Курс лекций по биотехнологии - часть 12

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  10  11  12  13   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 12

 

 

 

89

ферментов,  активность  которых  должна  быть  ограничена.  Если  же  целевым 

продуктом  является  циклопептид,  и  тем  более,  если  часть  его 

аминокислотных  остатков  находится  в D-форме,  как,  например,  у  широко 

известного 

иммунодепрессанта 

циклоспорина 

А, 

опасность 

внутриклеточного  протеолитического  расщепления  резко  падает  и  в  этом 

случае  большое  значение  будет  иметь  «позитивный»  эффект  гуанозин 

тетрафосфата - активация оперонов некоторых аминокислот. 

Естественно,  что  для  того  чтобы  воспользоваться  механизмами 

внутриклеточной  регуляции  для  производственных  целей,  необходимо  их 

знание  на  генетическом,  биохимическом  и  физиологическом  уровнях. 

Одновременно,  необходимо  знание  видовых  особенностей  продуцента  и 

особенностей его штамма. Но даже при наличии последних, прогнозировать 

конечный  результат  при  вмешательстве  в  регуляционные  процессы, 

учитывая их многочисленность и взаимозависимость, очень и очень сложно. 

Поэтому, несмотря на быстрые успехи фундаментальных наук, подбор сред и 

условий ферментации все еще нередко носит эмпирический характер. 

3.4.  Регуляция усвоения азотосодержащих соединений 

Известно,  что  в  структуре  земной  атмосферы  в  количественном  отношении 

явно  доминирует  азот,  однако  эволюция  жизни  на  земле  не  пошла  путем 

прямого  усвоения  его  клетками  млекопитающих,  растений  и  большинства 

микроорганизмов.  Азот  воздуха  могут  использовать  только  клубеньковые 

бактерии,  развивающиеся  в  ризосфере  бобовых  растений  и  некоторые 

свободно  живущие  азотфиксаторы,  что,  в  свою  очередь,  обусловливает 

появление в почве аммонийных солей и окислов азота. 

Многие  микроорганизмы  усваивают  органические соединения азота, однако 

из  широкого  многообразия  таких  соединений,  наиболее  легко  и  быстро 

микроорганизмами усваиваются такие соли, как аммония хлорид и аммония 

сульфат.  

 

90

Центральными  реакциями  метаболизма  при  синтезе  азотосодержащих 

веществ  являются  реакции  с  участием  доноров  аминогрупп:  глутамата, 

глутамина и аспартата, которые приводятся ниже.  

1. Глутамат +NH

3

+ATФ                           Глутамин + АДФ + Ф  

2. Глутамин + α-кетоглутарат + НАДФН          2 глутамат + НАДФН

+

 

3. Глутамат + оксалоацетат                                аспартат + α-кетоглутарат  

Ф – фосфор неорганический.  

На примере глутаминсинтетазы - важнейшего, начального фермента азотного 

метаболизма,  катализирующего  переход  аммиака  в  амидную  группу (1-ая 

реакция),  можно  показать  всю  сложность  регуляторных  взаимодействий  в 

сильно  разветвленном  метаболическом  пути.  Амидная  группа  глутамина 

является  источником  азота  при  биосинтезе  шести  соединений:  двух 

ароматических аминокислот: триптофана и гистидина, а также: АМФ, ЦТФ, 

глюкозамина - 6-фосфата  и  карбамоилфосфата.  В  опытах  на  клетках 

микроорганизма Escherichia coli показано,  что  любой  из  конечных 

метаболитов,  находясь  в  насыщающей  концентрации  (имеются  в  виду 

потребности 

микроорганизма) 

может 

действовать 

по 

принципу 

ретроингибирования.  Однако  вызываемое  при  этом  ингибирование  является 

неполным.  Вместе  с  тем,  при  росте  числа  метаболитов  (в  насыщающей 

концентрации)  проявляется  аддитивность,  то  есть  ингибирование  фермента 

усиливается  почти  до  полного  исчезновения  его  активности,  что  получило 

название  кумулятивного  ретроингибирования.  Также  установлено,  что  все 

метаболиты-ингибиторы  глутаминсинтетазы  связываются  с  ферментом  в 

своем определенном месте. Таким образом, при связывании они не мешают 

друг  другу,  что  имеет  принципиальное  значение  для  регуляции  активности 

глутаминсинтетазы.  

