Курс лекций по биотехнологии - часть 5

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  3  4  5  6   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 5

 

 

 

33

или дискретность генов у млекопитающих и, соответственно, у человека. Эти 

гены  содержат  перемежающиеся  экзоны  и  интроны.  И  те,  и  другие 

переписываются, то есть в информационной РНК как первичном транскрипте 

отражены  как  экзоны,  так  и  интроны.  Интроны  из  первичного  транскрипта 

выбрасываются,  а  экзоны  «стыкуются»  друг  с  другом.  Возникает  зрелая 

информационная  РНК,  которая  и  становится  компонентом  рибосомальной 

матричной  системы.  Это  явление,  свойственное  только  эукариотам, 

называется сплайсинг.  

 Таким образом, нуклеотидные последовательности интронов информации на 

белки  не  передают.  Поскольку  сплайсинга  в  микробных  клетках  прокариот 

нет,  то  генные  инженеры,  чтобы  добиться  синтеза  человеческого  белка  в 

клетках  прокариот,  должны  переписать  зрелую  информационную  РНК 

человеческого  гена  с  помощью  фермента  обратной  транскриптазы  на  ДНК. 

После  этого  такую  укороченную  ДНК  (без  интронов)  можно  использовать 

для включения в вектор. 

Даже  отдельные  направления  генетической  инженерии  составляют  в 

настоящее время содержание фундаментальных монографий. Объем знаний в 

этой отрасли стремительно растет, а ее возможности быстро расширяются.

 

1.4.2.   Рекомбинантные белки как лекарственные средства 

Успехи  генетической  инженерии  привели  к  тому,  что  свыше  ста  белков 

человека (биорегуляторов, корректоров гомеостаза, факторов врожденного и 

приобретенного иммунитета) могут сохранять свою видоспецифичность. Они 

нарабатываются  как  лекарственные  средства  путем  микробиологического 

синтеза.  При  этом  технология  рекомбинантной  ДНК  позволяет  их 

совершенствовать - повышать  физиологическую  активность,  снижать 

вероятность побочных реакций после введения и т.д. Основной задачей при 

получении  рекомбинантных  белков  является  решение  проблемы  дефицита 

сырья, так как из человеческих тканей в промышленном масштабе получать 

их, естественно, невозможно. 

 

34

При  выборе  микроорганизма  (как  возможного  продуцента  чужеродного 

белка предполагаемого лекарственного препарата) принимается во внимание 

ряд обстоятельств:  

- необходимо наиболее полно изучить геном; 

- подробно исследовать метаболизм на уровне вида; 

-  желательно,  чтобы  микроорганизм  обладал  умеренной  патогенностью  (в 

идеале предполагается ее полное отсутствие); 

-  способность  микроорганизма  расти  в  условиях  производства  на 

недефицитных и экономически доступных средах. 

Избранные в качестве предполагаемых хозяев микроорганизмы оцениваются 

и  изучаются  уже  на  уровне  конкретных  штаммов.  При  необходимости 

штаммы-биообъекты  (как  хозяева  чужеродного  генетического  материала  и 

продуценты  чужеродного  белка)  могут  быть  усовершенствованы  методами 

генетической  инженерии,  что  позволяет  свести  к  минимуму  вероятность 

протеолиза  чужеродных  белков,  гидролиза  чужеродной  информационной 

РНК и «исключения» чужеродных генов из генома. Таким образом, в данном 

случае  общей  целью  является  ограничение  активности  способствующих 

гомеостазу клетки систем репарации, включающих нуклеазы и протеазы. 

Следует  отметить,  что  иногда  чужеродный  белок  может  откладываться  в 

клетке  продуцента  в  виде  белковых  гранул  (в  недоступной  для  протеаз 

форме), что характерно, например, для Escherichia coli. 

Особое внимание привлекает проблема секреции чужеродных белков, так как 

выделение  целевого  белка  в  высокоочищенном  виде  из  культуральной 

жидкости - задача  гораздо  более  легкая,  чем  выделение  его  из  клетки.  Как 

известно,  секретируемые  белки  отличаются  от  несекретируемых  тем,  что 

имеют  на N-терминусе  так  называемую  лидерную  последовательность 

аминокислотных остатков, которая способствует переносу их через мембрану 

клетки  в  среду.  На  последней  стадии  контакта  секретируемого  белка  с 

поверхностью  образовавшей  его  клетки  лидерная  последовательность 

 

