Курс лекций по биотехнологии - часть 11

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  9  10  11  12   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 11

 

 

 

81

Одновременно авторами концепции была разработана и «модель оперона», в 

соответствии  с  которой  в  систему  регуляции  синтеза  ферментов  на 

генетическом  уровне  входит  несколько  компонентов.  Первым  следует 

назвать  структурный  ген  (собственный  ген),  кодирующий  структуру 

ферментного  белка;  иногда  это  могут  быть  несколько  последовательно 

расположенных  структурных  генов,  которые  кодируют  участвующие  в 

общем  метаболическом  процессе  ферменты.  В  опероне  структурному  гену 

предшествует  участок  ДНК,  именуемый  оператором, который  контролирует 

работу  структурных  генов.  Именно  с  этим  участком  связывается  белок-

репрессор, структуру которого определяет ген-регулятор. Сам ген-регулятор 

локализован  вне  оперона  и  может  находиться  даже  в  другой  хромосоме, 

например, если это - клетка эукариота. Принципиально важным является то 

обстоятельство,  что  оператор  располагается  между  участком,  именуемым 

промотором и структурным геном. Молекула РНК-полимеразы «садится» на 

промоторный участок для того, чтобы затем двигаться по структурному гену, 

транскрибируя  (переписывая  его  последовательность)  в  информационную 

РНК.  Последняя  служит  в  рибосомной  системе  матрицей  для  конкретного 

белка.  Если  на  операторном  участке  находится  белок-репрессор,  движение 

РНК-полимеразы тормозится и тогда структурный ген (или последовательно 

расположенные  структурные  гены)  не  считывается.  Возникает  явление 

репрессии.  Для  того,  чтобы  репрессия  сменилась  индукцией,  белок-

репрессор  должен  быть  убран  с  операторного  участка.  Тогда  РНК-

полимераза получает возможность двигаться с промотора через этот участок, 

а затем - по структурному гену (или нескольким структурным генам). 

Удаление  репрессора  осуществляется  путем  инактивации  репрессора 

индуктором.  Вместе  с  тем  индукцию  можно  рассматривать  и  как 

предотвращение связывания репрессора с оператором. 

В  целом  механизмы  индукции  и  репрессии  синтеза  ферментов  сложны  и 

разнообразны. Здесь важно знать, что использование механизмов индукции и 

 

82

репрессии  синтеза  ферментов  помогает  биотехнологам  в  решении  самых 

различных  задач,  например,  позволяет  поддерживать  оптимальный  уровень 

ферментных  систем  клетки,  включенных  в  биосинтез  целевого  продукта  и 

корректировать  его  в  течение  всего  цикла  ферментации.  Представляет 

интерес конструирование продуцентов - рекомбинантов, активность которых  

повышается  за  счет  использования  явления  индукции.  Например,  в  геноме 

микроорганизма - кишечной палочки создается оперон с общим промотором 

и  операторным  участком  для  двух  структурных  генов:  гена  индуцибельной 

бетагалактозидазы  и  расположенного  за  ним  гена  цепи  А  или  гена  цепи  В 

человеческого  инсулина.  Продуцент - рекомбинант  культивируется  на 

ферментационной  среде  с  лактозой,  утилизация  которой  требует  быстрого 

синтеза бетагалактозидазы. Образующаяся (быстро и в большом количестве) 

аминокислотная 

последовательность 

вначале 

соответствует 

бетагалактозидазе, а затем цепи А (или цепи В) инсулина. После выделения 

этого  гибридного  белка  фрагмент  инсулина  отделяют  от  фермента  и 

используют для построения полной молекулы гормона. 

3.2.    Ретроингибирование и преодоление этого явления  

Метаболические  пути,  ведущие  к  синтезу  в  клетке  низкомолекулярных 

соединений - как  первичных,  так  и  вторичных  метаболитов,  включают,  как 

правило,  по  нескольку  ферментов,  участвующих  в  сборке  углеродного 

скелета метаболита.  

