Курс лекций по биотехнологии - часть 10

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  8  9  10  11   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 10

 

 

 

73

доклинических 

исследований 

генотерапия 

муковисцидоза 

была 

апробирована  в  клинике.  Нормальный  ген  в  составе  модифицированных 

аденовирусов  доставлялся  в  клетки  эпителия  легких  с  помощью  липосом. 

Однако, результаты генотерапии, в клинике оказались не столь блестящими. 

В  целом,  из  нескольких  сотен  случаев  только  отдельные  единичные  опыты 

оказались удачными. Тем не менее, сам по себе, переход от экспериментов в 

области  генотерапии  муковисцидоза  к  клинике  является  большим  успехом. 

По-видимому,  на  практике  генотерапия  муковисцидоза  будет  в  перспективе 

сочетаться  с  антибиотикотерапией  и  ферментотерапией,  которые  в 

настоящее время хотя и продлевают жизнь больного, но не ведут к полному 

излечению. 

 

Следует отметить, что генотерапия постепенно начинает привлекать к 

себе все большее внимание научно-популярных изданий и средств массовой 

информации.  К  настоящему  времени  несколько  десятков  технологий 

генотерапии различных заболеваний прошли апробацию на тысячах больных 

и добровольцах в США, Англии, Франции и других странах. В ряде клиник 

испытания прошли благополучно. Первая фаза клинических испытаний, как 

известно,  направлена  на  проверку  безопасности  нового  средства  (метода) 

лечения.  Имеются  сообщения  о  нескольких  случаях  возникновения 

лейкемиеподобных  заболеваний,  после  клинической  апробации  некоторых 

технологий  генотерапии.  Отмечается,  что  во  всех  таких  случаях 

использовались  векторы  на  основе  ретровирусов.  Сообщается  также    об 

отдельных    случаях,  когда  введенный  ген  экспрессировался  не  столь 

длительное  время  как  было  запланировано.  Однако,  несмотря  на  то,  что 

первые  испытания  в  клинике  прошли  менее  успешно,  чем  ожидалось  на 

основе  данных  доклинических  испытаний,  а  применение  некоторых  видов 

технологий  генотерапии  в  их  сегодняшнем  виде  временно  остановлено,  в 

целом – эти испытания продолжаются и  технологии совершенствуются. Тем 

более,  что  при  безнадежном  состоянии  больного  врач,  с  согласия  больного 

 

74

или по его требованию, может проводить испытания таких технологий, даже 

если при их доклинической апробации возникли определенные сомнения. 

2.2.2.   Антисмысловые олигонуклеотиды

Известно,  что  некоторые  как  наследственные,  так  и  не  наследственные 

заболевания, могут быть связаны не с дефицитом конкретного белка или его 

дефектом,  а,  наоборот,  с  гиперпродукцией  нормального  функционально 

активного белка. Отсюда следует задача частичного или полного подавления 

продукции    такого  белка  с  различной  вариабельностью.  Иначе  говоря, 

необходимо  избирательно  подавлять  экспрессию  гена,  кодирующего  этот 

белок,  или  подавлять  экспрессию  гена  фермента,  участвующего  в 

посттрансляционной  модификации  данного  белка  и  превращении  его  в 

активную  форму.  В  соответствии  с  этим    была  выдвинута  концепция 

создания  инновационных  лекарственных  средств,  получивших  общее 

название  антисмысловые  олигонуклеотиды.  Предполагается  получать 

комплементарную  для  ДНК  каждого  гена  (его  участка)  последовательность 

нуклеотидов,  которая  за  счет  водородных  связей  будет  реагировать  с  ДНК 

гена  или  с  информационной  РНК,  матрицей  для  которой  служит  указанная  

ДНК.  В  первом  случае,  подавление  образования  избыточного  белка  при 

связывании  с  геном    будет  происходить  на  стадии  транскрипции,  а    во 

втором, (при  связывании  с  информационной  РНК) - на  стадии  трансляции. 

