Курс лекций по биотехнологии - часть 8

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  6  7  8  9   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 8

 

 

 

57

в данный  конкретный момент,  зафиксировав все находящиеся в ней белки. 

Это,  своего  рода, «моментальная  фотография»  функционального  состояния 

клетки  на  уровне  ее  протеона,  то  есть  совокупности      всех  ферментных  и 

структурных 

белков, 

которые 

 

«работают», 

в 

отличие 

от 

неэкспрессирующихся  генов.  При  этом,  если  геномика    появилась    прежде 

всего  в  результате  развития  техники  секвенирования,  то  для  протеомики 

такую  же  основополагающую  роль  играет  техника  двухмерного 

электрофореза - разделение  белков  в  одном  направлении  по  молекулярной 

массе,  а  в  другом - по  изоэлектрической  точке.  Сам  по  себе  этот  метод  не 

является  новым,  однако,  в  настоящее  время  он  в  значительной  мере 

усовершенствован,  что  позволяет  следить    в  динамике  за  сотнями  белков 

одновременно.  Образно  говоря,  это  как  бы  «киносъемка»  клетки  на 

молекулярном  (белковом)  уровне.  Кадры  своеобразной  киноленты 

последовательно  фиксируют    нарастание  и  падение  количества  

индивидуальных  белков  клетки  во  времени,  например,  при  ее  переходе  из 

одной фазы клеточного цикла в другую; при  реакции  клетки на изменения 

внешней среды;  отражают посттрансляционные  превращения белков и т.п. 

Также  протеомика  позволяет  следить  за  белковыми  взаимодействиями.  Это 

относится, например, к передаче сигналов от поверхности клетки к факторам 

избирательной  транскрипции  в  ядре.  С  ее  помощью  может  быть 

преобразована,  таким  образом,  не  только  технология  скрининга 

иммуносупрессоров,  но  и    ингибиторов  сигнальной  трансдукции  в  целом.

 

Методы 

протеомики 

позволяют 

получить 

более 

полную,  

всестороннюю,  картину  взаимодействия  с  клеткой  новых  потенциальных 

антимикробных  агентов.  Работы    по  изучению  динамики  биосинтеза 

ферментов  вторичного метаболизма  у микроорганизмов при использовании 

протеомики    могут  быть  переведены  на  новый,  более  высокий  уровень.

 

Возвращаясь  к  связи  между  протеомикой  и  геномикой,  следует 

подчеркнуть,  что  протеомика  может  быть  названа  продолжением  именно 

 

58

функциональной  геномики.  В  отличие  от  геномики,  предметом  изучения 

протеомики  являются продукты, кодируемые генами, экспрессирующимися 

в данный момент.           

Минимальные    геномы  у  некоторых  видов  микроорганизмов  состоят  из 

нескольких сотен генов. Геном человека приближается к ста тысячам генов. 

Размеры  отдельных  генов  варьируют - примерно  от  одной  тысячи  пар 

нуклеотидов  и  выше.  Таким  образом,  количество    пар  нуклеотидов, 

составляющих  индивидуальный  геном  измеряется  как  минимум  сотнями 

тысяч, обычно же многими миллионами пар нуклеотидов. 

Отсюда следует, что для полного знания генома организма надо определить 

последовательность (sequence) нескольких миллионов пар нуклеотидов (А-Т  

аденин-тимидин,  Г-Ц    гуанидин-цитозин).  Провести  «секвенирование»,  

согласно  вошедшему  в  употребление  выражению,  целого  генома  можно 

только при наличии высоких технологий и соответствующего оборудования.  

В  настоящее  время  в  качестве  ежесуточного  итога  работы  многих  десятков 

лабораторий  в  разных  странах  мира  секвенируется  приблизительно  один 

миллион  пар  нуклеотидов.  Хранить  же  полученные  данные  и  пользоваться 

ими  невозможно  без  использования  специальных  баз  данных,  некоторые  из 

которых  имеют  статус  международных.  Широкую  известность  имеют  базы 

данных  института  геномных  исследований  (США)  и  Гейдельбергского 

Университета (Германия). Международные базы данных позволяют получать 

сведения  о  гене  и  его  распространенности  среди  патогенов;  о  кодируемом 

этим геном продукте и об участии этого продукта (как правило, фермента) в 

том  или  ином  метаболическом  цикле;  о  катализировании  им  конкретной 

реакции  в  цикле.  Иными  словами,  исходным  тест-объектом  для  отбора 

антимикробных 

веществ, 

избирательных 

ингибиторов 

метаболизма 

становится  уже  не  микробная  культура,  а  ген  (точнее,  кодируемый  им 

продукт). 

