изменениями  физиологических  и  биохимических 

свойств.  Особенности  транспортных  систем  у  некоторых  биообъектов 

определяют их способность воздействовать на окружающую среду в нужном 

для  человека  аспекте.  Так,  например,  ряд  представителей  микроорганизмов 

рода Pseudomonas и  целенаправленно  полученных  от  природных  культур 

мутантов,  обезвреживают  самые  разнообразные  химические  соединения 

(кольчатые  углеводороды  и  др.),  попадание  которых  в  окружающую  среду 

приводит  к  нарушению  экологии  в  обширных  географических  регионах. 

Причем  способность  вышеуказанных  микроорганизмов  обезвреживать 

загрязнения  обусловлена  не  только  набором  ферментов,  утилизирующих 

экзотические вещества, но и особенностями транспортных систем, начиная с 

режима осцилляции пориновых каналов внешней мембраны и т.п. 

3.7.    Молекулярные  механизмы  защиты  продуцентов  от  веществ  с 

«суицидным эффектом» 

Биотехнологам,  создающим  суперпродуценты  биологичеки  активных 

веществ,  как  правило,  приходится  сталкиваться  с  проблемой  защиты 

 

99

продуцента  от  вырабатываемого  в  большом  количестве  целевого  продукта. 

Особенно  наглядно  это  демонстрируется  при  создании  суперпродуцентов 

вторичных  микробных  метаболитов.  С  одной  стороны,  образуемые  в 

почвенных  биоценозах  микробные  метаболиты  нередко  имеют  функцию 

«оружия  в  борьбе  за  существование».  С  другой  стороны,  за  счет  мутаций, 

клеточной  и  генетической  инженерии,  а  также  подбора  специальных 

питательных  сред,  такие  вещества  начинают  вырабатываться  клеткой  в 

неестественно больших для нее количествах (сотни и тысячи раз). 

С позиций биотехнологии проблему защиты продуцентов от образуемых ими 

веществ  нельзя  рассматривать  только  применительно  к  антибиотикам. 

Однако,  последние  являются  наиболее  показательным  примером  защиты 

клетки  от  потенциально  «суицидных»  собственных  веществ,  способных 

вызывать  ее  гибель.  Механизмы  защиты  продуцента  от  собственной 

сверхпродуктивности могут быть различны. 

 

В  случае  антибиотиков  таких  механизмов  несколько.  Роль  каждого 

механизма  защиты  зависит,  в  свою  очередь,  от  механизма  биологической 

активности 

конкретного 

антибиотика. 

Известно, 

что 

наиболее 

распространенную  группу  антибиотиков,  применяемых  в  клинике,  если  не 

считать  беталактамов,  составляют  ингибиторы  синтеза  белка  у  бактерий  на 

рибосомном  уровне:  тетрациклины,  аминогликозиды,  макролиды  и 

некоторые  другие.  Их  продуцентами  являются  актиномицеты,  то  есть 

многоклеточные  бактерии,  способность  которых  выдерживать  высокие 

концентрации  собственных  антибиотиков  объясняется  несколькими 

причинами.  Из  них  главной - является  особенность  биосинтеза  их  молекул 

(точнее  сборка  углеродного  скелета),  который  происходит  особенно 

интенсивно  и  достигает  максимума  тогда,  когда  культура  продуцента 

замедляет  скорость  размножения  своих  клеток  и  переходит  из  трофо-  в 

идиофазу.  Иными  словами,  несмотря  на  потенциальную  способность 

тормозить  синтез  белка,  накопившийся  антибиотик  не  способен  причинить 

 

