Курс лекций по биотехнологии - часть 2

 

  Главная      Учебники - Разные     

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..   1  2  3   ..

 

 

Курс лекций по биотехнологии - часть 2

 

 

 

9

   С  некоторой  условностью  «Лестница  живых  существ»  начинается  с 

вирусов.  Последние  в  качестве  биообъектов  (с  ослабленной  патогенностью) 

используются прежде всего для приготовления вакцин. 

     Как биообъекты, микробные клетки прокариот и эукариот в современном 

биотехнологическом  производстве  занимают  доминирующее  положение. 

Они  являются  продуцентами,  используемых  в  качестве  лекарственных 

средств,  первичных  метаболитов -  аминокислот,  азотистых  оснований, 

коферментов,  моно-  и  дисахаров,  ферментов  медицинского  назначения, 

применяемых в заместительной терапии и т.д. 

     Микроорганизмы образуют огромное количество вторичных метаболитов, 

многие  из  которых  также  нашли  применение  в  клинике,  например, 

антибиотики и другие  корректоры гомеостаза клеток млекопитающих. 

Пробиотики – препараты  на  основе  биомассы  отдельных  видов 

микроорганизмов  используется  при  дисбактериозах  для  нормализации 

микрофлоры  желудочно-кишечного  тракта.  Микроорганизмы  необходимы 

также  при    производстве  вакцин.  Наконец,  микробные  клетки  методами 

генной 

инженерии 

могут 

быть 

превращены 

в 

продуценты 

видоспецифических  для  человека  белковых  гормонов,  белковых  факторов 

неспецифического иммунитета  и.т.д. 

   Высшие  растения  являются  традиционным  и  к  настоящему  времени  все 

еще наиболее обширным источником получения лекарственных средств. При 

использовании  растений  в  качестве  биообъектов  основное  внимание 

сосредоточено  на  вопросах  культивирования  растительных  тканей  на 

искусственных  средах  (каллусные  и  суспензионные  культуры)  и 

открывающихся при этом новых перспективах. 

     Традиционными поставщиками лекарственных и диагностических средств 

являются  представители  животного  мира.  Довольно  часто  в  качестве 

биообъекта  выступают  млекопитающие,  птицы,  рептилии,  амфибии, 

членистоногие, 

рыбы, 

моллюски. 

Разнообразие 

образуемых 

ими 

 

10

биологически  активных  соединений,  нашедших  применение  в  медицине, 

крайне велико. 

     В  последние  годы  в  связи  с  развитием  технологии  рекомбинантной ДНК 

стремительно  возрастает  важность  такого  биообъекта  как  человек,  хотя  на 

первый взгляд это кажется парадоксальным. В принципе, человек уже давно 

мог  быть  отнесен  к  биообъектам,  например,  при  получении  гомологичной 

антисыворотки  или  в  случае  использования  различных  тканей  и  органов 

человека для их пересадки, например, костного мозга, почек и т. д. Однако, 

биообъектом    с  позиций  биотехнологии  (при  использовании  биореакторов) 

человек  стал  лишь  после  реализации  возможности  клонирования  его  ДНК 

(точнее ее экзонов) в клетках микроорганизмов. Как уже указывалось выше, 

за  счет  такого  подхода  был  ликвидирован  дефицит  сырья  для  получения 

видоспецифических белков человека. 

1.2.   Совершенствование биообъектов методами мутагенеза и селекции 

Как правило, работающий с биообъектом биотехнолог крайне заинтересован 

в  его  совершенствовании  независимо  от  того,  на  какой  ступени  "лестницы 

живых существ" находится  этот биообъект. Если организм, выделенный  из 

природной  среды      (по  жаргонному  выражению - «дичок»)  не  будет 

подвергнут  совершенствованию,  то  производственный  процесс  образования  

целевого  продукта  или  экономически  нецелесообразен  или  технически 

трудно осуществим. Наиболее четко эта тенденция прослеживается в случае 

биообъектов,  принадлежащих  к  микроорганизмам.  Изменение  биообъекта, 

благоприятное для его использования в производстве, должно  передаваться  

по  наследству  и,  соответственно,   должно  быть  вызвано  мутацией.  На 

биохимическом  уровне  мутация - изменение  первичной  структуры  ДНК  в 

конкретном    ее  участке,  что,  в  конечном  счете,  приводит    к  изменению 

фенотипа  биообъекта.  Меняется  биосинтетическая  способность  биообъекта: 

либо изменяется набор его ферментов, либо активность некоторых из них. 

