Курс лекций по биотехнологии - часть 4

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  2  3  4  5   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 4

 

 

 

25

    Отбор  «плюс»  вариантов  затруднений  не  вызывает,  однако  добиться  их 

длительного  использования  в  производстве  далеко  не  просто.  После 

нескольких  пересевов  их  производительность,  постепенно  снижаясь, 

приближается  к  производительности  исходной  культуры.  Причины  этого 

явления  недостаточно  ясны.  По-видимому,  репарационные  системы 

культуры приближают ее биосинтетические показатели к естественным.  Для 

того,  чтобы  замедлить  возвращение  «плюс»  вариантов  к  исходным 

показателям,  предлагаются  два  пути.  Один  из  них – обработка  «плюс» 

вариантов  мутагенами  и  отбор  мутантов  с  пониженной  способностью  к 

возвращению  измененных  участков  ДНК  к  норме.  Второй  путь  связан  с 

возможностью  использования    инженерной  энзимологии,  точнее, 

иммобилизованных  биообъектов.  Предлагается  иммобилизовывать  клетки 

«плюс»  варианта,  то  есть  связывать  их  с  нерастворимым  носителем  и 

использовать  в  производстве,  не  прибегая  к  пересевам  в  течение 

определенного  времени  (от  нескольких  недель  до  нескольких  месяцев). 

Технически это довольно непросто, однако, такой путь представляет интерес, 

как новое направление в биотехнологии – сочетание клеточной инженерии с 

инженерной энзимологией непосредственно в производстве. 

    В заключение надо отметить, что протопласты – основной объект, которым 

оперирует  клеточная  инженерия,  довольно  широко  используются  и  в 

генетической  инженерии.  При  этом  трансформация  протопластов 

молекулами  и  фрагментами  молекулы  ДНК  достигается  легче,  чем 

трансформация клеток с их более сложной оболочкой. 

1.4.   Создание биообъектов методами генетической инженерии 

1.4.1.   Общая характеристика 

Генетическая инженерия по сравнению с клеточной гораздо конкретнее 

и точнее по характеристике используемых объектов и оперирует, в основном, 

с различными по форме и размерам фрагментами клетки. 

 

26

Следует  сразу  же  отметить,  что  термины  генетическая  инженерия,  генная 

инженерия, а также рекомбинантная ДНК – равноценны.  

Понятие генетической  инженерии имеет очень широкий спектр и поэтому не 

может быть сформулировано в кратком виде. В качестве одного из вариантов 

определения этого понятия генетическую инженерию можно представить как 

соединение  фрагментов  ДНК  различного  происхождения  (природного, 

синтетического  или  комбинацию  тех  и  других  одновременно) in vitro с 

последующим  введением  полученных  рекомбинантных  структур  в  живую 

клетку  для  того,  чтобы  введенный  фрагмент  ДНК  после  включения  его  в 

хромосому  либо  реплицировался,  либо  автономно  экспрессировался. 

Следовательно, вводимый генетический материал становится частью генома 

клетки.  

Прежде,  чем  перечислить  этапы  работы  генного  инженера  следует  указать, 

что он должен иметь в своем распоряжении: 

а)  генетический материал (клетка – хозяин); 

б)  транспортное устройство – вектор, переносящий генетический материал в 

клетку; 

в)   набор специфических ферментов, которые являются  

«инструментами» генного инженера. 

Принципы  и  методы  генетической  инженерии  отработаны  прежде  всего  на 

микроорганизмах,  а  именно,  на  бактериях – прокариотах;  и  дрожжах – 

эукариотах. 

Наибольшие практические успехи генетической инженерии применительно к 

биотехнологии  лекарственных  средств  достигнуты  в  настоящее  время  в 

области 

создания 

штаммов 

микроорганизмов - продуцентов 

видоспецифичных  для  человека  белков.  Такие  белки  для  микробной  клетки 

являются  чужеродными,  в  организме  же  человека  одни  из  них  играют  роль 

биорегуляторов  (белковые  гормоны),  другие – факторов  врожденного 

иммунитета (интерфероны и т.д.) 

 

27

Стратегической  целью  генного  инженера  является  создание  принципиально 

нового биообъекта для биотехнологического производства – микроорганизма 

с человеческим геном. 

