Курс лекций по биотехнологии - часть 6

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  4  5  6  7   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 6

 

 

 

41

К 

числу 

используемых 

в 

качестве 

лекарственных 

средств 

видоспецифических  белков  относятся  интерфероны - факторы  врожденного 

иммунитета.  В  свое  время  интерфероны  были  открыты  как  белки, 

вырабатываемые  клетками,  зараженными  вирусами.  Они  индуцируют 

локальные  и  системные  противовирусные  реакции  в  других  клетках,  и, 

соответственно, 

используются 

как 

противовирусные 

препараты. 

Потенциально интерфероны представляют интерес и как противоопухолевые 

агенты.  Их  принято  делить  на  три  группы:  альфа,  бета  и  гамма  (из  разных 

типов клеток). 

До недавнего времени интерфероны из человеческих клеток были доступны 

лишь  в  малых  количествах.  Как  медицинский  препарат  использовался, 

главным  образом,  лейкоцитарный  интерферон.  Его  источником  служила 

кровь,  получаемая  из  родильных  домов.  В  настоящее  время  ген 

лейкоцитарного интерферона получен путем химического синтеза. Затем он 

был  включен  в  плазмиды,  которые  в  свою  очередь,  были  введены  в  клетки 

кишечной палочки и клетки дрожжей, ставшие таким образом продуцентами 

лейкоцитарного интерферона человека.  

Далее следует отметить, что ген интерферона из фибробластов человека был 

клонирован в клетках кишечной палочки. Также ведется работа по созданию 

методами  генетической  инженерии  гибридных  интерферонов  с  большей 

противораковой активностью, чем у природных. Это относится к получению 

гибридов между интерферонами  альфа 

1

 и альфа 

2.

  

Вообще 

возможность 

получения 

и 

использования 

в 

медицине  

иммуномодифицированных  рекомбинантых  белков  привлекает  все  большее 

внимание.  Можно  отметить,  в  частности,  цикл  исследований  посвященных 

основному или главному катионному белку нейтрофилов, который обладает 

одновременно  бактерицидной  активностью  и  способностью  нейтрализовать 

эндотоксин  грамотрицательных  бактерий.  Это  обусловлено  повышением 

проницаемости  внешней  мембраны  последних  (отсюда,  шифр  белка - BPI 

 

42

bactericidal, permeability increasing). Этот белок имеет молекулярную массу 55 

kD и обладает исключительно высоким сродством к липиду А (эндотоксину) 

внешней  мембраны  грамотрицательных  бактерий.  Использование  его  как 

химиотерапевтического 

препарата, 

вводимого 

извне 

«в 

помощь» 

нейтрофилам 

своего 

организма, 

является 

весьма 

перспективным. 

Рационально  использовать BPI человеческого  происхождения  во  избежание 

аллергических  реакций,  но  в  данном  случае,  естественно,  возникает 

проблема  дефицита  сырья.  Необходимо  отметить  что,  являясь  ингибитором 

воспалительных реакций, на уровне эндотоксина данный белок конкурирует 

с одним из белков острой фазы (образуемых печенью), который стимулирует 

противоспалительные  реакции.  Отсюда,  понятно  значение  рекомбинантного 

BPI (rBPI

21

)  как  корректора  в  патогенезе  инфекционного  процесса.  В 

настоящее  время BPI получен  генноинженерными  методами,  причем  его 

молекулярная  масса  значительно  меньше  в  лекарственной  форме,  так  как  в 

этом  случае  используется  лишь N-терминальная  часть  рекомбинантного 

белка с молекулярной массой 21 kD (так называемый rBPI

21

). 

1.5.   Инженерная энзимология. Иммобилизованные биообъекты 

Биотехнология  с  момента  зарождения  была  основана  на  ферментативных 

процессах.  Однако  вплоть  до  ХХ  века  сведения  о  катализаторах  белковой 

природы  были  минимальными.  Лишь  в  наше  время  биотехнолог  получил 

возможность  опираться  на  глубокие  знания  структуры  ферментов  и 

механизмов ферментативных реакций.  

С  одной  стороны,  использование  в  биотехнологическом  производстве 

ферментов  в  изолированном  виде,  резко  повысило  его  уровень  в  целом,  а 

также  предсказуемость  результатов  на  каждой  производственной  стадии. 

Однако  при  этом  пришлось  решать  проблему  нестабильности  многих 

ферментов.  Дело  в  том,  что  изолированные  ферменты  не  защищены 

системами  клеточного  гомеостаза  и  большинство  их  в  таком  виде 

относительно  быстро  теряет  активность,  которая  зависит  даже  от 

 

43

незначительных  физико-химических  изменений  среды.  С  другой  стороны, 

при  цикличности  производственных  процессов  требуется  постоянно 

повторяющаяся  наработка  высокоочищенных  ферментных  препаратов,  что 

связано  с  большой  затратой  сил  и  средств.  Проблема  была  решена,  путем 

создания 

так 

называемых 

«промышленных 

биокатализаторов» - 

иммобилизованных  ферментов.  В  данном  случае  под  иммобилизацией 

подразумевается  связывание  фермента  с  нерастворимым  носителем  при 

сохранении  функциональной,  то  есть  каталитической  активности  фермента. 

