Курс лекций по биотехнологии - часть 9

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  7  8  9  10   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 9

 

 

 

65

означает - «гены,  на  которых  держится  дом».  Эти  гены  экспрессируются  в 

любых условиях, поскольку без них клетка просто не может существовать.  

Соотношение  между house keeping gens и ivi gens  у  разных  патогенных 

бактерий  варьирует,  но  в  среднем  более 90% генов  принадлежит  к  первой 

группе.  Поскольку  ингибиторы house keeping gens обнаруживаются  при 

поиске  на  питательных  средах in vitro, практически  все  применяемые    в 

клинике  антибиотики  и  синтетические  антибактериальные  препараты 

являются ингибиторами функций именно этих генов.  

Значительный интерес представляют пути выявления и выделения ivi генов с 

последующим  их  использованием  в  бесклеточных  системах  отбора 

ингибиторов.  В  качестве  примера  можно  привести  метод IVET (In Vivo 

Expression Technology). 

Геном патогенной бактерии (в данном случае речь идет о штамме Salmonella 

typhi murium) с  помощью  большого  набора  рестриктаз  делится  на  сотни 

фрагментов.  Каждый  отдельный  фрагмент  генноинженерными  методами 

соединяется  с  лишенным  промотора  (участок  молекулы  ДНК,  с  которым 

связывается  РНК-полимераза)  геном  хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. 

Такой,  лишенный  промотора  ген,  не  может  реплицироваться  при  его 

введении в клетку. Однако, он мог бы реплицироваться, если соединенный с 

ним  ген  (в  данном  случае - это  фрагмент  ДНК    салмонеллы)  имел  бы 

промотор  для  своей  репликации.  Тогда,  этот  промотор,  вызвал  бы 

репликацию  не  только  своего  гена,  но  и    следующего  за  ним  лишенного 

промотора  гена.  Таким  образом,  репликация  гена  хлорамфеникол-

ацетилтрансферазы  могла  бы  происходить    в  клетке,  только  за  счет 

использования или «захвата» чужого промотора.      

На    следующем  этапе  работы  к  этому  сдвоенному  фрагменту, 

(обозначенному x-cat, где x - фрагмент  генома  салмонеллы,  а cat - ген 

хлорамфеникол-ацетилтрансферазы)  присоединяется  также  лишенный 

промотора лактозный оперон (lac Z), который нужен для системы окисления 

 

66

лактозы. Далее, этот фрагмент состоящий из трех разнородных частей (x-cat-

lacZ)  включается  в  плазмиду.  Фактически  в  данном  случае  речь  идет  не  об 

одном  фрагменте,  а  о  нескольких,  так  как  часть  х,  происходящая  из  генома 

салмонеллы,  зависит  от  использованной  рестриктазы  и  поэтому  содержит 

разные    участки  генома.  Фрагменты x-cat-lacZ различаются  именно  по  х.  В 

результате,  получился  набор  различных  плазмид,  а  после  введения  их  в 

клетку E.coli  - набор  различных  штаммов E.coli с  разными частями генома 

салмонеллы. 

Следующий  этап  работы  заключается  во  внедрении E.coli в  организм 

лабораторного  животного  (мыши)  и  введении  животному  хлорамфеникола. 

Спустя  сутки  из  ткани  животного  высевается  бактериальная  культура, 

причем  высев  производится  на  твердую  индикаторную  среду  с  лактозой. 

Далее,  выросшие  колонии  визуально  анализируются.  Они  оказываются  или 

красного  цвета  (меняющие  рН  и  окисляющие  лактозу)  или - белого 

(бесцветные),  причем  красные  доминируют,  их - свыше 90%. Однако, 

отбираются  и  подвергаются  дальнейшему  изучению  именно  белые.  Ход 

рассуждений  в  данном  случае  следующий:  если  из  животного,  которому 

ввели хлорамфеникол высеялась жизнеспособная клетка, давшая колонию на 

твердой  среде,  значит  в  этой  клетке  экспрессировался  ген  хлорамфеникол- 

ацетилтрансферазы 

и, 

соответственно, 

образовывался 

фермент, 

инактивирующий  (ацетилирующий)  антибиотик.  Следовательно,  в  данном 

фрагменте х  - есть ген с промотором. Этот ген экспрессировался в организме 

животного,  а  вслед  за  ним  экспрессировался  и  ген  хлорамфеникол-

ацетилтрансферазы 

(лишенный 

собственного 

промотора). 