100

вред своим клеткам, в которых синтез белка уже почти прекратился. Другие 

причины,  наблюдаемые  на  примере  некоторых  групп  антибиотиков - 

ингибиторов  белкового  синтеза,  носят  более  частный  характер.  Так 

исследования  с  антибиотиками - аминогликозидами  на  примере  наиболее 

подробно  изученного  неомицина  (продуцент Actinomyces fridae) показали, 

что  в  процессе  или  после  сборки  молекулы  антибиотика,  он  подвергается 

временной  обратимой  инактивации.  Рибосомы  продуцента  неомицина,  как 

показывают  опыты  с  бесклеточной  белок-синтезирующей  системой, 

чувствительны  к  антибиотику.  Соответственно,  возникает  вопрос  о 

совмещении  в  одной  и  той  же  клетке  эндогенного  ингибитора  (каковым  в 

данном  случае  является  неомицин)  с  работающими  рибосомами.  Частично 

ответить 

на 

этот 

вопрос 

можно 

исходя 

из 

вышеуказанной 

общефизиологической 

закономерности, 

характеризующей 

биосинтез 

антибиотиков - максимум биосинтеза антибиотика не совпадает по времени с 

максимальной  скоростью  синтеза  белка  (цикл  развития  культуры  уже 

завершен).  В  тоже  время  существует  и  специфический  механизм  защиты 

клетки  продуцента  от  неомицина,  который  может  быть  обратимо 

инактивирован  за  счет  фосфорилирования  одной  из  многочисленных  в 

аминогликозидной структуре амино- или гидроксильных групп. Источником 

переносимого  на  антибиотик  фосфатного  остатка  является  АТФ. 

Обратимость инактивации обусловлена существованием в клетке продуцента 

локализованной  в  клеточной  мембране  щелочной  фосфатазы.  Этот  фермент 

на  последнем  этапе  выброса  антибиотика  в  среду  осуществляет  его 

реактивацию,  то  есть  дефосфорилирование.  После  дефосфорилирования 

антибиотик,  уже  в  активном  состоянии,  направляется  в  среду  в  силу 

односторонней проницаемости мембраны. Причем, иногда реактивирующий 

фермент  не  справляется  со  своими  функциями  и  в  среду  антибиотик 

выделяется  в  неактивном  виде.  Если  его  сконцентрировать  и  обработать 

щелочной  фосфатазой,  может  быть  получено  дополнительное  количество 

 

101

антибиотика  из  казалось  бы  неактивной  культуральной  жидкости.  Интерес 

представляет  тот  факт,  что  ген  форфорилирующего  фермента  находится  в 

кластере  генов  биосинтеза  неомицина,  что  наглядно  показывает 

генетическую  близость  защитной  аминокликозид  фосфотрансферазы  у 

продуцента  с  ферментами  биосинтеза  аминогликозида,  то  есть  подчинение 

функций  генов  кластера  единой  цели - образованию  антибиотика 

эффективного  против  микроорганизмов-конкурентов,  но  безвредного  для 

своего  продуцента.  Однако,  помимо  защитной  функции  фосфотрансфераза 

может  воздействовать  и  на  фрагменты  собираемой  аминогликозидной 

молекулы,  активируя  их,  то  есть  выполнять  двойную  функцию  (при 

биосинтезе  и  как  фактор  защиты  от  суицидного  агента).  Кроме 

фосфорилирования-дефосфорилирования  существуют  и  другие  механизмы 

инактивации - реактивации  аминогликозидов,  например,  ацетилирование - 

деацетилирование.  

Защита  от  собственных  антибиотиков,  у  актиномицетов  (продуцентов 

макролидных структур - прежде всего эритромицина) обусловлена наличием 

в  клетке  специфической  метилазы,  метилирующей  определенный 

адениновый  остаток  в 23S рибосомальной  РНК.  В  результате 50S 

субъединица рибосомы продуцента эритромицина имеет конфигурацию, при 

которой  реагирование  антибиотика  с  пептидилтрансферазным  центром 

рибосомы,  как  это  происходит  в  случае  эубактерий,  невозможно.  Иными 

словами,  белковый  синтез  у  продуцента  специфически  защищен  от 

собственного  антибиотика  и  это  происходит  помимо  неспецифической 

защиты на физиологическом уровне.  

Механизмы  защиты  клетки  у  продуцентов  тетрациклинов  изучены  мало. 

Проводить 

аналогию 

с 

изученными 

механизмами 

тетрациклинорезистентности у патогенных бактерий довольно трудно. 