 

59

Необходимо иметь в виду, что различие по последовательности нуклеотидов 

геномов  разнообразных  организмов  не  обязательно  говорит  о  межвидовых 

различиях,  например,  у  микроорганизмов  используемых  в  качестве 

продуцентов  в  биотехнологической  промышленности  зафиксированы 

различия  в  геномах  у  отдельных  штаммов  одного  и  того  же  вида. 

Внутривидовые различия в геномах могут обнаруживаться по всей лестнице 

живых  существ,  включая  человека  (в  последнем  случае  индивидуальные  

различия  выявляемые  при  анализе  ДНК    составляют,  в  частности,  новый 

эффективный прием судебной экспертизы).    

 

Как  все  недавно  возникшие  научные  дисциплины,  геномика 

дифференцируется  по  нескольким  направлениям  (специализируются, 

соответственно,  и  базы  данных).  Прежде  всего,  здесь    должна  быть 

упомянута  структурная  геномика,  задачей  которой  является  идентификация 

генов  с  помощью  специальных  компьютерных  программ  (ведется  поиск 

открытых  рамок  считывания  со  старт-кодонами  и  терминирующими 

кодонами). В результате, изучаемый геном характеризуется по молекулярной 

массе, количеству генов и нуклеотидной последовательности в каждом гене. 

У  прокариот  -  в геноме хромосомы,  у  эукариот -  в каждой из хромосом. 

 

Далее,  следует  назвать    сравнительную    геномику,  которая  позволяет 

относительно  быстро,  связавшись  с  базой  данных  и  получив  ответ  на  свой 

запрос,  установить,  является  ли  изученный  по  последовательности 

нуклеотидов  ген  уникальным,  или  он  уже  был  идентифицирован  в  другой 

лаборатории. Также сравнительная  геномика позволяет получить сведения о 

степени  гомологии  родственных  генов,  то  есть  степени  гомологии  по 

последовательности 

нуклеотидов 

в 

открытой 

рамке 

считывания. 

Сравнительная  геномика  дает  возможность  получить  ответ  на  вопрос  об 

эволюционной  близости  одного  организма  другому  и  на  ряд  подобных 

вопросов,  относящихся  к  фундаментальной  биологии.  В  тоже  время  в  ней 

заложены  возможности  ответа  и  на  вопросы  практического  характера. 

 

60

Например,  если  ведется  поиск  ингибиторов  данного  гена  у  патогенного 

микроорганизма  с  целью  создания  на  их  основе  лекарственных  средств,  то 

важно  знать,  есть  ли  ген  с  такой  или  близкой  последовательностью 

нуклеотидов в организме хозяина. Это позволяет строить  предположения  о 

степени безопасности создаваемых лекарств. 

 

После  структурной  и  сравнительной  геномики  как  сформировавшаяся 

научная  дисциплина  должна  быть  названа  функциональная  или 

метаболическая  геномика.  Ее  целью  является  установление  связи  между 

геномом  и  метаболизмом;  кластерами  генов  и  многоступенчатыми 

метаболическими  процессами;  отдельными  генами  и  конкретными 

метаболическими  реакциями.  Применительно  к  функциональной  геномике  

относится понятие  так называемых «модельных» организмов: прежде всего, 

это некоторые микроорганизмы у которых  прослежены связи между генами 

и  кодируемыми  этими  генами  ферментными  и  структурными  белками,  то 

есть  прокариоты  и  низшие  эукариоты  с  полностью  секвенированным 

геномом  и  досконально  изученным  метаболизмом.  Примерами  таких 

модельных  микроорганизмов  могут  служить Esherihia coli (у  прокариот)  и 

Saccharomyces cerevisiae (у  эукариот).  Сопоставление  гена  у  изучаемого 

организма  с  близким  по  степени  гомологии  геном  у  модельного  организма 

позволяет  сделать  предположение  о  функции  гена.  Отсутствие  гомологии 

указывает на необходимость специального изучения функций нового гена. 

Особое  значение  применительно  к  фармации,  функциональная  геномика 

имеет при установлении так называемой «существенности» отдельных генов. 

Под  «существенностью»  подразумевается  необходимость  гена  для 

жизнедеятельности клетки. Так при создании антимикробных лекарственных 

препаратов  именно  «существенные»  гены  должны  быть  мишенями  для 

антимикробных  веществ.  Следует    сразу  же  заметить,  что  иногда  ген 

приобретает  значение  «существенности»  только  в  особых  условиях,  в 

которых может оказаться патогенный микроорганизм. 