Существует,  однако,  и  другой  механизм  регуляции  этого  сложного, 

состоящего  из 12-ти  субъединиц  (молекулярная  масса 12000 дальтон  у 

каждой),  фермента.  С  одной  стороны,  если  культура  микроорганизма 

 

91

оказывается  в  среде  крайне  бедной  источниками  углерода  и  энергии,  но  с 

избытком  ионов  аммония  и  глутамина,  то  активность  глутаминсинтетазы 

резко  снижается  за  счет  более  радикального  механизма.  Каждая  из 12-ти 

субъединиц  аденилируется,  ковалентно  связывая  по  одному  остатку  АМФ. 

Активность  фермента  практически  полностью  исчезает,  что  является 

благоприятным  фактором  для  выживания  микроорганизма.  С  другой 

стороны,  при  переносе  микроорганизма  на  среду  обедненную  легко 

усваиваемым  источником  азота,  глутаминсинтетаза  деаденилируется  и 

«мобилизует»  свою  активность.  Следует  отметить,  что  у  некоторых 

микроорганизмов система регуляции глутаминсинтетазы усложняется за счет 

того,  что  этот  фермент  существует  в  двух  изоформах:  в  случае  одной 

изоформы - в  систему  регуляции  включается  аденилирование - 

деаденилирование,  в  случае  другой - обратимая  избытком  аммиака 

инактивация. 

Наряду  с  вышеперечисленными  механизмами  регуляции  активности 

глутаминсинтетазы, существует  также  еще  один  механизм внутриклеточной 

регуляции,  позволяющий  некоторым  микроорганизмам  бороться  с 

недостатком  азота  в  питательной  среде  за  счет  усиления  экспрессии  гена 

глутаминсинтетазы. 

Ферменты,  участвующие  в  усвоении  азотосодержащих  соединений  в 

большинстве случаев индуцибельны и подвержены закономерностям азотной 

репрессии,  которая  проявляется  после  превращения  этих  соединений  в 

глутамин.  Далее,  следует  отметить,  что  для  синтеза  глицина  и  аланина,  α-

аминогруппа  глутамина  реализуется  при  участии  трансаминаз.  При  этом 

степень обеспеченности клетки азотом определяется соотношением глутамин 

/  α-кетоглутарат.  Также  на  разных  клетках  эукариот  было  показано,  что 

дефицит  источников  углерода  и  энергии  в  питательной  среде  ведет  к 

заметной  протеолитической  деградации  ферментов,  включенных  в 

использование азотосодержащих соединений. 

 

92

Регуляция  усвоения  азотосодержащих соединений у  эукариот, прежде всего 

грибов  включая  дрожжи,  имеет  много  общего  с  прокариотами,  хотя  есть  и 

отличия.  Например,  для  грибов  предпочтительнее  использовать  в  качестве 

источника азота соли аммония и глутамин.  

В  задачи  биотехнолога  входит  интенсификация  реакций  биосинтеза 

глутамина,  глутамата  и  аспартата,  что  достигается  генетическими  методами 

или  подбором  питательных  сред.  При  получении  ряда  первичных 

метаболитов,  предшественниками  которых  и  являются  указанные  вещества, 

интенсификация 

этих 

реакций 

благоприятно 

сказывается 

на 

производственных  процессах.  Известно,  что  первичные  метаболиты 

составляют основу разнообразных классов лекарственных агентов. Вместе с 

тем,  так  как  вторичные  метаболиты,  как  правило,  являются  модификацией 

первичных,  то  интенсификация  биосинтеза  последних,  соответственно, 

положительно  сказывается  и  на  биосинтезе  вторичных  метаболитов, 

например,  многих  антибиотиков,  особенно  тех,  в  структуру  которых  входят 

пептиды. 

3.5.    Катаболитная репрессия в создании и производстве лекарственных 

средств. 

Быстро  усваиваемые  источники  углерода  и  энергии,  прежде  всего  глюкоза, 

вызывают значительное и быстрое накопление биомассы у микроорганизмов. 

Однако,  биосинтез  многих  целевых  продуктов  биотехнологического 

производства,  таких  как  вторичные  метаболиты  и  ряд  ферментов,  при  этом 

резко снижается. Явление, вначале называвшееся «глюкозным эффектом», в 

дальнейшем получило название катаболитной репрессии. 

Применительно  к  этому  явлению  введено  понятие  транзиентной  репрессии, 

когда при внесении глюкозы в микробную культуру растущую на источнике 

углерода  и  энергии,  который  ассимилируется  медленнее  глюкозы, 

происходит  временное,  но  резкое  подавление  синтеза  соответствующего 

катаболического  фермента.  Позднее,  поскольку  в  среде  присутствует 

 

93

глюкоза,  фермент  снова  начинает  синтезироваться,  но  с  невысокой 

скоростью. 

