Курс лекций по биотехнологии - часть 7

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  5  6  7  8   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 7

 

 

 

49

 

Для  работы  с  промышленными  биокатализаторами  используются 

различные конструкции биореакторов. Простейший биореактор колоночного 

типа  (рис. 5а)  пригоден  для  использования  в  том  случае,  когда 

иммобилизованным  биообъектом  является  только  фермент,  то  есть  в 

реакторе происходит одностадийное превращение субстрата.  

                                                                                             

  

Колонка заполняется сферическими частицами нерастворимого 

носителя со связанным ферментом. При малом диаметре частиц 
увеличивается площадь поверхности, улучшается диффузия субстрата и 
продукта реакции. Однако, при этом возрастает перепад давления по высоте 
колонки. Поэтому в каждом конкретном случае подбираются оптимальные 
размеры частиц носителя с учетом таких параметров, как площадь 
поверхности, перепад давления и равномерность заполнения колонки. Если 
биообъектом являются иммобилизованные живые клетки с активным 
дыханием, то особое внимание обращается на диффузию газов. Так как 
простейший реактор колоночного типа здесь не целесообразен, поэтому 
используется его модификация. В верхней части такого реактора расположен 
патрубок для выхода газа (преимущественно СО

2

), а ниже - прочно 

закрепленная сетка с таким размером ячеек, при котором перемешивание и 
вспучивание частиц носителя сводится к минимуму (рис.5б). Третий тип 
биореактора - это биореактор мешалкой (рис.5в). 

     

Раство-
ритель 

Целевой
продукт

Частицы 
твердого 
носителя 

Реактор колоночного типа

А

 

50

 
 
 
 

 

 
 

 

Рис. 5.             Реакторы, используемые при иммобилизации биообъектов  
                        (А,Б,В) 
 

Раство-
ритель 

Частицы 
твердого 
носителя 

Целевой
продукт

Сетка 

Раство-
ритель 

Целевой
продукт

Клапан для 
выхода 
газообразных 
продуктов

Модифицированный реактор  
колоночного типа 

Клапан для 
выхода 
газообразных 
продуктов 

Мешалка 

Реактор с перемешиванием 

Б

В

 

51

Однако,  в  этом  случае  необходимо  помнить  о  возможности  разрушения 

частиц носителя лопастями мешалки. 

Необходимо  подчеркнуть,  что  при  иммобилизации  целых  клеток, 

осуществляющих  многостадийный  синтез  целевого  продукта,  на  этот 

процесс влияют многие факторы:  

-  биосинтез  целевого  вещества  происходит  на  фоне  роста  и  размножения 

клеток продуцента; 

-  питательная  среда  на  разных  стадиях  биосинтеза  меняется  по  физико-

химическим показателям и составу;  

- отдельные «ферментации» или ферментационные циклы варьируют как по 

количеству  целевого  продукта,  так  и  по  количеству  примесей  в 

культуральной жидкости, которые необходимо удалять.  

 В  заключение  можно  привести  примеры  успешного  применения  методов 

инженерной  энзимологии  при  производстве  одной  из  важнейших  групп 

лекарств микробного происхождения - беталактамных антибиотиков, а также  

- на производстве, выпускающем аминокислоты. 

Процесс  получения  полусинтетических  цефалоспоринов  включает  как 

«классические» биосинтез и оргсинтез, так и две ключевые стадии, в которых 

участвуют  иммобилизованные  ферменты – гидролаза  из Pseudomonas sp. и 

синтетазы из Xanthomonas sp. и E.coli (рис.6).  

Данный  рисунок  демонстрирует  последовательное  применение  ряда 

иммобилизованных  ферментов  при  получении  из  цефалоспорина  С 

(малоценного  в  практическом  отношении  природного  цефалоспорина) 

полусинтетических оральных и инъекционных цефалоспоринов с различным 

спектром  действия,  обладающих  высокой  эффективностью  в  клинике.  В 

нижней  части  рисунка  показаны  различия  в  субстратной  специфичности 

синтетаз из E.coli и Xanthomonas sp. Первую целесообразно использовать для 

синтеза цефалотина, цефалоридина и цефазолина, а вторую - для получения 

цефалоглицина  и  цефоперазона.  Иными  словами,  при  замещении  разными 

 

52

радикалами 

аминогруппы 

в 7-аминоцефалоспорановой 

кислоте 

каталитическая активность сравниваемых синтетаз варьирует неодинаково в 

зависимости от структуры радикала.  

