Курс лекций по биотехнологии - часть 3

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  1  2  3  4   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 3

 

 

 

17

сейчас  в 100000 раз  выше,  чем  у  обнаруженного  А.Флемингом  исходного 

штамма, с которого началась история открытия пенициллина. 

Необходимо  отметить,  что  производственные  штаммы  (штамм – это 

клоновая  культура,  однородность  которой  по  определенным  признакам 

поддерживается 

отбором; 

применительно 

к 

биотехнологическому 

производству - производственный штамм) с такой высокой продуктивностью 

(это относится не только к пенициллину, но и к другим целевым продуктам) 

являются  крайне  нестабильными.  Это  происходит  вследствие  того,  что 

многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по 

себе  для  жизнеспособности  клеток  штамма  положительного  значения  не 

имеют.  Поэтому  мутантные  штаммы  требуют  постоянного  контроля  при 

хранении: популяция клеток высеивается на твердую среду и полученные из 

отдельных  колоний  культуры  проверяются  на  продуктивность.  При  этом 

ревертанты  (культуры  с  пониженной  активностью) - отбрасываются. 

Реверсия  объясняется  обратными  спонтанными  мутациями  ведущими  к 

возвращению  участка  генома  (конкретного  фрагмента  ДНК)  к  его 

первоначальному  состоянию.  Специальные  ферментные  системы  репарации 

участвуют в реверсии к норме, которая является эволюционным механизмом 

поддержания постоянства вида.   

Совершенствование  биообъектов  применительно  к  производству  не 

исчерпывается  только  повышением  их  продуктивности.  Хотя  это 

направление,  несомненно,  является  главным,  оно  не  может  быть 

единственным,  учитывая,  что  успешная  работа  биотехнологического 

производства определяется многими факторами. Так, с экономической точки 

зрения,  весьма  важно  получение  мутантов,  способных  использовать  более 

дешевые  и  менее  дефицитные  питательные  среды.  Если    для  работы  в 

исследовательской  лаборатории  дорогие  среды  не  создают  особых 

финансовых проблем, то при крупнотоннажном производстве понижение их 

 

18

стоимости  (хотя  и  без  увеличения  уровня  активности  продуцента) - крайне 

важно.  

Другой  пример:  в  случае  некоторых  биообъектов  культуральная  жидкость 

после  окончания  ферментации  имеет  неблагоприятные  в  технологическом 

отношении  реологические  свойства.  Поэтому  в  цехе  выделения  и  очистки 

целевого  продукта,  работая  с  культуральной  жидкостью  повышенной 

вязкости,  сталкиваются  с  трудностями  при  использовании  сепараторов, 

фильтр-прессов  и  т.д.  Мутации,  соответствующим  образом  меняющие 

метаболизм биообъекта, в значительной мере снимают эти трудности.  

Также  большое  значение  в  отношении  гарантии  надежности  производства 

приобретает 

получение 

фагоустойчивых 

биообъектов. 

Выполнение 

требований    по  соблюдению  асептических  условий  при  проведении 

ферментации  прежде  всего  касается  предотвращения  попадания  в  посевной 

материал  (а  также  в  ферментационный аппарат) клеток  и  спор посторонних 

бактерий  и  грибов  (в  более  редких  случаях  водорослей  и  простейших). 

Предотвратить проникновение в ферментер фагов вместе с технологическим 

воздухом,  стерилизуемым  путем  фильтрации - крайне  трудно.  Не  случайно 

вирусы  в  первые  годы  после  их  открытия  именовались  именно  как 

«фильтрующиеся 

вирусы». 

Поэтому, 

основной 

путь 

борьбы 

с 

бактериофагами,  актинофагами  и  фагами  поражающими  грибы – это 

получение устойчивых к ним мутантных форм биообъектов. 