Перечень метаболитов и их соотношение во внутриклеточном фонде - строго 

сбалансированы,  но  в  случае  изменения  условий  культивирования  клетки, 

эти  параметры  будут  меняться  на  разных  циклах  развития  клетки.  Все  это 

соответствует  интересам  клетки,  но  не  всегда  совпадает  с  интересами  и 

целями  биотехнолога,  в  соответствии  с  которыми  необходимо  добиться 

максимального синтеза конкретного метаболита. Иногда этот метаболит сам 

по  себе  является  целевым  продуктом,  иногда - его  предшественником.  Для 

того  чтобы  добиться  поставленной  цели,  следует  преодолеть  тот  механизм 

 

83

внутриклеточной  регуляции,  который  препятствует  работе  продуцента  в 

интересах  биотехнолога.  Таким  выработанным  эволюцией  механизмом 

является  ретроингибирование,  то  есть  подавление  конечным  продуктом 

активности первого фермента метаболического процесса. 

Анализируя  явление  ретроингибирования,  можно  сказать,  что  эволюция 

привела к логическому решению жизненно необходимой для клетки задачи. 

Например,  как  только  концентрация  конечного  метаболита  становится 

достаточной  для  удовлетворения  нужд  клетки,  метаболит  начинает 

отрицательно  влиять  на  свой  собственный  биосинтез.  В  результате, 

подавляется  активность  первого  фермента,  что  влечет  за  собой  не  только 

прекращение образования данного метаболита, но и всех его промежуточных 

предшественников. 

Таким  образом,  данный  механизм  регуляции  срабатывает  очень  четко:  если 

клетке  в  данный  момент  конечный  метаболит  не  нужен,  то  не  нужны  и  его 

предшественники.  Поскольку  конечный  метаболит  уже  прекратил  свое 

образование,  но,  однако  продолжает  расходоваться,  то,  естественно, 

концентрация  его  в  клетке  понижается.  Как  только  она  достигает 

соответствующего  нижнего  предела,  синтез  метаболита  быстро  начинается 

вновь. Это объясняется тем, что как ингибитор своего биосинтеза,  метаболит 

взаимодействует  (за  счет  водородных  связей)  с  аллостерическим  центром 

начального  фермента  метаболической  цепочки.  Поэтому  фермент  сохраняет 

потенциальную способность вновь быстро перейти в активное состояние, что 

и  происходит  после  освобождения  аллостерического  центра  от  ингибитора, 

вследствие понижения его концентрации.  

Биотехнолог  может  преодолеть  механизм  ретроингибирования  и  заставить 

клетку непрерывно нарабатывать метаболит. Во-первых, можно непрерывно 

удалять  образующийся  метаболит  из  питательной  среды  и,  таким  образом, 

снижать  его  внутриклеточную  концентрацию.  Это  достигается  внесением  в 

среду  сорбента:  концентрация  растворенного  метаболита  (целевого 

 

84

продукта)  снижается    и  механизм  ретроингибирования  не  включается.  Во-

вторых,  можно  использовать  генноинженерные  методы,  а  именно, 

сконструировать  продуцент  с  мутацией  в  аллостерическом  центре 

начального  фермента  метаболической  цепочки.  При  этом  изменения  в 

конформации  аллостерического  центра  должны  не  меняться  под  действием 

ингибитора.  В  этом  случае  ретроингибирование  уже  не  будет  ограничивать 

синтез данного метаболита. В-третьих, необходим специальный контроль за 

составом сред, используемых при ферментации; а именно, в них должно быть 

ограничено  количество  метаболита  (целевого  продукта).  Это  предотвратит 

возможность  его  отрицательного  влияния  на  его  собственный  биосинтез  в 

клетках продуцента.  

Весьма демонстративным примером здесь являются неудачи при биосинтезе 

пенициллина  (продуцент Penicillium chrysogenum) на  комплексной  среде 

богатой аминокислотой лизином, которая используется в качестве добавки к 

некоторым дешевым и недефицитным комплексным средам. Лизин является 

первичным 

метаболитом, 

пенициллин - вторичным. 