 
 

 

Рис. 6.               Получение полусинтетических цефалоспоринов   

                          с помощью иммобилизованных ферментов 

 

Глутарил -  7 АЦК 

Цефалоспорин С 

7 АЦК 

Цефалотин 

Цефалоридин 

Цефазолин 

Цефалоглицин

Цефоперазон

Иммобилизованная
оксидаза 
D-аминокислот 

Иммобилизованная
гидролаза из 
Pseudomonas sp. 

Иммобилизованная
синтетаза из 
Xanthomonas sp. 

Иммобилизованная 
синтетаза из 
Esherihia coli 

 

53

 

Следует  отметить,  что  несмотря  на  принципиальное  сходство 

ключевых стадий при получении полусинтетических пенициллинов разными 

фирмами,  носители  для  промышленных  биокатализаторов  могут  быть 

различными.  Обычно  для  иммобилизации  как  ферментов,  так  и  клеток 

используют  уже  готовые  коммерческие  препараты  активированных 

носителей («матриц»).  В  России  разработан  препарат  пенициллинацилазы, 

состоящий из клеток E. сoli, включенных в полиакриламидный гель; в США 

(фирма Squibe) используется  его  аналог - пенициллинацилаза  из  почвенной 

споровой  бактерии Bac.megaterium, сорбированная  на  бентоните;  в  Швеции 

(фирма Astra) используется  пенициллинацилаза  из E.coli, ковалентно 

связанная с активированным носителем полисахаридной природы.  

В  настоящее  время  на  производстве  выпускающем  аминокислоты  широко 

применяются  иммобилизованные  аминоацилазы,  которые  используются  в 

качестве  реагентов  для  трансформации  биологически  активных  веществ 

(например, N-ациламинокислот).  Известно,  что  аминокислоты  получаемые 

химическим синтезом, представляют собой смесь L- и D-изомеров (рацемат), 

а  организм  человека  способен  утилизировать  только L-изомеры; D-изомеры 

накапливаются  в  организме  и  могут  оказывать  вредное  воздействие.  Для 

разделения L и D- изомеров  в  аминокислотном  рацемате  существуют 

различные  химические  способы,  но  наиболее  простым  и

 

точным  является 

ферментативное  деление  с  помощью  аминоацилазы.  Дело  в  том,  что  этот 

фермент,  обладая  уникальной  способностью  гидролизовать  ацильные 

производные  всех  природных

 

аминокислот  (за  исключением  пролина) 

проявляет свойство L – стереоспецифичности, то есть гидролизует связь CO-

NH только в ацильных производных L -изомеров. На примере N-ацетильного 

производного

 

аминокислоты рассмотрим реакцию:  

СН

3

 - СО - NH – D,L-аминокислота + Н

2

0          аминоацилаза

 

  

L- аминокислота + СН

3

CO - NH – D аминокислота + СН

3

СООН 

 

54

Используя  различную  растворимость, L-аминокислоту  и N-ацетил-D-

аминокислоту разделяют: при

 

этом в растворе оказывается одна, а в осадке - 

другая  составляющая  смеси.  С  помощью  микробной  аминоацилазы 

получают, например, L-фенилаланин (аминокислота, которая входит в состав 

препарата L-дофа,  используемого  для  лечения  болезни  Паркинсона).

 

Также 

L-изомеры  аминокислот  применяются  при  производстве  панангина  и 

квадевита,  а D-изомеры - при  получении  некоторых  полусинтетических 

химиотерапевтических средств. В частности, D-фенилглицин используют

 

при 

изготовлении полусинтетического антибиотика ампициллина.  

Экономические 

преимущества 

использования 

иммобилизованных 

биообъектов в условиях производства - несомненны.  

Применение  иммобилизованных  систем  позволяют  сделать  условия 

биосинтеза  более  стандартными,  а  все  производство - более  компактным. 

Так,  один  раз  полученный  биообъект  работает  длительное  время.  При  этом 

на  единицу  продукции  расходуется  меньше  сырья.  В  случае  производства 

фармацевтических  препаратов  целевое  вещество  не  будет  содержать 

компонентов  культуральной  жидкости  (мицелий,  продукты  частичного 

лизиса  клеток,  компоненты  комплексной  питательной  среды  и  т.д.),  что 

значительно облегчает задачу выделения и очистки целевого продукта и дает 

большую  гарантию  отсутствия  в  получаемом  препарате  белковых  и  других 

вредных примесей.  