При  выборе  микроорганизма  как    потенциального  продуцента  учитывается 

ряд обстоятельств: 

1.  Поскольку  микроорганизм  будет  выращиваться  в  производственных 

условиях  в  большом  количестве  и  с  ним  будут  контактировать  многие 

работники предприятия (биологи, химики и др.), то желательно, чтобы он не 

был  патогенным.  Кроме  того,  целевой  генно-инженерный  продукт, 

выделяемый  из  микроорганизма,  должен  иметь  гарантии  отсутствия  даже 

следов микробных токсинов.  

2. Проникший в клетку микроорганизма вектор с чужеродным для неё геном 

(или кластером генов) не должен расщепляться эндонуклеазами этой клетки, 

то  есть  генетический  материал  должен  сохраняться.  При  этом  рибосомы 

потенциального  продуцента  должны  воспринимать  информационную  РНК, 

соответствующую чужеродному материалу. 

3.  Образовавшийся  чужеродный  для  клетки  белок  (для  биотехнолога - 

целевой продукт) не должен расщепляться ее протеазами, то есть - не должен 

подвергаться  воздействию  систем  репарации  клетки,  гидролизующих 

чужеродные белки. Ослабление действия таких систем, также является одним 

из предварительных этапов работы генного инженера с продуцентом. 

4.  Наконец,  желательно,  чтобы  у  потенциального  продуцента  чужеродного 

белка  (целевого  продукта),  последний  выводился  из  клетки  в  питательную 

среду, что значительно облегчит его последующее выделение и очистку. 

   Однако,  такая  предварительная  работа  генного  инженера  начинается  с 

самого  гена,  кодирующего  целевой  белок.  К  этому  гену  присоединяется 

нуклеотидная  последовательность,  в  свою  очередь,  кодирующая  так 

называемую  лидерную  последовательность  аминокислот  (преимущественно 

гидрофобных). Синтезированный в клетке целевой продукт с такой лидерной 

 

28

последовательностью аминокислот, с их помощью проходит через липидные 

слои  цитоплазматической  мембраны  из  клетки  наружу.  Однако,  в  этом 

случае  клетка  продуцента  должна  быть  изменена  генным  инженером.  В 

частности,  в  мембране  должна  находиться  "сигнальная  протеаза", 

отщепляющая  от  генного  продукта  лидерную  последовательность 

аминокислот перед его выходом в среду. 

Далее,  для  того,  чтобы  вектор  с  чужеродным  геном  проник  в  клетку,  их 

подвергают специальной обработке солями лития или кальция, в зависимости 

от  вида  микроорганизма.  В  результате,  в  стенке  оболочек  клеток 

формируются  небольшого  диаметра  отверстия,  через  которые  в  клетку 

проникают  молекулы  вектора.  Обработанные  таким  путем  клетки  получили 

название  компетентных.  Они  способны  воспринимать  информацию, 

переносимую вектором. 

Важным предварительным этапом работы генного инженера является подбор 

вектора.  Векторы,  используемые  при  работе  с  микроорганизмами, 

конструируются  чаще  всего  на  основе  умеренных  фагов  или  плазмид. 

Преимущество плазмид перед фагами заключается в отсутствии возможности 

лизиса  клетки,  который  может  иметь  место  при  работе  с  умеренными 

фагами. 

При  создании  нового  рекомбинантного  продуцента  ключевым  моментом  в 

работе  генного  инженера  является  встраивание  гена  (кластера  генов)  в 

вектор,  точнее  в  ДНК  векторной  молекулы,  например,  в  плазмиду.  Это 

становится  возможным  благодаря  тому,  что  в  распоряжении  генных 

инженеров 

имеется 

большой 

набор 

различных 

по 

субстратной 

специфичности  эндонуклеаз,  получивших  рабочий  термин  рестриктазы  (от 

англ.restriction – разрезание).  В  настоящее  время  известны  многие  десятки 

различных  рестриктаз,  которые  дифференцируют  на  рестриктазы 

разрезающие либо одну из двух комплементарных нитей ДНК, либо - сразу 

обе  нити.  Для  биотехнолога,  в  первую  очередь,  представляют  интерес 

 