Одним 

из 

предшественников  лизина  является  аминоадипиновая  кислота,  входящая  в 

состав  так  называемого LLD-трипептида,  из  которого  в  результате  ряда 

последующих реакций формируется молекула пенициллина. Поэтому лизин, 

подавляя  собственный  биосинтез  по  механизму  ретроингибирования, 

одновременно  подавляет  и  биосинтез  аминоадипиновой  кислоты,  а 

следовательно  и  пенициллина  (рис.8).  Таким  образом,  для  биотехнологов 

работающих  в  антибиотической  промышленности  возникает  актуальная 

задача  по  подбору  сред  с  ограниченным  количеством  лизина  или  создания 

производственных  штаммов Penicillium chrysogenum с  нарушенным 

механизмом ретроингибирования по лизину. 

 

85

  

 

Ф

1

 – начальный фермент метаболической цепочки 

Ф – фермент включенный в метаболическую цепочку 
1,2,3 – предшественники аминоадипиновой кислоты 
 

Рис. 8.                Схема подавления лизином образования пенициллина 

 
 
 

Экзогенный лизин в 
питательной среде 

Лизин в клетке

Пенициллин

Белки 

Аминоадипиновая 

кислота

        

3

  

        

        

Ф

Ф

Ф

Ф

 

86

3.3.   Строгий аминокислотный контроль метаболизма микроорганизмов 

и его  значение при получении лекарственных средств      

С  одной  стороны,  структура  многих  лекарственных  препаратов  включает 

модификации  отдельных  аминокислот.  С  другой  стороны,  эти  препараты 

можно  рассматривать,  как  производные  пуринов  и  пиримидинов,  то  есть 

азотистых оснований нуклеиновых кислот. 

Следует  отметить,  что  все  чаще  в  биотехнологическом  производстве 

используются  сконструированные  методами  генетической  инженерии 

микроорганизмы - рекомбинанты,  продуцирующие  видоспецифические  для 

человека белки, играющие роль биорегуляторов, факторов неспецифического 

иммунитета и т.д. 

Поэтому  при  биосинтезе  вышеперечисленных  лекарственных  препаратов 

биотехнологу  приходится  учитывать  явление,  так  называемого,  строгого 

аминокислотного  контроля  метаболизма  клетки  и  уметь  использовать  его  в 

своих целях. 

Строгий аминокислотный контроль метаболизма клетки позволяет ей быстро 

приспосабливаться к меняющимся внешним условиям: или выживать; или не 

только  выживать,  но  и  быстро  размножаться  (накапливать  биомассу 

культуры).  Строгий  аминокислотный  контроль  осуществляется  с  участием 

рибосомы,  но  уже  не  как  «машины»  для  синтеза  белка,  а  как  своеобразной 

«сенсорной  органеллы»  и  многофункционального  биорегулятора  гуанозин 

тетрафосфата,  играющего  здесь  ключевую  роль.  В  молекуле  этого,  образно 

говоря, «перефосфорилированного» гуанозина два гидроксила в рибозе – 5,-

ОН и 3,-ОН замещены дифосфатными остатками. 

Гуанозин  тетрафосфат  выполняет  принципиальную  роль  при  переключении 

метаболизма клетки, переносимой, например, с бедной питательной среды на 

богатую, и наоборот. 

Перенос  клеток  с  бедной  среды  на  богатую  обеспечивает  быстрый  рост 

культуры и быстрое накопление ее биомассы и, наоборот, перенос с богатой 

 

87

на бедную среду - приводит к условиям, когда не может поддерживаться ни 

быстрое 

размножение 

культуры, 

ни 

накопление 

биомассы. 

На 

биохимическом уровне при замене бедной среды на богатую в клетках уже в 

течение  нескольких  минут  резко  усиливается  синтез  рибосомальной  РНК, 

формируются  рибосомы  и  после  этого  возрастает  суммарный  синтез  белка. 

Растет биомасса, начинается быстрое деление клеток. С биологической точки 

зрения - это  целесообразно,  то  есть  соблюдается  нормальный  баланс 

макромолекул. 