Специфичность 

антисмысловой 

последовательности 

 

нуклеотидов, 

(избирательность  воздействия  на  выбранный  ген)  достигается    при  длине 

цепочки 15-20 нуклеотидов  (отсюда,  название  олигонуклеотиды).  Для 

реализации  идеи  использования  антисмысловых  олигонуклеотидов  как 

лекарственных средств, должен  быть преодолен ряд трудностей. Так, должна 

быть  решена  проблема  направленной  доставки  их  к  клеткам - мишеням  в 

организме человека. Также должна быть обеспечена защита антисмысловых  

олигонуклеотидов от расщепляющих их нуклеаз.  Предлагается модификация  

таких  нуклеотидов  в  соответствующих  лекарственных  препаратах, 

 

75

мешающая  воздействию  на  них  нуклеаз,  но  не  препятствующая 

реагированию с ДНК - или РНК-мишенью;  а также предлагается  «упаковка» 

этих нуклеотидов в липосомы и т.д.  

2.2.3.   Конформационные болезни. 

Обобщающее  название  «конформационные  болезни»  появилось  в  научной 

печати  в  самое  последнее  время.  Оно  может  охватывать  множество  еще  не 

описанных,  принципиально  новых  по  своей  природе,  заболеваний. 

Непосредственной  причиной  его  появления  в  литературе  стали  наблюдения 

над  необычными  инфекционными  заболеваниями,  как  у  животных,  так  и  у 

людей.  Возбудитель  передается  от  животных  человеку.  Болезнь  приводит  к 

неминуемому 

смертельному 

исходу. 

Гистопатологическая 

картина 

демонстрирует  губкообразное  состояние  серого  и/или  белого  вещества 

головного  мозга («трансмиссивная  губкообразная  энцефалопатия»).  Ввиду 

отсутствия  лекарственных  препаратов,  а  также  мер  борьбы  с  болезнью, 

названной 

«коровье 

бешенство», 

правительства 

разных 

стран 

ограничиваются  запрещением  вывоза  мясных  продуктов  из  определенного 

региона  и  уничтожением  зараженных  животных.  Случаи  заболевания 

человека  относительно  редки,  но  частота  появления  их  сильно  варьирует  в 

разных странах и местностях. 

Особый  интерес  вызывает  не  только  степень  опасности  болезни,  но  и 

принципиальная  новизна  относящихся  к  ней  молекулярно-биологических 

данных.  Исследования  последнего  времени  показали,  что  открыт  новый 

«мир»  не  известных  ранее  инфекций,  которые  назвали  «конформационные 

болезни».  Причем  рядом  авторов  подчеркивается,  что  все  что  известно  о 

конформационных  болезнях  к  настоящему  времени  может  быть  лишь 

«надводной частью айсберга». 

Вначале  это  заболевание  отнесли  к  вирусным  инфекциям,  однако,  вскоре 

выяснилось, что причиной болезни «скрепи» (scrapie) у  овец, которые были 

завезены  из  Германии  в  Исландию  для  развития  каракулеводства,  является 

 

76

инфекционный  агент,  не  содержащий  нуклеиновых  кислот,  что  полностью 

ломало привычные представления биологов и медиков. Сходное заболевание 

под названием «куру», при котором инфекционный агент также не содержит 

нуклеиновых  кислот,  было  обнаружено  у  жителей  некоторых  трудно 

доступных  местностей  Новой  Гвинеи  (племена  аборигенов,  не  потерявших 

обычаев каннибализма). 

К  настоящему  времени  известны  четыре  разновидности  болезни  со  столь 

необычным инфекционным агентом у людей (болезнь Крейцтфельдта-Якоба, 

куру 

и 

др.), 

а 

также 

несколько 

разновидностей 

у 

диких, 

сельскохозяйственных  и  домашних  животных.  Обнаружена  корреляция 

между  распространением  болезни  у  людей  и  употреблением  в  пищу  мяса 

сельскохозяйственных  животных,  молодняк  которых  откармливался  с 

использованием  мясокостной  муки  и  других  субпродуктов  убоя  овец,  в 

частности,  голов  овец.  Щадящая  технология  обработки  субпродуктов  (для 

повышения  их  питательной  ценности)  усиливает  опасность  возникновения 

эпидемии.  