Но, 

экспрессироваться  мог  ген,  принадлежащий  как  к ivi генам,  так  и  к house 

keeping gens. В  случае  колоний  красного  цвета  экспрессируется  ген, 

кодирующий  образование  фермента,  расщепляющего  лактозу;  при  этом  

меняется  цвет  индикатора  и  колония  окрашивается.  Отсюда  можно  сделать 

вывод  о  том,  что  в  данном  фрагменте  х  содержится  (вместе  с  промотором) 

 

67

ген, принадлежащий к house keeping gens, т.е. он экспрессируется всегда:  и в 

организме  животного,  и  на  искусственной  питательной  среде.  Такой    ген  в 

данном  случае  не  представляет  интереса.  Его  можно  обнаружить    более 

традиционным  путем  (для  подбора  в  последующем  ингибиторов 

кодируемого им продукта). Если колония на индикаторной среде с лактозой 

выросла  бесцветная,  значит  на  искусственной  питательной  среде  данный 

промотор  не  работал  и  ген  во  фрагменте  х    не  экспрессировался.  Вероятно, 

что он нужен только при развитии инфекционного процесса и принадлежит к 

генам  вирулентности (ivi генам,  которые  не  экспрессируются  in  vitro).             

Метод IVET не  является  единственным  путем  идентификации ivi генов  у 

патогенных 

микроорганизмов; 

существуют, 

например, 

методы 

с 

использованием направленного мутагенеза. 

Интерес  к ivi генам  обусловлен  не  только  тем,  что  они  (их  продукты) 

практически  не  использованы  как  таргеты,  но  также  и  тем,  что  в  случае ivi 

генов  можно  рассчитывать  на  высокую  избирательность  действия 

(безопасность)  создаваемых  лекарственных  средств.  В  месте  с  тем 

необходимо  отметить,  что  в  настоящее  время  геномика  позволяет 

дифференцировать  гены  патогенных  микроорганизмов  по  многим 

показателям и это, в свою очередь, позволяет вести скрининг антимикробных 

агентов  все  более  целенаправленно.  В  качестве  примера  можно  привести 

результаты,  полученные  при  изучении  представителей  рода Chlamydia 

(внутриклеточных  паразитов  с  относительно  небольшим  геномом - порядка 

одного  миллиона  пар  нуклеотидов),  которые  вызывают  инфекции 

бронхолегочного  и  мочеполового  трактов.  Прежде    всего  гены  этого 

прокариота  были  разделены  на house keeping gens и ivi гены.  Далее,  была 

выявлена  группа  генов,  влияющих  на  апоптоз  (запрограмированная  гибель 

части    популяции  клеток  многоклеточного  организма - общебиологическое 

явление,  отвечающее  за  поддержание  необходимого  и  достаточного 

количества  клеток)  клетки-хозяина.  Далее,  были  идентифицированы  гены, 

 

68

дублирующие систему жизнеобеспечения паразита. При этом было показано, 

что ряд этих генов близок по степени гомологии генам высших растений  и 

приблизительно 27 % из них уникальны для рода Chlamydia.   

2.2.   Геном человека.  

    Полное    секвенирование  генома  человека  (несколько  миллиардов  пар 

нуклеотидов и идентификация генов всех сорока восьми хромосом) - задача 

качественно более трудная, чем секвенирование генома прокариот и низших 

эукариот.  В  начале  девяностых  годов  был  обнародован  Международный 

проект  «Геном  человека»,  целью  которого  было  решение  указанной  выше 

кардинальной  проблемы  с  привлечением  сил  и  средств  ряда  стран,  в  том 

числе  и  России.  В 2003 году  этот  проект  был  успешно  завершен. 

Ученые 

описали все 25 000 генов, присутствующих в хромосомах каждой клетки. За 

это время были созданы базы ДНК из образцов генов десятков тысяч людей.  

Теперь,  в  самой  общей  форме  коснемся  некоторых  предварительных 

заключений.  Если  раньше  утверждалось,  что  геном  человека  содержит 

порядка ста тысяч  генов, то сейчас указывается на значительно меньшее их 

число.  Также  в  ДНК  генома  человека  обнаружены  многочисленные  

некодирующие  последовательности.  Вначале  к  ним  прилагалось  условное 

определение  «мусор»,  под  которым  подразумевались  «отходы - излишки, 

накапливающиеся  по  мере  эволюции  генома».  Однако,  в  настоящее  время 

обнаружено,  что  некодирующие  последовательности  в  геноме  человека  не 

являются    случайными.  Любопытные  факты  обнаружены  в  последние  годы 

при  сопоставлении  генома  человека  и  человекообразных  обезьян. 