 

Не касаясь специальных случаев работы с биообъектами  - патогенами,  

следует  подчеркнуть,  что  иногда  задача  совершенствования  биообъектов 

исходит  из  требований  промышленной  гигиены.  Например,  выделенный  из 

природного  источника  продуцент  одного  из  важных  беталактамных 

антибиотиков  в  значительном  количестве    образовывал  летучие  вещества  с 

неприятным запахом гниющих овощей. Мутации, ведущие к удалению генов, 

кодирующих  ферменты,  участвующие  в  синтезе  таких  летучих  веществ, 

 

19

приобрели  в  данном  случае  фактически  практическое  значение  для 

производства. 

 

Из  всего    выше  изложенного  следует,  что  современный  биообъект 

используемый в биотехнологической промышленности - это суперпродуцент, 

который    отличается  от  исходного  природного  штамма,  как  правило,  не  по 

одному,  а  по  нескольким  показателям.  Хранение  таких  штаммов - 

суперпродуцентов представляет серьезную самостоятельную проблему.  При 

всех  способах  хранения  их  необходимо  периодически  пересеивать  и 

проверять как на продуктивность, так и на другие важные для производства 

свойства. 

 

В  случае  применения  высших  растений  и  животных  в  качестве 

биообъектов  для  получения  лекарственных  средств,  возможности 

использования  мутагенеза  и  селекции  для  их  совершенствования 

ограничены. Однако,  в принципе, мутагенез и селекция здесь не  исключены. 

Особенно  это  относится  к  растениям,  образующим  вторичные  метаболиты, 

которые используются как лекарственные вещества. 

1.3. Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии. 

В  течение  многих  лет  мутагенез  и  селекция  успешно  применялись  и  будут 

широко применяться при совершенствовании биообъектов и в дальнейшем. 

Однако  постепенно  были  выявлены  существенные  ограничения  в 

достижении ставящихся биотехнологами целей. И хотя главный путь снятия 

таких ограничений связан с применением методов генетической инженерии, 

определенные перспективы в настоящее время  имеет и клеточная инженерия 

- «насильственный»  обмен  участками  хромосом  у  прокариот  или  участками 

или даже целыми хромосомами у эуариот (рис. 2).  

 

 

20

 

1.  Ферментативная деградация клеточной стенки 
2.  Слияние протопластов 
3.  Ломка и рекомбинация хромосом. Образование диплоидов 
4.  Образование гаплоидов с рекомбинантной хромосомой 
5.  Регенерация протопластов                                    

Рис.2              Формирование протопластов у прокариот

 

Прокариот 1 

Прокариот 2 
 
 

1

1

2

2

3

4

5

5

 

21

В результате создаются неприродные биообъекты, среди которых могут быть 

отобраны  продуценты  новых  веществ  или  организмы  с  ценными  в 

практическом отношении свойствами. 

     Перспективы клеточной инженерии  заключаются прежде всего в том, что 

с  ее  помощью  возможно  получение  межвидовых  и  межродовых  гибридных 

культур  микроорганизмов,  а  также - получение  гибридных  клеток  между 

отдаленными  в  эволюционном  отношении  многоклеточными  организмами. 

Материал,  относящийся  к  получению  гибридов  (гибридов  между 

лимфоцитами  и  опухолевыми  клетками)  и  их  практическом  значении 

излагается    в  главе  «Иммунобиотехнология  лекарственных  средств».  В 

рамках  данного  раздела  рассматривается  техника  клеточной  инженерии 

применительно к микроорганизмам и в соответствии с теми целями, которые 

ставятся  перед  ними  как  биообъектами.  В  качестве  наиболее  простого 

примера  можно  взять  микроорганизмы  прокариот  (с  одной  хромосомой  в 

клетке).  Для  того,  чтобы  осуществить  обмен  фрагментами  хромосомы  у 

прокариот  необходимо  предварительно  получить  из  их  клеток  лишенные 

клеточной  стенки  протопласты;  затем  осуществить  слияние  (фузию) 

протопластов 

с 

образованием 

диплоидов; 