29

рестриктазы,  катализирующие  разрез  только  одной  нити  в  углеводно-

фосфатной  цепи  ДНК.  Помимо  этого  важно,  чтобы  рестриктаза,  которая 

будет  разрезать  эту  нить,  была  бы  достаточно  высоко  специфична.  Это 

значит,  что  последовательность  нуклеотидов,  обязательная  для  выбора 

данной  рестриктазой  места  разреза  углеводно-фосфатного  каркаса  ДНК, 

должна  быть  относительно  велика.  Например,  часто  используемая  в  генно-

инженерных  исследованиях  рестриктаза EcoRI (была  выделена  из  E.coli

распознает  нуклеотидную  последовательность  в  том  случае,  если  азотистые 

основания располагаются в ней в таком порядке: -GAATTC-; разрез (разрыв) 

углеводно-фосфатного  каркаса  одной  из  двух  комплементарных  нитей  ДНК 

происходит  между G и A. Однако,  вторая  комплементарная  нить  имеет 

фактически 

одинаковую 

последовательность: -CTTAAG-. Поэтому 

рестриктаза  расщепляет  и  вторую  нить,  также  между G и A. Как  видно  из 

схематического  рисунка,  разрезы  отстоят  друг  от  друга  на  четыре  пары 

нуклеотидов (рис. .3).  

 
 
место действия рестриктаз 
 
 

 —

G

A

A

T

T

C

— 

           |          |           |           |          |           | 
           |          |           |           |          |           | 

 —

C

— 

T

T

A

A

G

 

 
 
                                             место действия рестриктаз                
                                                                
 
 
G - гуанидин 
A - аденин 
T - тимидин 
C - цитозин 
 
 

Рис.3               Схема расщепления рестриктазой  двухцепочечной ДНК

 

 

 

30

 

Таким  образом,  сохраняя  свою  субстратную  специфичность  рестриктаза, 

способная  к  расщеплению  одной  нити,  разрезает  фактически  обе,  при  этом 

разрезы находятся не друг против друга, а на некотором расстоянии друг от 

друга.  В  результате,  комплементарные  нити  расходятся  вследствие 

непрочности водородных связей между основаниями в каждой нуклеотидной 

паре  и  создаются  однонитиевые  участки,  которые  согласно  рабочей 

терминологии называются «липкие концы». Образно говоря, в двухнитиевой 

ДНК появляется щель, с двух сторон которой находится по липкому концу. В 

эту  щель  может  быть  встроен  ген,  то  есть  фрагмент  ДНК,  если  он 

фланкирован  однонитевыми  участками,  комплементарными  однонитевым 

липким  концам,  которые  были  сформированы  в  результате  действия 

рестриктазы  на  вектор.  Чтобы  подготовить  включение  гена  в  вектор  надо 

использовать  рестриктазу  той  же  специфичности.  Если  для  образования 

липких  концов  в  векторе  применялась  рестриктаза EcoRI, то  её  и  следует 

применять  для  образования  липких  концов  во  встраиваемом  фрагменте. 

Разумеется,  липкие  концы  не  должны  образовываться  в  самом  гене.  Здесь 

выявляется 

преимущество 

рестриктаз 

распознающих 

длинные 

последовательности по порядку расположения пар нуклеотидов. Количество 

таких  последовательностей  в  молекуле  ДНК,  которые  обнаруживает 

рестриктаза,  резко  уменьшается  по  мере  возрастания  в  них  числа  пар 

нуклеотидов. 

Следовательно, 

уменьшается 

возможность 

повредить 

рестриктазой  сам  ген,  который  оказывается  между  местами  «посадки» 

молекул  рестриктазы  на  ее  субстрат,  то  есть  ДНК  включается  в  вектор  в 

неповрежденном виде.  

Другой  прием,  который  может  быть  использован  генным  инженером - 

фланкирование гена синтетическими последовательностями нуклеотидов, то 

есть получение методами биоорганической химии липких концов с заданным 

порядком нуклеотидов. 

 

31

Ген (или кластер генов), встроившийся в вектор, удерживается в нем вначале 

только  за  счет  водородных  связей  между  комплементарными  липкими 

концами.  Эта  стадия  получила  название  «отжига».  Для  того,  чтобы  ген 

оказался  прочно  встроенным  в  вектор,  необходимо  его  закрепление  за  счет 

ковалентных  связей.  Для  этих  целей  служат  ферменты-лигазы  (от  слова 

лигировать – сшивать),  замыкающие  разрывы  в  углеводно-фосфатном 

каркасе ДНК. После этой стадии работы генного инженера вектор с прочно 

закрепленным  в  нем  геном  может  вводиться  в  микробную  клетку.  Однако, 

процент  успешного  включения  вектора  в  клетку,  как  правило,  крайне 

невелик.  