Ожидалось, что эти различия по сравнению с парадигмой дарвинизма  о том, 

что «человек произошел от обезьяны» -   окажутся довольно значительными 

и, что наш общий предок весьма отдален от нас,  а дивергенция - произошла 

очень  давно.  Однако,  это  сходство  оказалось  весьма  близким,  увеличивая  

количество  загадок.  К  числу  таких  загадок  относится  постоянное  

присутствие 

в 

геноме 

человека 

последовательностей 

вирусного 

 

69

происхождения (своего рода «насыщенность» генома современного человека 

молекулами  вирусных  ДНК).  Также  было  обнаружено  отличие  между 

геномами  отдельных  наций.  Это  очень  деликатный  вопрос,  учитывая    еще 

совсем  недавние трагические страницы истории человечества. Тем не менее, 

закрывать  глаза  на  объективные  факты  из-за  несовершенства  человеческого 

общества  было  бы  неразумно,  тем  более  что  познание  собственного  генома  

дает  человечеству  в  новом  тысячелетии,  предпосылки  для  своего 

совершенствования,  над  которыми  не  довлеют  ни  религиозные  догмы,  ни 

разрушительная революционная демагогия. 

2.2.1.   

Генотерапия. 

Сравнивая  гены,  ученые  смогут  выявить  связи  различных  генетических 

вариаций и мутаций со всевозможными заболеваниями.

 

Прогресс  в  познании  человека  привел  к  возникновению  такого  важного 

практического  приложения  геномики  к  медицине,  как  генотерапия.  С  её 

помощью  можно  лечить  многие  наследственные  заболевания,  которые 

дифференцируются на моногенные и полигенные. 

Моногенные  заболевания  на  молекулярном  уровне  сводятся  к  дефекту  

какого-либо  одного  белка  в  клетке - фермента,  транспортного    или 

структурного  белка.  Во-первых,  белка  может  не  хватать,  а,  во-вторых,  его 

функции  могут  быть  нарушены.  Так,  мутация,  в  результате  которой 

изменяется  активность  того  или  иного  фермента,  может  приводить  или  к 

накоплению  токсичного  субстрата,  или  к  дефициту  соединения, 

необходимого для нормального функционирования клетки; а мутация в гене, 

кодирующим  структурный  белок - к  серьезным  нарушениям  клеток,  тканей 

или органов. Кроме того, мутация в гене, экспрессирующимся в одной ткани, 

может  сказаться  самым  серьезным  образом  на  другой  ткани  и  привести  к 

появлению  множества  симптомов.  Например,  мутация  в  гене  печеночного 

фермента  фенилаланиндегидроксилазы,  в  результате  которой  блокируется 

превращение  фенилаланина  в  тирозин,  приводит  к  повышению  уровня 

 

70

эндогенного  фенилаланина  в  крови,  неправильному  формированию 

миелиновой оболочки вокруг аксонов нерых клеток ЦНС и как следствие – к 

тяжелой умственной отсталости (фенилкетонурия) 

Полигенность заболевания означает, что несколько белков в клетке обладают 

теми или иными дефектами. В каждой ткани организма экспрессируется свой 

набор  из  всей  совокупности  генов,  но  есть  мутации,  которые  приводят  к 

болезням,  затрагивающим  буквально  все  органы  и  ткани:  мышцы,  глаза, 

печень, кости, сердце и т.д. Следует  отметить, что такие болезни, как рак  и 

гипертония  считаются  полигенными.  Некоторые  ненаследственные    и 

инфекционные  болезни,  в  частности,  вирусной  этиологии,  также 

причисляются к полигенным. 

Вполне  естественно,  что  проведение  генотерапии  при  моногенных 

заболеваниях  показывает  лучшие  результаты.  При  этом  ген,  с  которым 

ведется  работа,  должен  быть  не  только  картирован,  но  и  идентифицирован 

(должна  быть  известна  его  функция).  К  настоящему  времени  картировано 

около одной тысячи генов, включенных в процесс возникновения и развития 

моногенных  наследственных  заболеваний,  из  которых  идентифицировано 

всего несколько сотен. 

При  проведении  генотерапии  требуется  предварительное  создание 

рекомбинантной генетической конструкции с нормальной «здоровой» копией 

дефектного  гена,  а  также - создание  вектора    для  этой  конструкции, 

переносящего  ее  в  клетки  организма.  Для  нормального  функционирования 

гена  необходимы  специфические  для  каждого  гена  цис-  и  транс-

регуляторные  последовательности.  Первые  (цис) - локализованы  в  той  же 

хромосоме и  могут быть непосредственно сцеплены с геном или находиться 

и на некотором расстоянии от регулируемого ими гена, выступая в качестве 

промотора; вторые (транс) - располагаются в других  хромосомах. 