35

отделяется  от  основной  полипептидной  цепи.  В  соответствии  с  этим, 

вводимый  в  микробную  клетку  чужеродный  ген  (точнее  оперон) 

подвергается  модификации:  либо  его  нуклеотидная  последовательность 

целенаправленно  увеличивается  таким  образом,  чтобы  в  чужеродном  белке 

оказывалась 

лидерная 

последовательность 

аминокислот; 

либо 

конструируются гибридные опероны с общим промотором, включающие ген 

чужеродного 

белка 

и 

ген 

секретируемого 

белка, 

лидерная 

последовательность которого извлекает из клетки чужеродный белок. Далее 

два  белка  разделяются  принятыми  химическими  или  ферментативными 

методами. 

В  качестве  продуцентов  рекомбинантных  белков  человека  чаще  других  в 

настоящее время используются: Escherichia coli (кишечная палочка), Bacillus 

subtilis (сенная  палочка), Saccharomyces cerevisiae (пекарские  дрожжи). 

Первые  два  микроорганизма - прокариоты,  последний - эукариот.  Эти 

организмы  достаточно  безопасны  однако,  попадание  их  (как  продуцентов 

того  или  иного  человеческого  белка)  в  окружающую  среду  по  ряду  причин 

нежелательно.  В  связи  с  этим  существуют  принятые  и  тщательно 

соблюдаемые правила работы с рекомбинантами. 

Безопасность должна соблюдаться как на генетическом, так и на физическом 

уровнях. Безопасность на генетическом уровне означает следующее: в геном 

продуцента  чужеродного  белка  (помимо  чужеродных  генов)  вносится  еще 

одно изменение – из него удаляются некоторые гены, например, те, которые 

участвуют 

в 

синтезе 

аминокислоты, 

существенной 

для 

роста 

микроорганизма. Иными словами, организм делается зависимым от наличия 

в  среде  этой  аминокислоты.  Если  же  клетки  данного  микроорганизма 

оказываются вне среды – они не размножаются, то есть опасность заражения 

территории предприятия культурой рекомбинанта значительно уменьшается. 

Нельзя  не  отметить,  что  сами  по  себе  продуценты  чужеродного  белка  не 

отличаются  высокой  способностью  к  выживанию  в  природных  условиях. 

 

36

Точнее,  они  утрачивают  способность  образовывать  не  нужный  им 

чужеродный  белок  за  счет  того,  что  потеря  этой  способности  ускоряет 

размножение  клеток,  в  то  время  как  медленно  размножающиеся  клетки, 

которые  продолжают  синтезировать  чужеродный  им  белок,  постепенно 

исчезают из популяции. 

Как  уже  говорилось,  меры  безопасности  принимаются  и  на  физическом 

уровне. Это означает, что на всех местах выброса газа производят установку 

микробиологических  фильтров.  После  завершения  рабочего  цикла  без 

разъединения  системы  (это  может  привести  к  понижению  давления  во  всех 

емкостях,  где  могут  оказаться  клетки  рекомбинанта,  так  как  вследствие 

нарушения  герметизации  воздух  вместе  с  чужеродными  клетками  будет 

втягиваться  в  систему),  осуществляют  стерилизацию  оборудования.  И 

последнее - на производстве должны соблюдаться все требования GMP. 

Все  перечисленное  выше,  в  равной  мере  относится  к  производству  любых 

рекомбинантных  белков.  В  качестве  примера  можно  взять  производство 

рекомбинантного инсулина. 

На  первом  месте  по  объему  производства  и  стоимости  продукции 

рекомбинантного  белка  как  лекарственного  средства  находится  хорошо 

известный  гормон – инсулин,  контролирующий  уровень  глюкозы  в  крови. 

Промышленное  производство  рекомбинантного  инсулина  было  впервые 

начато в 1982 году. В настоящее время его годовой оборот составляет около 

одной трети от общего оборота всех рекомбинантных белков, используемых 

в медицине. 

Инсулин  состоит  из  двух  полипептидных  цепей.  Цепь  «А»  содержит 21 

аминокислотный остаток, а цепь «В» - 30 аминокислотных остатков. Между 

собой цепь А и цепь В связаны двумя дисульфидными (- S-S-) связями. Еще 

одна  такая  связь  имеется  между  остатками  цистеина,  находящимися  в  А-

цепи.  Общая  стереоструктура  молекулы  поддерживается  этими  тремя 

 

37

дисульфидными  связями  и  любое  изменение  в  ней  ведет  к  исчезновению 

гормональной активности инсулина.  