Инфекционный  агент  был  выделен  и  оказался  низкомолекулярным  белком 

(27-30  кДа).  Он  получил  название  «инфекционный  прионный  белок».  В 

качестве  инфекционной  единицы  предложено  название  «прион».  Это  слово 

образовано  из  анаграммы  английских  слов Proteinaceous infectious (particle), 

то  есть  подчеркивается,  что  этот  белок  обладает  самоинфицирующей 

способностью. Размножение приона происходит не за счет синтеза «de novo», 

а  за  счет  изменения  конформации  предшественника  нормального  белка. 

Необходимо  отметить,  что  такой  нормальный  белок  обнаруживается,  в 

основном,  в  нервной  ткани,  где  экспрессия  его  гена  в 50 раз  выше,  по 

сравнению с другими тканями. Этот белок регулирует циркадные - суточные 

ритмы  активности  и  участвует  в  передаче  нервных  импульсов.  Изменение 

прионом конформации нормального белка ведет к тому, что сам измененный 

белок превращается в прион. В результате содержание в клетке нормального 

 

77

белка  падает;  а  содержание  приона,  соответственно,  увеличивается,  что 

приводит  к  ее  гибели.  Схематично  данный  процесс  выглядит  следующим 

образом: 

                *  PrPsc + *PrPc (r) 2 PrPsc; 

                  2PrPsc + 2PrPc (r) 4PrPsc ; 

                  4PrPsc + 4PrPc (r) 8PrPsc и т. д., где  

* PrPsc - прион (Sc - scrapie), * PrPc  - нормальный белок клетки (c - cell)  

Некторыми  авторами  высказывается  предположение,  что  гибель  нейронов 

при губкообразной энцефалопатии происходит путем апоптоза. 

Попытки  профилактики  и  лечения  губкообразных  энцефалопатий  самыми 

разнообразными  соединениями  делались  неоднократно.  Для  этого 

использовались стероиды, арахисовое масло, амфотерицин В,  

декстран-сульфат, некоторые из антрациклинов и т.д. Однако эти попытки ни 

к  чему  серьезному  не  привели,  за  исключением,  некоторого  замедления 

развития  клинических  симптомов  заболевания  за  счет  удлинения 

инкубационного периода, что, однако, не свидетельствуют об избирательном 

действии  на  прион.  Следует  отметить,  что PrPc и PrPsc - это  изоформы 

одного  белка  и  антитела  на  прионы  не  образуются,  что  существенно 

затрудняет 

лабораторную 

диагностику, 

иммунопрофилактику 

и 

иммунотерапию  прионных  болезней.  Согласно  официальному  мнению 

экспертов  ВОЗ  создание  высокоэффективных  избирательных  средств 

лечения  прионных  болезней  должно  исходить  из  использования  данных  о 

трехмерной  структуре  прионов.  Подвергающийся  изменению  нормальный 

белок (PrPc), содержит  четыре  α-спиральных  домена  соединенных 

дисульфидными  мостиками.  В  молекуле  же  приона (PrPsc) являющейся 

инфекционной изоформой, только два домена остаются α-спиральными, а два 

других  становятся  β-спиральными.  Возможно,  что  это  происходит  в 

результате  точечных  мутаций  в  гене,  кодирующем  белок PrPc. Например, 

 

78

было  установлено,  что  некоторые  конститутивные  белки  могут  изменяться 

по форме и превращаться в смертельно опасные прионы.  

В  качестве  перспективы  борьбы  с  прионными  болезнями  предлагается 

использовать  антисмысловые  олигонуклеотиды  для  подавления  экспрессии 

соответствующих  генов.  Другой  потенциально  возможный  путь  борьбы  с 

прионной инфекцией - создание своего рода молекулярного «клея», который, 

проникая через гематоэнцефалический барьер, связывался бы с гидрофобной 

«сердцевиной» PrPc, то  есть  стабилизировал  бы  α-спирали  и  предотвращал 

переход PrPc в PrPsc. Как альтернативный вариант предполагается создание 

«клея», который взаимодействовал бы с прионом (PrPsc) - «окутывал» его и 

предотвращал взаимодействие с PrPc. Эти предложения пока еще достаточно 

абстракты,  но  демонстрируют  современные  подходы  к  лечению  недавно 

открытых и необычных заболеваний. 