Получение 

и 

использование 

иммобилизованных 

ферментов 

в 

промышленности,  в  том  числе  и  в  фармацевтической,  составляет  основу 

инженерной  энзимологии.  Иммобилизация  ферментов  существенно 

повышает  их  стабильность,  но,  прежде  всего,  позволяет  длительно 

использовать одну партию или серию промышленного биокатализатора. 

 

За  последние  десятилетия  параллельно  с  иммобилизацией  ферментов 

развивалось  и  другое  направление - иммобилизация  целых  клеток  (прежде 

всего микробных), целью которого является осуществление многостадийного 

метаболического процесса, например, биосинтеза антибиотика. Такие клетки 

после иммобилизации могут «работать» неделями и месяцами, не теряя при 

этом жизнеспособности. 

 

Понятие 

«иммобилизация 

биообъекта» 

означает 

физическое 

разделение  биокатализатора  и  растворителя,  при  котором  молекулы 

субстрата и продуктов реакции могут свободно обмениваться между жидкой 

и твердой фазами. Иными словами, субстрат в токе растворителя подводится 

к  биообъекту,  связанному  с  нерастворимым  носителем,  в  тоже  время, 

продукт реакции в токе растворителя удаляется от биообъекта и используется 

как целевой продукт.  

 

44

В  качестве  нерастворимого  носителя  используются  неорганические  и 

органические  вещества,  последние,  в  свою  очередь,  могут  быть  как 

природными, так  и синтетическими.  

Биообъект иммобилизуется на носителе:  

- путем адсорбции;  

- за счет образования с ним ковалентных связей; 

- путем включения в формируемый этим носителем гель.  

В  перечень  материалов,  применяемых  для  адсорбции  биообъектов,  входят: 

окись  алюминия,  карбонат  кальция,  бентонит,  уголь,  целлюлоза,  коллаген, 

ионообменные  смолы,  силикагель  и  т.д.  При  ковалентном  связывании 

ферментов  используются  агароза,  декстран,  целлюлоза,  сополимеры 

полиакриламида, полиуретаны и т.д. В ряде случаев ковалентное связывание 

с носителем требует его предварительной активации, в результате которой на 

поверхности  носителя  образуются  электрофильные  группы,  обладающие 

высокой  реакционной  способностью  по  отношению  к  нуклеофильным 

группам  на  белке ( например,  амино-  и SH-группам).  При  иммобилизации 

путем включения биообъекта в гель используются различные полисахариды, 

например, гель альгината кальция (альгинат - гетерополисахарид из морских 

водорослей), полиакриламид (полиакриламидный гель) и другие полимеры.   

Весьма  важным  параметром  при  иммобилизации  является  максимальная 

«нагрузка»  носителя,  то  есть  максимальное  количество  фермента,  которое 

может быть иммобилизовано на определенном количестве носителя.  

Каждый  метод  иммобилизации  имеет  свои  преимущества  и  недостатки. 

Адсорбция - относительно  «мягкий»  метод  связывания  с  нерастворимым 

носителем  (резкого  снижения  активности  фермента  здесь  нет).  Однако 

фермент  может  связываться  с  носителем  недостаточно  прочно  и  легко 

 

45

десорбироваться  при  незначительных  изменениях  условий  протекания 

каталитического процесса. 

Связывание  биообъекта  с  носителем  за  счет  ковалентных  связей, 

естественно, 

более 

прочно. 

Использование 

различных 

«типов» 

иммобилизованных  биообъектов  в  производстве  зависит  от  конкретных 

целей  стоящих  перед  биотехнологом,  например,  если  необходим  катализ 

какой-нибудь одной ферментативной реакции, то, как правило, используется 

либо  изолированный  фермент,  либо  фермент  находящийся  в  интактной 

клетке, либо фермент находящийся в клетке с повышенной проницаемостью 

оболочки;  если  же  необходим  полный  биосинтез  целевого  продукта,  то 

используется  комплекс  ферментов  в  интактной  клетке  включенных  в 

многоэтапный  биохимический  процесс;  и,  наконец,  если  необходим 

биосинтез  целевого  продукта  с  его  последующей  трансформацией,  то 

используются  «системы  открытые  для  усложнения» (клетка + фермент  и 

т.п.). В качестве биообъектов для иммобилизации могут быть использованы 

ферменты  не  имеющие  кофермента,  например,  гидролазы  и  изомеразы; 

ферменты  с  прочно  связанной  с  апоферментом  простетической  группой. 