 

11

Следует  подчеркнуть,  что  мутации – это    первоисточник  изменчивости 

организмов, создающий основу для эволюции. Однако, для микроорганизмов 

сравнительно недавно  (во второй половине XIX века) был открыт еще один 

источник  изменчивости - перенос  чужеродных  генов,  то  есть  своего  рода 

«генная  инженерия природы». 

Долгое время понятие мутации относили только к хромосоме у прокариот и 

хромосомам  (ядру)  у  эукариот.  В  настоящее  время,  кроме  понятия 

хромосомных 

мутаций 

появилось 

также 

понятие 

мутаций 

цитоплазматических  (плазмидных  у  прокариот,  митохондриальных  и 

плазмидных у эукариот). 

Мутации могут быть обусловлены как перестройкой репликона (изменением 

в  нем  числа  и  порядка  расположения  генов),  так  и  изменениями  внутри 

индивидуального гена. 

Применительно  к  любым  биообъектам,  но  особенно  часто  в  случае 

микроорганизмов,  выявляются  так  называемые  спонтанные  мутации.  К 

спонтанным  мутациям  относят  такие  мутации,  которые    обнаруживаются  в 

популяции клеток без какого-либо специального воздействия на нее.   

По  выраженности  почти  любого  признака,  клетки  в  микробной  популяции 

составляют      вариационный  ряд.  Большинство  клеток  имеют  среднюю 

выраженность  признака. "Плюс"  и  "минус" -  отклонения  от  среднего 

значения  встречаются  в  популяции  тем  реже,  чем  больше  величина 

отклонения в любую сторону (рис. 1).    

 

12

  

 

Рис.1              Вариационный ряд 
 

Первоначальный,  самый  простой  подход  к  совершенствованию  биообъекта 

заключался  в  отборе  "плюс"  отклонений  (подразумевая,  что  именно  "плюс"  

отклонения  соответствуют  интересам  производства).  В  новом  клоне 

(генетически  однородное  потомство  одной  клетки;  на  твердой  среде – 

колония),  полученном  из  клетки  с  "плюс"  отклонением  вновь  проводится 

Средняя степень 
выраженности признака 

Частота 
встречаемости 
признака 

«

-

» варианты 

«

+

» варианты

 

13

отбор по тому же принципу. Однако такая процедура при ее неоднократном 

повторении  довольно  быстро  теряет  эффективность,  то  есть  "плюс" 

отклонения становятся в новых клонах все меньше и меньше по величине. 

Спонтанные мутации встречаются, как правило, довольно редко. Разброс по 

степени выраженности признаков обычно невелик.  

 

Совершенствование биообъектов путем  предварительного  мутагенеза 

и  последующей    селекции  оказалось    гораздо  более    действенным.  В  этом 

случае  разброс  мутантов  по    выраженности  различных    признаков  (как 

"плюс" так и "минус")  резко увеличивается. Среди них оказываются мутанты 

с  пониженной  способностью  к  реверсии,  то  есть  со  стабильно  измененным 

признаком.  Мутагенез    осуществляется  при  обработке  биообъекта 

физическими  или  химическими  мутагенами.  В  первом  случае,  как  правило, 

это 

УФ-лучи, 

гамма-лучи, 

рентгеновские 

лучи; 

во 

втором - 

нитрозометилмочевина, 

нитрозогуанидин, 

акридиновые 

красители,  

некоторые  природные  вещества  (например,  из  ДНК-тропных  антибиотиков, 

неприменяемых  вследствие  их  токсичности    в  инфекционной  клинике). 

Механизм активности как физических, так и химических мутагенов связан с  

их  непосредственным  действием  на  ДНК  (прежде  всего  на  азотистые 

основания  ДНК,  что  выражается  в  сшивках,  димеризации,  алкилировании 

последних, интеркаляции между ними). 