Значительны также и экологические преимущества: сокращается количество 

отходов,  а  также - количество  «нестандартных»  операций,  например,  когда 

из-за  нестерильности  среды  большие  объемы  культуральной  жидкости 

сливаются в канализацию.  

Контрольные вопросы к главе 1 

1.  Какова роль биообъекта в биотехнологическом производстве? Что 

       может быть использовано в качестве биообъектов  в биотехнологии? 

2.  Какие свойства биообъекта можно использовать для его 

 

55

       совершенствования в целях создания эффективного и безопасного 

       производства лекарственных средств? 

3.  Что означает явление репарации биообъекта для 

       биотехнологического производства лекарственных препаратов? 

4.  Как реализуется мутагенез и селекция в получении более 

       продуктивных биообъектов? 

5.  Какие виды мутаций существуют? 

6.  В чем заключается принципиальное отличие методов клеточной 

       инженерии от генной инженерии? 

7.  Что является ключевым моментом в создании новых 

       рекомбинантных структур? 

8.  Какие факторы обусловливают выбор микроорганизма-продуцента  

     при промышленном получении рекомбинантных белков? 

9.  Какие виды иммобилизации биообъектов являются наиболее 

       перспективными? 

10. Какие типы биореакторов используются для работы с 

       

промышленными биокатализаторами?        

 

Глава 2.   Геномика и протеомика 

2.1.  Общая характеристика 

 

Успехи  генетики,  молекулярной  биологии  и  биохимии  привели  к 

формированию  в  девяностых  годах    прошлого  века  двух  новых 

фундаментальных  дисциплин - геномики  и  протеомики.  Бурное  развитие 

этих  дисциплин  обеспечивает  в  наше  время  прогресс  в  ряде  разделов 

биотехнологии, в том числе фармацевтической. 

 

Название  геномика  происходит  от  слова  геном,  то  есть  совокупности 

всех генов организма. Слово протеомика является производным от протеома, 

под  которым  подразумевается  совокупность  структурных  и  каталитических 

белков в клетке эукариота или прокариота. Обе дисциплины можно считать 

 

56

как  бы  терминологическим  оформлением  современного  этапа  развития 

генетики  и  белковой  химии,  приближающим  их  к  целостной  клетке.  И  по 

времени  возникновения  и  в  методологическом  аспекте  главенствующее 

значение  здесь  занимает  геномика;  протеомика  базируется  на  геномике, 

являясь этапом познания живого уже на белковом уровне.  

 

Генетика  начала XIX века  получила  позднее  название    формальной, 

поскольку исследования велись на уровне ген-признак (открытие знаменитых 

основополагающих    законов  Г.  Менделя).  Существование  гена  было 

постулировано, но материальная его природа оставалась неизвестной. Лишь 

в  пятидесятые  годы  ХХ  века  после  появления  и  быстрого  подтверждения 

справедливости  концепции  о  двойной  спирали  ДНК  и  о  гене,  как  участке 

ДНК,  началось бурное развитие молекулярной генетики: были установлены 

размеры  отдельных  генов,  функционально  различные  участки  в  гене  и  т.д. 

Параллельно  биохимиками  с  участием  генетиков  было  осуществлено 

установление  матричного  механизма  белкового  синтеза  с  передачей  

генетического кода от ДНК к белку. 

Геномика  ставит  своей  задачей  установление  полной  генетической 

характеристики  всей  клетки - количества  содержащихся  в  ней  генов  и  их 

последовательности;  количества  нуклеотидов  в  каждом  гене    и  их 

последовательности;  определение  функций  каждого  гена  по  отношению  к 

метаболизму организма или, говоря  более общими словами, применительно 

к  его  жизнедеятельности.  Иными  словами  геномика  позволяет  выразить 

сущность  организма - его  видовые  (и  даже  индивидуальные)  отличия  от 

других  организмов;  его  потенциальные  возможности;  предвидеть  его 

реакцию на внешние воздействия, зная как последовательность нуклеотидов 

в каждом из генов, так и число самих генов. 

Если  геномика  имеет  целью  получить  информацию  о  всех  потенциальных 

свойствах  клетки,  которые  не  реализуются    на    данный  момент,  например, 

«молчащие гены», то протеомика дает возможность охарактеризовать клетку 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  5  6  7  8   ..