 

61

Исходя из размеров генома и количества генов понятно, что задача полного 

секвенирования  генома  решается  быстрее  в  случае  микроорганизмов,  в 

отличие  от  высших  эукариот.  К  настоящему  времени  полностью 

секвенирован  геном  нескольких  десятков  видов  бактерий,  в  том  числе 

патогенных. У разных видов бактерий размер генома варьирует, но в целом 

он  близок  к  нескольким  тысячам  генов  или  нескольким  миллионам  пар 

оснований, соответственно. Например, у Esherichia coli - четыре с небольшим 

тысячи  генов  и,  соответственно,  четыре  с  небольшим  миллиона  пар 

оснований.  

В  клинике  в  настоящее  время  используется  порядка  двухсот  природных  и 

синтетических  антибактериальных  веществ.  Каждое  из  них  имеет  свою 

мишень.  Как  правило,  это  или  фермент,  или  рибосомный  белок.  Всего 

реализованных мишеней также около двухсот. Следовательно, подавляющее 

количество  генов  в  качестве  мишеней  для  антибактериальных  агентов  все 

еще не используются.  

Для 

доказательства 

«существенности» 

генов 

применяется 

метод 

избирательного  «выбивания»  гена  из  генома (knockаut)  с  проверкой 

выживания  организма  после  такой  процедуры,  который  представляет 

большой интерес как технология скрининга антибактериальных (или шире - 

антимикробных) агентов.  

Традиционно,  первичный  отбор  последних  производится  путем  испытания 

их  действия  на  рост  тест-культуры  микроорганизма.  Высокоактивные, 

подавляющие рост вещества (природные или синтетические) отобранные на 

этом  этапе  проходят  дальнейшие  испытания,  в  частности,  определяется 

антимикробный  спектр  их  действия  и  активность  в  опытах in vivo на 

лабораторных  животных,  а  также  токсичность  как  для  макроорганизма  в 

целом, так и для его отдельных органов и тканей.

 

 

После  завершения  доклинических  испытаний  в  случае  получения 

положительных  результатов  ставится  вопрос  о  передаче  препарата  в 

 

62

клинику.  Затем,  как  правило,  начинается  углубленное  изучение  механизма 

действия    антимикробного  агента  на  субклеточном  и  молекулярном  уровне, 

то  есть  ведется  поиск  его  внутриклеточной  мишени  (макромолекулы  или 

макромолекулярного  комплекса)  или,  по  недавно  укоренившейся 

терминологии,  «таргета» (от  англ. Target - мишень).  Далее  выявляется  ген, 

кодирующий образование этой макромолекулы или гены, которые кодируют 

образование макромолекул, входящих в макромолекулярный комплекс.  

 

Новая  же  технология  скрининга  в  отличие  от  вышеуказанной, 

использует  информацию  о  полностью  секвенированном  геноме  патогена  и 

наличии  в  нем  «существенных»  генов.  В  лабораториях,  работающих  в 

области  создания  новых  антимикробных  лекарств,  предварительно 

выбирается  ген,  который  будет  использован    для    их  испытания  как  таргет 

(точнее, в качестве мишени будет использован продукт этого гена).  

Таргетный  скрининг  позволяет  в  соответствии  с  выбором  гена  вести  отбор 

биологически активных веществ с запланированным механизмом действия, в 

отличие от традиционного метода, когда поиск ведётся «от клетки к гену». 

Первый  этап  таргетного  скрининга  начинается  с  выделения  этого  гена 

(соответствующего  фрагмента  ДНК)  из  генома.  Далее,  используя 

полимеразную  цепную  реакцию  (ПЦР),  фрагмент  ДНК  амплифицируется 

(создается  вирусный  вектор,  который  вводится  в  плазмиду).  Количество 

копий гена умножается. Затем конструируются:  

1)  бесклеточная  система,  где  наработанная  матрица  служит  для 

получения информационной РНК, специфичной для гена;  

2)  бесклеточная  рибосомная  система,  где  эта  информационная  РНК 

служит  для  наработки    белкового  продукта,  кодируемого  данным 

геном. 

Бесклеточная  система,  используемая  для  первичного  отбора  и    оценки 

активности  потенциальных  лекарственных  веществ - ингибиторов  фермента 

(продукта изучаемого гена), содержит как сам фермент, так и его субстрат.  