Суспензия  клеток  микроорганизма  с  вектором  после  инкубации  высевается 

на  твердую  питательную  среду,  а  затем  выросшие  колонии  переносятся  на 

агаровый  косяк.  Полученные  культуры  (клоны)  должны  быть  проверены  на 

содержание  в  их  клетках  вектора  с  геном  (кластером  генов),  кодирующим 

целевой  продукт,  например,  видоспецифичный  для  человека  белковый 

гормон или видоспецифичный фактор врожденного иммунитета и т.п. 

Если  малая  частота  включения  в  клетку  вектора  означает,  что  вектор 

воспринимают лишь 0,1-0,01% клеток, то легко представить, какое огромное 

количество  культур  надо  проверить,  чтобы  обнаружить  культуру, 

синтезирующую  целевой  продукт.  Для  обнаружения  этого  продукта  по  его 

функции, надо  предварительно  его  выявить, выделить, очистить и испытать 

in vitro    или  в  опытах  на  животных.  Однако,  анализировать  таким  образом  

тысячи  культур  практически  невозможно.  В  связи  с  этим  разработан  метод 

предварительного отбора клонов, содержащих вектор. 

Вводится  понятие  гена-маркера.  Такой  ген  «легко»  заявляет  о  себе,  то  есть 

маркирует клетку и, соответственно, клон. Ген-маркер также встраивается в 

вектор, но, разумеется, с помощью другой рестриктазы, выбирающей другую 

последовательность  нуклеотидов,  так  что  встраивание  его  в  «рабочий»  ген 

заранее исключено. Ген-маркер занимает «свое» место в векторе. Этот ген не 

 

32

будет иметь никакого значения в будущем биотехнологическом процессе, но 

он нужен для отбора продуцента целевого продукта, кодируемого «рабочим» 

геном.  Примером  гена-маркера  может  быть  ген,  кодирующий  фермент 

беталактамазу.  Этот  фермент  инактивирует  беталактамные  антибиотики, 

катализируя гидролиз их беталактамного кольца. 

Клетки E.Coli, микроорганизма  часто  используемого  при  производстве 

белков человека генно-инженерным путем, проверяются на проникновение в 

них  вектора  с  двумя  генами – «рабочим»  и «маркером»;  затем их высевают 

на  твердую  питательную  среду  с  ампициллином  (антибиотиком    широкого 

спектра  действия).  Так  как  исходная  культура E.coli чувствительна  к 

ампициллину, то ее появление на среде в виде выросшей колонии, означает, 

что  ампициллин  был  разрушен  беталактамазой;  в  свою  очередь,  эта 

беталактамаза может кодироваться только геном, находящимся в векторе, так 

как в исходных клетках такого гена нет. Это означает, что в вектор, помимо 

гена-маркера,  был  включен  и  ген,  кодирующий  целевой  продукт.  Далее, 

культуру  проверяют  на  наличие  способности  образовывать  человеческий 

видоспецифический  белок.  Количество  культур,  подлежащих  прямой, 

длительной и трудоемкой проверке, уменьшается с помощью гена-маркера в 

сотни  раз. В  результате  вся  работа  по  отбору рекомбинантных  продуцентов 

значительно упрощается. Следует отметить, что иногда в вектор вводятся два 

разных гена- маркера. Это еще более повышает результативность и точность 

отбора клонов с геном, кодирующим целевой продукт. 

Гены  у  микроорганизмов  соответствуют  «первоначальному»  или 

классическому представлению о гене, то есть, структурный ген - это участок 

ДНК,  переписывающийся  на  информационную  РНК.  Последняя  по  порядку 

расположения  кодонов  отражается  на  аминокислотной  последовательности 

белка.  

У  эукариот  большинство  структурных  генов  в  плане  передачи  информации 

функционируют  иначе.  Сравнительно  недавно  была  открыта  прерывистость 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  2  3  4  5   ..