Другое  понятие,  которым  оперируют  применительно  к  катаболитной 

репрессии - исключение  индуктора.  Глюкоза  предотвращает  поступление 

индуктора (менее эффективно используемого субстрата) в клетку. Еще одно 

понятие - катаболитное  ингибирование,  которое  относится  к  подавлению 

активности ряда ферментов продуктами быстрого катаболизма глюкозы. 

Установлено,  что  катаболитная  репрессия  наступает  в  результате  быстрого 

снижения  в  клетках  содержания  циклического 3,5 -аденозинмонофосфата 

(цАМФ) под влиянием внесения глюкозы в среду. И, наоборот, при удалении 

глюкозы  из  среды - количество  цАМФ  в  клетках  увеличивается.  Поскольку 

образование  цАМФ  из  АТФ  катализируется  ферментом  аденилатциклазой, 

поэтому  для  того,  чтобы  изменить  активность  этого  фермента,  необходимо 

получить мутации в гене, кодирующем данный фермент.  

Катаболитная  репрессия - неблагоприятное  явление,  с  которым  приходится 

считаться биотехнологам, работающим в антибиотической промышленности, 

при  получении  методом  микробиологического  синтеза  ферментов 

медицинского  назначения, некоторых  рекомбинантных белков. Несмотря  на 

обилие  накопленных  фактов,  связь  катаболитной  репрессии  со  многими 

метаболическими процессами, в частности, транспортом углеводов в клетку 

и экскрекцией их из клетки, до конца не изучена. Поэтому, помимо подбора 

сред  с  ограниченным  содержанием  глюкозы,  много  внимания  уделяется 

работе  с  продуцентами,  когда,  используя  методы  мутагенеза,  селекции  и 

генетической  инженерии - получают  мутанты,  нечувствительные  к 

катаболитной репрессии. 

3.6.   Транспорт  веществ  через  мембранные  структуры  клетки  и  его 

регуляция. 

Наиболее  общим  компонентом  клеточной  оболочки,  присущим  клеткам 

микроорганизмов,  растений  и  животных  является  цитоплазматическая 

 

94

мембрана - двухслойная  фосфолипидная  субклеточная  структура  с 

включенными  в  нее,  разнообразными  по  функциям,  белками.  У 

микроорганизмов  (как  и  у  растений)  над  цитоплазматической  мембраной 

клетки  располагается  клеточная  стенка,  представляющая  собой  жесткий 

полимер, состоящий из целлюлозы - у высших растений; из пептидогликана - 

у  эубактерий  и  актиномицетов;  из  слоев  хитина,  глюкана  и  маннопротеина, 

(то есть разных полимеров) - у грибов. 

У  грамотрицательных  бактерий  помимо  цитоплазматической  мембраны 

имеется и другая мембрана, называемая внешней, так как она располагается 

над  клеточной  стенкой.  Внешняя  мембрана  имеет  иную  структуру,  чем 

цитоплазматическая,  которую  в  случае  наличия  внешней  мембраны 

называют  внутренней.  Внешняя  мембрана  асимметрична - ее  наружная 

поверхность,  то  есть  обращенная  в  среду,  состоит  в  основном  из 

липополисахаридов,  молекулы  которых  координируются  ионами  магния; 

поверхность,  обращенная  к  клеточной  стенке  состоит  из  фосфолипидов. 

Внешнюю  мембрану  пересекают  белки-порины.  Их  тримеры  формируют 

через нее сквозные водные каналы.  

Пространство между внешней и внутренней мембраной, в котором находится 

клеточная стенка имеет структуру геля и называется периплазматическим. 

Животные  клетки  имеют  только  цитоплазматическую  мембрану.  Так  как 

цитоплазматическая  мембрана  присуща  всем  клеткам,  то  из  этого  следует, 

что  системы  регуляции  транспорта  из  среды  в  клетку,  необходимых  клетке 

веществ  и  системы  выброса  ненужных  веществ  из  клетки  в  среду, 

обязательно связаны с цитоплазматической мембраной. Клеточная стенка не 

играет существенной роли ни в транспорте низкомолекулярных метаболитов, 

ни 

в 

регуляции 

этого 

процесса. 

Однако, 

внешняя 

мембрана 

грамотрицательных  бактерий  и  особенно  периплазматическое  пространство 

содержит  ряд  ферментов,  участвующих  в  процессах  транспорта 

низкомолекулярных соединений.  