Контрольные вопросы к главе 2 

1.  В  чем  состоит  отличие  таргетного  скрининга  от  традиционного 

скрининга при поиске и отборе новых лекарственных средств? 

2.  В  чем  заключается  отличие  метода  исследования  в  геномике  от 

метода исследования в протеомике?   

         3.  Как можно сопоставить  по целям и задачам геномику и протеомику 

              в части поиска и создания новых лекарственных средств? 

        4.  Как классифицируется геномика с точки зрения, поставленных в этой 

             области задач? 

5. Что обозначает термин «обратная генетика»? 

6. Каково в настоящее время практическое значение достижений  

    в области геномики для фармации? 

7.  Что означает понятие «существенности» гена? 

        8.  В чем заключается отличие генотерапии «ex vivo» от «in vivo» ? 

        9.  Что такое антисмысловые олигонуклеотиды? 

        10. В чем заключается необычность конформационных болезней? 

 

79

Глава  3.      Молекулярные  механизмы  внутриклеточной  регуляции  и  их 

использование в биотехнологическом производстве 

          В  соответствии  со  своей  специализацией  любая  клетка  (микробная, 
растительная,  животная)  поддерживает  гомеостаз  и  совершает  свой  цикл 
развития, обслуживая те или иные потребности многоклеточного организма. 
Биотехнолог, преследуя задачу максимальной наработки целевого продукта, 
воздействует  на  эти  процессы  в  соответствии  с  интересами  производства. 
Современное  биотехнологическое  производство  лекарственных  средств 
наряду  с  совершенствованием  продуцента  требует  также  и  постоянной 
оптимизации условий самого процесса ферментации. 
3.1.    Индукция и репрессия синтеза ферментов 
         Известно, что микробная клетка, как продуцент лекарственных веществ, 
содержит  несколько  тысяч  ферментов  и  часто  используется  как  основа 
создания продуцентов - рекомбинантов. 
Значительную 

часть 

ферментов 

микробной 

клетки 

составляют 

конститутивные  ферменты,  которые  всегда  присутствуют  в  ней  в  строго 
определенной концентрации, характерной для каждого отдельного фермента, 
например,  ферменты  гликолиза.  Однако,  эволюция  жизни  на  планете  и 
необходимость 

приспособления 

организмов 

(микроорганизмов) 

к 

разнообразным  и  часто  меняющимся  условиям  внешней  среды,  привели  к 
возникновению так называемых адаптивных или индуцибельных ферментов. 
Гены,  кодирующие  такого  рода  ферментные  белки,  экспрессируются  лишь 
тогда,  когда  в  среде  появляется  относительно  редкий  субстрат,  который 
может  быть  использован  как  источник  энергии.  Довольно  частый  случай 
образования  в  клетке  индуцибельных  ферментов - при  появлении  в  среде 
антимикробных  веществ,  структура  которых  может  подвергаться 
ферментативной инактивации. 
Индукция  фермента - это  резкое  увеличение  скорости  его  синтеза  (за 
несколько секунд - в миллионы раз) в ответ на появление индуктора.  
Схематически  механизм  индукции  может  быть  представлен,  исходя  из 
предложенной в 60-х годах прошлого века Ф.Жакобом и Ж.Моно концепции 
о регуляции индукции и репрессии синтеза ферментов (рис. 7).  

 

80

 

 

 

 
Рис.7                Схема индукции и репрессии фермента 
 

репрессор

     ген 
регулятор

промотор     оператор    структурный ген 

      РНК  
полимераза

Репрессия

репрессор

     ген 
регулятор

промотор     оператор   структурный ген

      РНК  
полимераза

индуктор 

Индуктор связывает (уводит) белок репрессор

Индукция

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  8  9  10  11   ..