полученные 

диплоиды 

инкубировать  в  течение  нескольких  часов,  для  того  чтобы  произвести 

«ломку»  и  воссоединение  кольцевых  хромосомных  нитей  в  разных 

вариантах.  Далее  суспензия  протопластов  высевается  на  твердую 

питательную  среду,  при  этом  часть  диплоидов  превращается  в  гаплоиды  -    

способные  к  размножению  клетки,  которые  затем  образуют  соответственно 

колонии.  Последние  изучаются  и  отбираются  те  культуры,  которые 

приобретают  новые  качества,  представляющие  интерес  для  биотехнолога. 

Таким образом, первый этап работы связан с удалением у микроорганизмов 

клеточной  стенки.  У    прокариот  (как  эубактерий,  так  и  актиномицетов,  то 

есть  многоклеточных  бактерий)  клеточная  стенка  состоит  из    жесткого 

полимера 

пептидогликана, 

поддерживающего 

форму 

клетки 

и 

 

22

обеспечивающего  защиту  цитоплазматической  мембраны  от  перепада 

осмотического давления между внешней средой и цитоплазмой. 

     Пептидогликан  может  быть  расщеплен  с  помощью  ферментов  (гидролаз 

пептидогликана),  из  которых  самым  известным  является  лизоцим, 

расщепляющий  полисахаридные  нити  пептидогликана.  Источником 

лизоцима, как лабораторного реагента является обычно белок куриного яйца. 

Необходимо  отметить,  что  ферментативная  деградация  клеточной  стенки  в 

обычных условиях культивирования бактерий сразу же ведет к их лизису из-

за  разницы  в  осмотическом  давлении.  При  этом  ни  цитоплазматическая 

мембрана,  ни  внешняя  (у  грамотрицательных  бактерий)  мембрана  не 

выдерживают  своей  целостности.  Этим  давно  известным  явлением 

объясняется, например,  литический эффект пенициллина, который, подавляя 

синтез  пептидогликана,  нарушает  баланс  между  действием  его  синтетаз  и 

гидролаз. 

   Из  вышеизложенного  следует,  что  удалить  клеточную  стенку  и  в  тоже 

время сохранить целостность мембраны протопласта можно лишь, выровняв 

осмотическое  давление  внутри  клетки  и  в  среде.  Этот  простой  путь,  тем  не 

менее, долгое время оставался неизвестным, пока Дж. Ледерберг не показал 

его реальность. С тех пор работы по клеточной инженерии микроорганизмов 

базируются на протопластировании: для получения протопластов клеточную 

стенку  удаляют  ферментативной  обработкой  в  «гипертонической»  среде    с 

20%  раствором  сахарозы  или  маннита,  иногда  с 10% раствором  натрия 

хлорида  в  зависимости  от  определенных  особенностей  биообъекта  и 

преследуемых  целей.  Превращение  суспензии  клеток  в  суспензию 

протопластов 

обычно 

контролируют 

методом 

фазово-контрастной 

микроскопии. 

    Если  биообъект  принадлежит  к  микроскопическим  грибам  (плесневые 

грибы и дрожжи), то для получения протопластов используют, как правило, 

не  лизоцим,  а  комплексный  ферментный  препарат,  выделенный  из 

 

23

пищеварительного тракта виноградной улитки  Helix pomatia. Связано это  с 

тем,  что  клеточная  стенка  у  грибов  более  сложная  по  составу,  чем  у 

бактерий.  Она  состоит  из  таких  полимеров  как  хитин,  глюканы, 

маннопротеин, для каждого из которых необходим свой, деградирующий его 

фермент.  Общепризнанно,  что  по  набору  ферментов  и  их  каталитической 

активности  наиболее  эффективным  является  желудочный  сок  виноградной 

улитки  в  ранний  весенний  сезон,  когда  улитки  появляются  на  виноградных 

плантациях, но их желудок еще не заполнен перевариваемыми виноградными 

листьями. Неочищенный экстракт из  пищеварительного тракта виноградной 

улитки  лиофильно  высушивается  и  используется  как  комплексный 

ферментный препарат для получения протопластов из клеток грибов. 