 

95

Процессы  транспорта  через  клеточную  оболочку  дифференцируются  на  три 

категории:  пассивная  диффузия,  облегченная  диффузия  и  активный 

транспорт.  

          Путем  пассивной  диффузии,  то  есть  в  соответствии  с  градиентом 

концентрации,  когда  в  среде  концентрация  выше,  чем  внутри  клетки - в 

клетку проникают вода, углеводороды, молекулы таких газов как О

2

, N

2

, Н

2

 

В  случае  облегченной  диффузии  необходимые  клетке  вещества 

переносятся из среды в клетку с помощью пермеаз - особого класса белков, 

содержащихся в мембране. Переносимое вещество реагирует с пермеазой на 

наружной  стороне  мембраны  и  освобождается  после  переноса  через 

мембрану внутри клетки. При облегченной диффузии проникающее в клетку 

вещество продвигается по градиенту концентрации. Затраты энергии на этот 

процесс не требуется, также как и при пассивной диффузии.  

 

При  активном  транспорте  вещества  в  клетку,  требующем  затраты 

энергии,  движение  переносимого  вещества  может  происходить  против 

градиента  концентрации.  При  этом  концентрация  накапливающегося  в 

клетке  соединения  может  превзойти  его  концентрацию  в  среде  сотни  и 

тысячи  раз.  Это  связано  с  тем,  что  мембранный  переносчик 

высокоспецифичен  к  переносимому  им  субстрату,  когда  он  обращен  к 

наружной  поверхности  мембраны;  а  когда  он  обращен  внутрь  клетки - 

сродство  резко  снижается  в  результате  диссоциации  субстрата  и 

переносчика.  Если  энергодающие  реакции  блокируются,  например, 

ферментными  ядами,  реагирующими  с  функциональными  группами 

белковой 

части 

ферментов, 

то 

активный 

транспорт 

в 

клетку 

низкомолекулярных  веществ  прекращается.  Источником  энергии  для 

активного 

транспорта 

очень 

часто 

является 

трансмембранный 

электрохимический  потенциал  ионов  водорода.  Переносчики,  имеющие 

места  связывания  протонов  и  молекул  субстрата,  используют  мембранный 

потенциал  (протон  движущую  силу)  для  переноса  внутрь  клетки  ионов 

 

96

водорода  и  питательных  веществ.  Переносчик,  связавшись  с  протоном, 

повышает  свое  сродство  к  субстрату.  Освободившись  от  протона  на 

поверхности  мембраны,  обращенной  внутрь  клетки,  переносчик  снижает 

сродство к субстрату. Таким образом, фактически здесь происходит перенос 

двух  субстратов  в  одном  направлении.  Подобного  рода  транспорт  получил 

название  симпорта.  Если  переносчик  осуществляет  перенос  только  одного 

субстрата,  используется  термин  унипорт.  Наконец,  механизм  транспорта 

одним  и  тем  же  переносчиком  двух  субстратов,  но  в  противоположных 

направлениях именуется антипортом. 

АТФ-зависимые системы активного транспорта используют энергию АТФ. В 

такие  системы  входят  расположенные  в  периплазматическом  пространстве 

белки с высоким сродством к ряду метаболитов, принадлежащим к пептидам, 

аминокислотам,  сахарам  и  др.  Они  препятствуют  выходу  в  среду  ряда 

метаболитов  из  цитоплазмы.  С  их  помощью  в  периплазматическом 

пространстве  накапливаются  определенные  питательные  соединения  из 

среды.  Также,  говоря  об  активном  транспорте  веществ  в  клетку,  нельзя  не 

упомянуть о системах транслокации (переноса) групп. Их функционирование 

приводит  к  транспорту  в  клетку,  например,  углеводов  в  виде  фосфатных 

эфиров.  При  этом  их  внутриклеточная  концентрация  оказывается  гораздо 

выше, чем в среде. 

Фосфотрансферазы, участвующие в работе таких систем, инициируют и ряд 

других  реакций  в  клетке.  Вообще  транспорт  многих  субстратов  в  клетку 

подвержен  регуляции  как  на  уровне  биосинтеза  компонентов  этих  систем, 

так  и  на  уровне  функциональной  активности  уже  синтезированных 

компонентов. 

 

Самостоятельный  интерес  представляет  освобождение  клетки  от 

избыточных  продуктов  метаболизма  путем  их  выведения,  в  частности, 

защитных  ферментов,  антибиотиков  и  экзоферментов,  позволяющих 

утилизировать  находящиеся  в  среде  полимеры.  Низкомолекулярные 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  10  11  12  13   ..