Методы  введения  генов  в  клетки-мишени  при  генотерапии  весьма 

разнообразны,  но  в  большинстве  случаев  недостаточно  эффективны.  Это 

 

71

связано с тем, что чужеродная ДНК встраивается  в геном только небольшого 

процента  клеток  ткани,  а  также - разрушается  нуклеазами  и  т.д. 

Обнадеживающие  результаты  получены  при  использовании  генов, 

упакованных  в  липосомы.  В  настоящее  время  наиболее  перспективным 

путем  переноса  генов  при  генотерапии  является  включение  их  в  векторы, 

построенные  на  основе  или  ретро-,  или  адено-  вирусов.  Конечно,  здесь, 

прежде всего, возникает вопрос о безопасности подобных векторов. Вирусы 

генетически  модифицируются  так,  чтобы  при  сохранении  способности 

проникать  в  клетку, они  теряли  бы  способность к  автономной репликации. 

Для  направленной  доставки  сконструированной  последовательности 

учитывается  различный  тропизм  разных  вирусов  к  определенным  видам 

тканей.  Так представители аденовирусов высокотропны в отношении клеток 

эпителия  дыхательных  путей,  вирус  герпеса  высокотропен  в  отношении 

нейронов  ЦНС  и  т.д.  В  перспективе  планируется  проводить  генотерапию  с 

помощью  целых  рекомбинантных  хромосом,  что  позволяет  оперировать  

рядом генов и их регуляторных последовательностей одновременно. 

Современная  генотерапия    направлена  только  на  соматические,  а  не  на 

половые (зародышевые) клетки. 

Генотерапия ex vivo (вне  организма)  означает,  что  нормальная  копия  гена 

вводится  в  соматические  клетки, предварительно  извлеченные  из  организма 

пациента.  Исправленные  клетки  наращиваются  и  вводятся  пациенту  путем 

трансфузии  или  трансплантации.  При  этом  рекомендуется    использовать 

клетки  именно  от  этого  больного  и  их  «исправленное»  потомство  

возвращать  ему  же,  что  снимает  проблему  отторжения  клеток  за  счет 

врожденного иммунитета. Тем не менее, использование только аутологичных 

клеток  сужает  возможность  генотерапии,  поэтому  разработаны  различные 

методы  защиты  от  иммунного  ответа  и  неаутологичных  клеток,  которые, 

включают, в частности, применение иммуносупрессоров.  

 

72

При  генотерапии in vivo  доставка  нормального  гена  осуществляется 

непосредственно  в  ткани  человека  (в  клетки  определенных  тканей).  При 

этом,  промотор гена должен быть  трансспецифичен. 

Перечень наследственных болезней, связанных с недостаточностью того или 

иного  фермента,  возрастает  по  мере  раскрытия  их  биохимического 

механизма.  Соответственно  и  подходы  к  реализации  теоретических 

возможностей  генотерапии  привлекают  все  большее  внимание  и 

конкретизируются.  В  качестве  примера  можно  привести    использование 

генотерапии 

в 

лечении 

муковисцидоза. 

Ген 

муковисцидоза 

(муковисцидозный  трансмембранный  регулятор - МТР)  кодирует 

мембранный  белок,  получивший  название  трансмембранного  регулятора 

проводимости  (МТРП).  Основная  функция  МТРП - это  создание 

регулируемого  цАМФ  хлорного  канала. Мутации  в гене  ведут к изменению 

количества или структуры данного белка, что ведет к нарушению транспорта 

ионов  хлора  и  воды  через  мембраны  клеток  эпителия  ряда  органов. 

Выделяемая    при  этом  экзокриновыми  железами  слизь  обезвоживается    и 

вязкость  ее  повышается.  Это  приводит  к  воспалению  и  размножению 

инфекционных агентов (вторичная патология). При муковисцидозе наиболее 

сильно  поражаются  легкие  (бронхи).  Предпосылками  для  применения 

генотерапии  при  муковисцидозе  послужили  положительные  результаты 

наблюдений,  полученные  на  клеточных  культурах.  Прежде  всего,  введение 

только одной копии нормального гена в клетку с  дефектным геномом было 

уже  достаточно  для  нормализации  ионного  транспорта.  Еще  более 

обнадеживал  тот  факт,  что  достаточно  было  «исправить» 10% клеток  от 

общего числа в монослое, чтобы добиться нормализации транспорта хлора во 

всем  монослое    (вероятно,  за  счет  обмена  ионами    между  соседними 

клетками).  При  этом,  оказалось,  что  особенно  строгая  регуляция  функций 

нормального  чужеродного  гена,  кодирующего  белок  МТРП  не  нужна:  этот 

белок  (при  его  избыточном  синтезе)  не  токсичен.  После  подробных 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  7  8  9  10   ..