Традиционный 

источник 

инсулина - поджелудочная 

железа 

сельскохозяйственных  животных  (свиньи  и  крупный  рогатый  скот).  Но 

используется  не  вся  железа,  а  лишь  ткань  так  называемых  «островков 

Лангерганса». Российский рынок ежегодно потребляет примерно одну тонну 

инсулина.  Подсчитано,  что  для  получения  такого  количества  инсулина 

требуется  приблизительно 35 млн.  голов  свиней.  Известно  также,  что 

количество  лиц,  нуждающихся  в  систематическом  введении  инсулина, 

ежегодно  возрастает  на  несколько  процентов,  поэтому  проблема  дефицита 

сырья  применительно  к  инсулину  животного  происхождения  существует  до 

сих  пор.  Однако  не  только  этим  обстоятельством  обусловлен  интерес  к 

рекомбинантному  инсулину,  получаемому  путем  микробиологического 

синтеза. Инсулин, выделяемый из поджелудочной железы свиней отличается 

от  инсулина  человека  на  один  аминокислотный  остаток.  Инсулин  крупного 

рогатого  скота - на  три.  Это  означает,  что  при  введении  их  человеку,  ему 

вводится белок (полипептид) иной видоспецифичности. Отсюда следует, что 

существует определенный процент случаев проявления аллергии. Также при 

парентеральном  введении  (особенно  у  детей)  может  наблюдаться  

болезненность.  Одновременно  приходится  сталкиваться  с  проблемой 

передозирования,  поскольку  в  случае  аллергии  инсулин  (как  антиген) 

частично нейтрализуется и, соответственно, вводить его необходимо больше. 

Кроме того, предшественник инсулина при его биосинтезе в животной ткани, 

так  называемый  проинсулин,  содержит  еще  одну  полипептидную  цепь 

(пептид  С).  Хотя  позднее  эта  цепь  отделяется  от  зрелой  (завершенной) 

формы  гормона,  однако  при  выделении  инсулина  из  животных  клеток,  от 

примеси  проинсулина  избавиться  трудно.  Как  раз  в  пептиде  С  видовые 

различия  аминокислотной  последовательности  гораздо  более  велики, (по 

сравнению  с  самим  инсулином),  то  есть  побочные  эффекты  инсулина 

 

38

животного  происхождения  в  значительной  степени  обусловлены  «чужим» 

пептидом. 

 

Рекомбинантный  инсулин  синтезируемый  в  микробной  клетке  лишен 

указанных недостатков, поскольку аминокислотная последовательность двух 

его цепей кодируется генами человека. В принципе, он идентичен инсулину 

из  человеческой  ткани.  Правда,  его  выделение  и  очистка  требует  особой 

тщательности,  так  как  в  этом  случае  необходимо  освобождаться  от 

микробных  липо-  и  гликопротеинов.  Их  примеси  в  рекомбинантном 

инсулине  вследствие  токсичности  могут  вызвать  нежелательные  побочные 

эффекты. Однако, это уже вопрос, относящийся к качеству отдельных серий 

препарата и культуре производства на данном предприятии. 

В настоящее время в производстве рекомбинантного инсулина конкурируют 

две  принципиально  различные  технологии.  В  первом  случае  в  клетки 

микроорганизма-хозяина вводят плазмиду, содержащую последовательность 

нуклеотидов,  соответствующую  проинсулину  (цепи  А,  С-пептиду,  цепи  В  и 

далее лидерному пептиду и промоторному участку). В дальнейшем С-пептид 

отделяется. 

Особенность второго метода - раздельное получение цепи А и цепи В в двух 

микробных культурах, которые впоследствии объединяются.  

В  лабораториях  одной  из  зарубежных  фирм  разработана  схема  получения 

рекомбинантного  инсулина,  основанная  на  раздельном  биосинтезе  двух  его 

цепей;  каждая  цепь  синтезируется  в  отдельной  культуре Escherichia coli. 

Предварительно  на  основе  плазмид  конструировались  векторы  (один - для 

гена  цепи  А,  другой - для  гена  цепи  В).  К  каждой  последовательности 

присоединялся  триплет,  соответствующий  метионину  и  нуклеотидам  гена 

индуцибельного  фермента  бетагалактозидазы,  включая  оперон.  Таким 

образом,  между  нуклеотидными  последовательностями  цепей  А,  В  и 

бетагалактозидазы  оказывался  метиониновый  триплет.  Это  обстоятельство 

является очень важным для завершающей стадии работы. Ферментация двух 

 

39

культур  с  вектором  несущим  цепь  А  и  вектором  несущим  цепь  В, 

проводилась  на  среде  с  лактозой  (индуктором  синтеза  бетагалактозидазы). 