При  переносе  клеток  с  богатой  среды  на  бедную - сразу  же  резко 

сокращается  синтез  РНК.  Прекращается  образование  рибосом,  а  затем  и 

синтез  белка.  Клетка  как  бы  «застывает»  в  покоящемся,  но  при  этом 

жизнеспособном состоянии и относительно благополучно переносит условия 

голодания: баланс макромолекул сохраняется на таком уровне, при котором 

хаотических  нарушений  метаболизма  не  происходит.  Это  обеспечивается 

именно  за  счет  механизма  строгого  аминокислотного  контроля.  На  бедной 

среде в рибосомно-матричную систему поступают молекулы не аминоацил т 

РНК,  а  «пустые»  или  не  загруженные  молекулы  т  РНК,  поскольку  среда 

бедная  и  аминокислот  во  внутриклеточном  фонде  клетки  начинает  не 

хватать. «Пустые»  молекулы  т  РНК  реагируют  с  акцепторным  местом, 

однако,  синтеза  полипептидной  цепи  не  происходит  и  синтез  белка 

прерывается. 

У  нормальных  клеток,  так  называемых Rel

+

  клеток  (имеющих  ген rel А), 

происходит  превращение  рибосомы  в  сенсорную  органеллу,  то  есть 

активируется ассоциированный с рибосомой белковый фактор (продукт гена 

rel  А) - фактор  строгого  «контроля»,  который  является  ферментом 

пирофосфат трансферазой. 

Как  уже  говорилось  выше,  гуанозин  тетрафосфат  может  функционировать 

как  биорегулятор.  Установлено,  что  он  связывается  с  РНК-полимеразой  и 

при  этом,  что  принципиально  важно,  по-разному  изменяет  ее  сродство  к 

 

88

промоторам различных генов. Экспрессия одних генов усиливается, других - 

подавляется.  Подавляются  гены,  включенные  в  синтез  рибосомной  РНК,  и 

как следствие - резкое падение количества РНК в клетке на бедной среде, а 

затем  и  количества  белков.  Наряду  с  «негативным»  контролем  гуанозин 

тетрафосфат  способен  и  к  «позитивному»  контролю,  в  рамках  которого 

активируются,  в  частности,  триптофановый,  гистидиновый,  треониновый 

опероны:  клетки  под  влиянием  голодания  по  аминокислотам,  используя 

гуанозин тетрафосфат, мобилизуют свои возможности синтеза аминокислот. 

Биотехнолог  обязательно  должен  учитывать  это  обстоятельство  при 

получении лекарственных агентов на основе аминокислот.  

Помимо  падения  синтеза  РНК  под  влиянием  гуанозин  тетрафосфата 

происходит  подавление  активности  некоторых  ферментов,  участвующих  в 

синтезе нуклеотидов, а также транспорте нуклеотидов в клетку. При этом в 

клетке не происходит образования не только рибосомальной РНК, но также 

уменьшается и содержание её предшественников. Иначе говоря, происходит 

координированное  многостороннее  изменение  клеточного  метаболизма, 

которое  имеет  приспособительный  характер.  Поэтому  роль  гуанозин 

тетрафосфата  в Rel

+

  клетках,  которые  биотехнолог  стремится  сделать 

сверхпродуцентами аминокислот, становится еще более «позитивной». 

С другой стороны, если целью биотехнолога является наработка нуклеотидов 

(пуринов  и  пиримидинов),  производными  которых  являются  многие 

лекарственные  агенты,  например,  противоопухолевые  антибиотики, - роль 

гуанозин  тетрафосфата  должна  рассматриваться  в  целом,  как  негативная.  В 

данном  случае  одним  из  подходов  к  решению  этого  вопроса  может  быть 

получение Rel

+

  клеток  продуцента  с  уменьшенным  количеством  фактора 

строгого аминокислотного контроля или полным его отсутствием. 

При  конструировании  микробных  продуцентов  чужеродного  белка  также 

необходимо  учитывать  роль  гуанозин  тетрафосфата.  Целевой  белок  должен 

быть  стабилен  и  не  подвергаться  в  клетке  действию  протеолитических 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  9  10  11  12   ..