Однако,  ферменты  с  диссоциирующими,  расходуемыми  в  эквимолярном 

отношении  к  субстрату  коферментами  малопригодны  для  иммобилизации 

(требуется регенерация последних при непрерывно протекающей реакции). В 

то же время следует отметить, что трудности связанные с применением таких 

ферментов  в  промышленности  снимаются,  если  используется  не 

изолированный фермент, а фермент содержащийся в жизнеспособной клетке 

(в  этом  случае  обеспечены  одновременно  и  доставка,  и  регенерация 

кофермента).  Если  целевой  продукт  является  внутриклеточным,  то  для  его 

извлечения из клеток приходится разрушать всю систему, поэтому возникает 

вопрос  о  целесообразности  использования  иммобилизации  биообъекта. 

Однако,  в  этом  случае  методами  генетической  инженерии  может  быть 

 

46

сконструирована  и  введена  в  продуцент  система  транспорта  целевого 

продукта из клетки в среду. 

Активность  изолированного  (и  иммобилизованного)  фермента,  несмотря  на 

все  усилия  по  подбору  оптимальных  условий  для  его  функционирования, 

остается  ниже  его  активности  в  целой  клетке.  Поэтому  для  катализа 

конкретной  реакции  целесообразно  применять  фермент,  сохраняющийся  в 

клетке.  Однако,  это  возможно  лишь  при  том  условии,  что  и  субстрат  и 

целевой  продукт  не  будут  подвергаться  воздействию  других  ферментов 

клетки.  Иногда  этого  воздействия  можно  избежать,  регулируя  температуру, 

рН  и  некоторые  другие  условия, в  которых  протекает  нужная биотехнологу 

ферментативная  реакция.  Вместе  с  тем  эффективность  работы  фермента 

внутри  клетки  может  быть  лимитирована  ее  оболочкой,  ограничивающей 

доступ  субстрата  к  ферменту.  Проницаемость  оболочки  клетки  можно 

увеличить  за  счет  кратковременной  обработки  её  органическими 

растворителями, например, 5%-ным раствором диметилсульфоксида. Однако, 

при этом важно избежать неблагоприятного воздействия на внутриклеточный 

фермент,  катализирующий  нужную  реакцию.  В  результате,  клетка  должна 

быть «пермеабилизированной» (от английского permeability- проницаемость), 

то есть иметь повышенную проницаемость оболочки, но сохранять при этом 

жизнеспособность.  

Включение  в  гель  живых  клеток,  осуществляющих  многостадийные 
ферментативные  процессы,  требует  «мягких»  условий  иммобилизации  и 
применения  относительно  малотоксичных  носителей.  Во-первых,  должна 
быть обеспечена диффузия молекул субстратов и частиц носителя как внутрь 
самой  клетки,  так  и  диффузия  целевого  продукта  из  клетки.  Во-вторых, 
иммобилизованные  клетки  дышат,  следовательно,  для  них  должна  быть 
сохранена  возможность  газообмена.  В  тоже  время  носитель  должен  быть 
достаточно  прочным.  Существуют  различные  методы  включения  клеток 
биообъекта  в  гель,  например,  суспензия  клеток  смешивается  с  раствором 
альгината  натрия,  после  чего  в  полученную  смесь  вносится  раствор 
хлористого  кальция  (в  избытке).  В  результате,  образуется  гель  альгината 

 

47

кальция  с  включенными  в  ячейки  геля  клетками.  Процесс  затвердевания 
заканчивается в течение примерно 20 минут.  
В настоящее время активно разрабатываются подходы к созданию «систем 
открытых для усложнения». В этом случае в одном биореакторе 
иммобилизуются: синтезирующий определенное вещество продуцент и 
фермент, трансформирующий это вещество. В качестве примера можно 
привести одновременную иммобилизацию микроорганизма Penicillium 
chrysogenum продуцента бензилпенициллина и выделенного из Escherichia 
coli фермента пенициллинацилазы. В результате, из синтезированного 
пенициллина образуется продукт его ферментативного гидролиза 6-
аминопенициллановая кислота (ключевое соединение для синтеза новых 
пенициллинов). Система может быть вновь «усложнена» включением в нее 
еще одного иммобилизованного фермента, катализирующего присоединение 
к 6-аминопенициллановой кислоте нового радикала взамен отщепленного. В 
результате, при использовании такой совокупности промышленных 
биокатализаторов можно получать практически совершенно новые 
полусинтетические пенициллины (рис.4).  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Бензилпенициллин

 

(биосинтез  

клетками Penicillium chrysogenum) 
узкий спектр действия 

6 аминопенициллановая кислота 
(6АПК)

 

Иммобилизованная 
пенициллинацилаза 
из Esherihia coli 

Иммобилизованная 
синтетаза из 
Xanthomonas sp. 

Амоксициллин 

широкий спектр 
действия 

Ампициллин 

широкий спектр 
действия 

Азлоциллин 

высокоактивен 
против 
синегнойной 
палочки

 

Радикалы полученные 
оргсинтезом R

1

,R

2

,R

3

 

48

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 4.             Использование «системы открытой для усложнения» в 
                        получении полусинтетических пенициллинов 
 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  4  5  6  7   ..