Если не расщепить глюкозу, то она может быть использована организмом как 

источник  энергии.  Поскольку  бетагалактозидаза  и  цепь  А  (или  В)  имели  в 

векторе общий промотор, то накопление бетагалактозидазы сопровождалось 

накоплением больших количеств связанной с ней цепи А (В). По окончании 

ферментации  из  двух  культур  выделялись  два  белка:  цепь  А  плюс 

бетагалактозидаза и цепь В плюс бетагалактозидаза. Метиониновый остаток, 

связывающий каждую инсулиновую цепь с бетагалактозидазой, разрушался с 

помощью ВrCN, а инсулиновые цепи при этом освобождались и выделялись.  

На последнем (чисто химическом) этапе работы производилось объединение 

цепей А и В в молекулу инсулина (за счет двух дисульфидных связей; третья 

дисульфидная связь формируется между остатками цистеина в цепи А).  

Гормон роста (соматотропин). 

В  клинике  испытан  еще  один  рекомбинантный  белок,  полученный  методом 

микробиологического  синтеза - гормон  роста  человека,  который 

секретируется  передней  долей  гипофиза  и  содержит 191 аминокислотный 

остаток. В организме человека этот гормон необходим для роста костей. При 

внутриутробном  развитии  он  не  нужен,  однако,  его  недостаточность  резко 

проявляется в позднем детском возрасте и приводит к карликовости. 

Ген  гормона  роста  человека  клонирован  в Escherichia coli. Биологическая 

активность  выделенного  белка  была  идентична  образцу,  полученному  из 

гипофиза.  Следует  также  отметить,  что  интенсивно  ведутся  работы  по 

повышению  избирательности  действия  гормона  роста  (уменьшению  его 

связывания с рецептором пролактина). 

Эритропоэтин. 

Эритропоэтин является гликопротеином, который необходим для созревания 

(дифференцировки)  эритроцитоидных  клеток.  Белок  видоспецифичен, 

вырабатывается  в  почках.  Эритропоэтин  нужен  при  анемии,  вызываемой 

 

40

почечной  недостаточностью,  а  также  при  анемиях,  которые  могут 

наблюдаться  при  гемотрансфузии,  облучении  и  химиотерапии  опухолей;  то 

есть всюду, где может происходить угнетение кроветворения.  

В США свыше ста тысяч человек получают по две инъекции эритропоэтина в 

неделю  (ампулы  эритропоэтина  в  цитратном  буфере  по 2000-4000 ЕД., 

которые содержат также сывороточный альбумин).   Своеобразный  интерес 

представляет  факт,  относящийся  к  эритропоэтину:  во  время  олимпийских 

игр  и  других  международных  соревнований  имеют  место  случаи 

дисквалификации 

спортсменов, 

которые 

злоупотребляют 

данным 

препаратом. 

Способ 

получения 

рекомбинантного 

эритропоэтина 

(необходимо 

подчеркнуть, гликопротеина) имеет важную особенность - ген эритропоэтина 

человека  встраивается  не  в  микробные,  а  в  животные  клетки  (яйцеклетки 

китайского  хомячка),  где  белок  может  быть  гликозилирован.  При  этом, 

продуцентом эритропоэтина является монослойная культура этих клеток.  

Пептидные факторы роста тканей. 

Эти многочисленные биорегуляторы обладают как видоспецифичностью, так 

и  тканевой  специфичностью.  Иногда  применительно  к  ним  используется 

определение - «гормоны,  образуемые  вне  желез  внутренней  секреции».  Их 

наработка 

для 

медицинской 

практики 

возможна 

лишь 

путем 

микробиологического  синтеза,  то  есть  как  рекомбинантных  белков.  В 

настоящее  время  подробно  изучены  эпидермальный  фактор  роста  (ЭФР)  и 

некоторые другие. Исследования в этом направлении продолжаются, но уже 

сейчас  получены  положительные  результаты  в  экспериментах  (например, 

ускорение  заживления  ран  при  использовании  ЭФР)  однако,  остается 

нерешенным  вопрос  о  полной  гарантии  от  возможности  злокачественного 

перерождения тканей.  

Рекомбинантные белковые факторы врожденного иммунитета. 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  3  4  5  6   ..