Для  характеристики  системы  защиты  продуцента  от  некоторых 

циклопептидных мембранотропных антибиотиков (например, грамицидин С) 

 

102

используется  термин  «компартментация».  Место  биосинтеза  этого 

антибиотика изолировано от чувствительных к нему метаболических реакций 

продуцирующей  его  клетки.  Молекула  антибиотика  (ее  углеродный  скелет) 

собирается 

в 

мультиферментных 

комплексах, 

обеспечивающих 

упорядоченную  последовательность  реакций  сборки.  Взаиморасположение 

ферментов в комплексе координируется за счет дисульфидных и водородных 

связей.  Мультиферментные  комплексы  локализуются  на  периферии  клетки 

продуцента.  Также,  компартментация  играет  роль  в  защите  клеток 

продуцентов  (как  правило,  это  актиномицеты)  в  случае  образования  ими 

ДНК-тропных 

антибиотиков 

(последние 

находят 

применение 

в 

онкологической  клинике).  В  то  же  время  антибиотики  семейства 

рифамицинов, ингибируя синтез РНК в клетках путем взаимодействия с РНК 

полимеразой,  не  действуют  на  синтез  РНК  в  клетке  своего  собственного 

продуцента. 

Интересным  представляется  то  обстоятельство,  что  проблема  защиты 

продуцента  от  потенциального  суицидного  агента  отсутствует  в  случае 

продуцента  пенициллина Penicillium chrysogenum, причем  даже  при 

повышении продуктивности штамма гриба во много тысяч раз. Пенициллин 

проявляет  антимикробный  эффект,  подавляя  синтез  пептидогликана 

клеточной  стенки  бактерий.  У  грибов – пептидогликана,  как  полимера 

клеточной  стенки,  нет.  Соответственно,  у  них  нет  и  фермента  синтеза 

пептидогликана,  а  именно D-аланин-транспептидазы,  который  является 

мишенью действия пенициллина при его контакте с бактериальной клеткой. 

Контрольные вопросы к главе 3 

 

1.  Каково  влияние  механизма  ретроингибирования  на  выход  конечных 

продуктов биосинтеза лекарственных средств? 

2.  Какое влияние оказывает изменение содержания  источников углерода, 

азота и фосфора в питательной среде на биосинтез антибиотиков? 

 

103

3.  Каковы механизмы регуляции экспрессии генов и их использование  в 

биотехнологических процессах? 

4.  Какова  роль  системы  регуляции  метаболизма,  обусловленной 

гуанозинтетрафосфатом в биосинтезе целевых  продуктов? 

5.  Какую  роль  играет  катаболитная  репрессия  в  биосинтезе 

лекарственных средств? 

6.  Что  представляют  собой  мутанты  с  измененной  регуляцией  азотного 

метаболизма  и  каковы  возможности  интенсификации  биосинтеза  ряда 

первичных, вторичных метаболитов и некоторых ферментов? 

7.  Что  такое  системы  внутриклеточного  транспорта  и  секреции 

биотехнологических продуктов у микроорганизмов? 

8.  Каковы  механизмы  защиты  клетки,  если  она  выступает  как 

«суперпродуцент»? 

9.  Как  можно  сохранить  активность  промышленных    штаммов 

микроорганизмов? 

10. Как осуществляется перенос вещества через мембраны клетки?

 

 

Глава 4.   Основные этапы биотехнологического процесса 

4.1.   Общая характеристика 

   Процесс биотехнологического  производства фармацевтических препаратов 

состоит  из  определенного  количества  составляющих  (рис.9)  и  имеет 

различную  степень  сложности.  Его  сложность  обусловлена  слагаемыми 

конкретного  биотехнологического  процесса,  которые  варьируют  в 

зависимости  от  продуцента,  то  есть,  биообъекта  (микроорганизм,  растение, 

млекопитающее  и  др.)  и  зависит  от  целевого  конечного  продукта.  Если 

целевым    продуктом  является  биомасса  (например,  живые  клетки 

молочнокислых  бактерий),  то  технологическая  линия  короче;  если - это 

субстрат для производства высокоочищенных инъекционных препаратов,  то  

схема производства сложнее (технологическая линия длиннее).  

 

104

 

 

 
 
 

 
 
                
 
 
 
 
 

 
                                             
 

  

                                                                     
                                                                                           
 
 
                     
 
 
 

 
                                                                            
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
Рис. 9.                Общая схема биотехнологического производства

 

исходное сырьё 

энергетические
  ресурсы 

 

реализованный
  труд

 

Биообъект

 

процессы и аппараты

   

Биосинтез 

(ферментация)

побочные продукты

 

отходы производства

токсичные 
метаболиты 

нетоксичные 
метаболиты

отходы для 
утилизации

отходы для 
уничтожения

Выделение и очистка БАВ 

 

            Лекарственные средства  
(приготовление лекарственной формы)

 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  11  12  13  14   ..