     Следующий этап работы состоит в объединении суспензий двух образцов 

протопластов,  то  есть  протопластов,  принадлежащих  разным  штаммам  или 

разным  видам,  в  более  редких  случаях,  даже  разным  родам.  Добиться 

слияния  двух  протопластов  разного  происхождения – довольно  сложная 

задача.  Частота  слияния  резко  повышается  при  добавлении  к  протопластам 

полиэтиленгликоля,  обладающего  свойствами  детергента.  В  случае 

прокариот, образующиеся протопласты имеют двойной набор хромосомного 

материала,  то  есть,  это  протопласты  с  двумя  хромосомами.  В 

гипертонической  среде  такие  протопласты  сохраняют  свою  целостность. 

После  промывания  гипертонической  средой,  но  уже  не  содержащей  

гидролизующего  клеточную  стенку  ферментного  препарата,  протопласты 

высеиваются на твердую питательную среду. При этом у определенной части 

протопластов  диплоидные  формы  переходят  в  гаплоидные;  в  результате, 

образуются  способные  к  размножению  нормальные  клетки  с  клеточной 

стенкой. Эти клетки формируют на твердой среде колонии. Однако, во время 

нахождения  протопластов  в  диплоидной  форме,  в  некоторых  из  них 

происходит  «ломка»  и  воссоединение  хромосомных  нитей,  при  котором  в 

одну  хромосому  может  включиться  фрагмент  другой.  Таким  образом,  при 

 

24

регенерации  протопластов,  происходит  формирование  нормальных  клеток, 

часть  из  которых  имеет  гибридные  хромосомы.  Культуры  таких  клеток 

обладают  новыми  свойствами.  В  качестве  примера  можно  привести 

получение «гибридных» антибиотиков. 

    Известно,  что  среди  актиномицетов  есть  принадлежащие  к  разным  видам 

продуценты  антибиотиков    гликозидной  структуры  с  варьирующими 

агликонами и сахарами. Так, антибиотик эритромицин имеет 14-ти членный 

макроциклический  агликон  и  два  сахара  (дезозамин  и  кладинозу), 

присоединенных  к  нему  гликозидной  связью;  а  у  антибиотиков – 

антрациклинов  агликон  состоит  из  четырех  сконденсированных углеродных 

шестичленных колец, соединенных с аминосахаром. 

    С  помощью  клеточной  инженерии    были  получены  продуценты  таких 

антибиотиков, у которых макролидный агликон эритромицина  был связан с 

углеводной  частью,  соответствующей  антрациклинам  и,  наоборот, 

антрациклиновый  агликон  с  сахарами,  свойственными  эритромицину.      

Аналогичные  работы  ведутся  по  получению  гибридных  беталактамных 

антибиотиков. 

    Оценивая  перспективы  использования  процедуры  протопластирования  в 

биотехнологии следует отметить, что слияние даже принадлежащих к одной 

популяции  протопластов  с  последующей  их  регенерацией  могут  привести  к 

тому,  что  гены  биосинтеза  целевого  продукта  окажутся  в  одном  гаплоиде  в 

удвоенном    состоянии    (его  хромосома  будет  обогащена  двумя  кластерами 

генов  биосинтеза).  Иными  словами,  в  одной  хромосоме  сосредоточится 

биосинтетический  потенциал  (применительно    к  целевому  продукту)  двух 

хромосом. Разумеется, такой особенностью может обладать лишь небольшая 

часть 

полученных 

после 

регенерации 

культур. 

Поэтому 

после 

протопластирования выявляются «плюс» и «минус» варианты продуцента по 

сравнению с производительностью исходной культуры. 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  1  2  3  4   ..