 

63

Когда  наработан  белок  (продукт  избранного  для  изучения  гена),  тогда 

возникает  вопрос,  как  узнать  функцию  этого  белка?  Например,  какую 

реакцию он катализирует как фермент, для того, чтобы по подавлению этой 

реакции  отобрать  ингибиторы.  Если  имеется  близкое  сходство  белка  с 

белком  из  «модельного»  организма,  то  подобрать  бесклеточную  систему 

(субстрат для нового белка) не является трудной задачей. Если сходство есть, 

но не очень близкое, то прибегают к анализу «мотивов» - коротких участков 

аминокислотной  последовательности,  которые  распределены  по  всей  длине 

белковой  цепи  и  могут  оказаться  сходными  у  двух  белков.  Когда  такого 

сходства  нет,  или  сходство  обнаружено,  но  нет  ясности  в  функции  самого 

гомолога, то есть белка, взятого для сравнения, то прибегают еще к одному 

пути  установления  функций  изучаемого  белка.  Устанавливают,  с  какими 

белками  он  контранскрибируется  (переписывается  в  последовательность 

матричной информационной РНК). Если транскрипт - часть полицистронной 

(эквивалентной гену) информационной РНК, необходимой для протекания в 

последующем  определенного  метаболического  процесса  с  участием 

нескольких ферментов, тогда поиск функции изучаемого белка, включенного 

в группу этих ферментов, сужается. 

 

В целом подходы к установлению функций продуктов изучаемых генов 

многочисленны и их разнообразие неуклонно растет. Таким образом, можно, 

в  конечном  счете,  проводить  серийные  испытания  потенциальных 

ингибиторов  функций  почти  любого  из  тысяч  генов,  составляющих  геном 

патогена  и  обнаруживать  все  возможные  «уязвимые  точки»  микробной 

клетки.  Подобный  путь  достижения  цели  породил  в  литературе  термин 

«обратная  генетика»,  то  есть  исследование  ведется  не  от  клетки  и  ее 

фенотипа к гену, а, наоборот, от гена к клетке и к ее фенотипу. 

Полное  секвенирование  генома  в  сочетании  с  применением  методов 

генетической  инженерии  вносит  свой  склад  в  фармацию  еще  в  одном 

отношении. У патогенных микроорганизмов открыты гены, «существенные» 

 

64

для протекания инфекционного процесса, но не «существенные» при росте in 

vitro - на  искусственных  питательных  средах.  В  последнем  случае  они 

ускользают  от  внимания  исследователя,  не  поддаются  идентификации  и  не 

могут быть использованы как таргеты при поиске лекарств. Скрытые или по 

образному 

выражению 

«молчащие» in vitro гены 

патогенных 

микроорганизмов  получили  название ivi генов  (генов  вирулентности), 

несмотря  на  то,  что  в  их  число  входят  не  только  гены,  кодирующие 

образование  токсинов,  адгезинов  и  других  факторов  вирулентности.  К  ним 

относят  также  гены  ферментов  и  транспортных  белков,  позволяющих 

патогенной микробной клетке жить и размножаться в тканях макроорганизма 

в  условиях  дефицита  некоторых  органических  веществ  и  неорганических 

ионов.  Можно  привести  такой  пример:  микробная    клетка  находясь in vivo, 

испытывает  недостаток  ионов  железа,  чего  не  бывает  на  обычных 

питательных  средах.  В  этом  случае  в  клетке  синтезируется  специальная 

система  транспорта  железа  в  клетку  из  среды  с  малой  концентрацией 

последнего, фактически транспорт идет против градиента концентрации. Для 

образования такой системы необходима экспрессия определенных генов. Из 

молчащих    «несущественных»  они  становятся  «существенными»,  то  есть 

подавление их функций отобранными ингибиторами приведет к подавлению 

роста  (размножения)  патогена  именно  в  условиях in vivo, то  есть  в 

инфицированном  организме.  Это,  собственно,  и  есть  цель  исследователей, 

создающих новые лекарственные препараты.  

К числу генов, которые становятся «существенными» для патогена именно in 

vivo  относятся    гены,  кодирующие  оптимальный  компонентный  состав 

системы, а также недостаток в пуринах и их предшественниках. 

Вышеизложенное,  конечно,  не  означает,  что  во  время  инфекции  в  клетке 

патогена  экспрессируются  только ivi гены.  Большинство  генов 

экспрессируется и in vivo и in vitro. Их продукты необходимы клетке всегда. 

Такие гены получили образное название «house keeping gens», что дословно 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  6  7  8  9   ..