Подразумевается,  естественно,  что  повреждения  не  приводят  к  летальному 

исходу.  Таким  образом,  после  обработки  биообъекта  мутагенами 

(физическими  или  химическими),  их  воздействие  на  ДНК  приводит  к 

частому  наследственному  изменению    уже  на  уровне  фенотипа    (тех  или 

иных  его  свойств).  Последующей  задачей  является  отбор  и  оценка  именно 

нужных  биотехнологу  мутаций.  Для  их  выявления  обработанная  культура 

высеивается  на  твердые  питательные  среды  различного  состава.  Перед 

высевом  ее  разводят  с  таким  расчетом,  чтобы  на  твердой  среде  не  было 

сплошного  роста,  а  формировались  отдельные  колонии,  образуемые  при 

 

14

размножении    именно  отдельных  клеток.  Затем  колония  пересевается  и 

полученная    культура    (клон)  проверяется  по  тем  или  иным  признакам  в 

сравнении  с  исходной  культурой.  Эта  селекционная  часть  работы  в  целом 

весьма трудоемка, хотя  приемы, позволяющие повысить ее эффективность, 

постоянно  совершенствуются.  Так,  изменяя  состав  твердых  питательных 

сред, на которых вырастают колонии, можно сразу получить первоначальные 

сведения о свойствах клеток этой колонии в сравнении с клетками исходной 

культуры.  Для    высеивания    клонов  с  разными  особенностями  метаболизма 

используют  так  называемый  «метод  отпечатков»,  разработанный 

Дж.Ледербергом  и  Э.Ледсрберг.  Популяция  микробных  клеток  разводится 

таким образом, чтобы на чашке Петри с питательной средой вырастало около 

ста колоний и они  были бы четко отделены друг от друга. На металлический 

цилиндр с диаметром, приближающимся к диаметру чашки Петри, надевают 

бархат;  затем  все  стерилизуют,  создавая,  таким  образом, «стерильное  

бархатное дно» цилиндра. Далее прикладывают это дно к поверхности среды 

в  чашке  с  выросшими  на  ней  колониями.  При  этом,  колонии  как  бы 

«отпечатываются»  на  бархате.  Затем  этот  бархат  прикладывается  к 

поверхности сред разного состава.  Таким образом, можно установить, какая 

колония  в  исходной  чашке  (на  бархате  расположение  колоний  отражает  их 

расположение  на  поверхности  твердой  среды  в  исходной  чашке) 

соответствует,  например,  мутанту,  нуждающемуся  в  конкретном  витамине, 

или  конкретной  аминокислоте;  или  какая  колония  состоит  из  мутантных 

клеток,  способных  к  образованию  фермента,  окисляющего  определенный 

субстрат; или какая колония состоит из клеток, получивших  резистентность 

к тому или иному антибиотику и т.п. 

В  первую  очередь,  биотехнолога  интересуют  те  мутагенные  культуры, 

которые  обладают  повышенной  способностью  к  образованию  целевого 

продукта.  Продуцент  целевого  вещества,  который  является  в  практическом 

отношении  наиболее  перспективным,  может  многократно  подвергаться 

 

15

обработке  разными  мутагенами.  Новые  мутантные  штаммы  получаемые  в 

научных  лабораториях  разных  стран  мира  служат  предметом  обмена  при 

творческом содружестве, предметом  лицензионной продажи и т. п. 

Потенциальные  возможности  мутагенеза  (с  последующей  селекцией) 

обусловлены  зависимостью  биосинтеза  целевого  продукта  от  многих  

метаболических процессов протекающих в организме продуцента. Например, 

повышенную  активность  организма,  образующего  целевой  продукт  можно 

ожидать, если мутация привела к дупликации (удвоению) или  амплификации 

(умножению)  структурных  генов,  включенных  в  систему  синтеза  целевого 

продукта.  Далее  активность  можно  повысить,  если  за  счет  разных  типов 

мутаций  будут  подавлены  функции  репрессорных  генов  регулирующих  

синтез  целевого  продукта.  Весьма  эффективным  путем  увеличения 

образования 

целевого 

продукта 

является 

 

нарушение 

системы 

ретроингибирования.    Повышение  активности  продуцента  может  быть 

также  достигнуто    вследствие  изменения  (за  счет  мутаций)  систем 

транспорта предшественников целевого продукта в клетку.  Наконец, иногда 

целевой  продукт  при  резком  увеличении  его  образования  отрицательно 

влияет  на  жизнеспособность  собственного  продуцента  (так  называемый 

суицидный  эффект).  Так,  повышение  резистентности  продуцента  к 

образуемому  им  же  веществу  часто  бывает  необходимым  условием  для 

получения, например, суперпродуцентов антибиотиков. 

Помимо  дупликации  и  амплификации  структурных  генов,  мутации  могут 

носить  характер  делеции – «стирания»,  то  есть  «выпадения»  части 

генетического материала.  Мутации могут быть обусловлены транспозицией 

(вставкой  участка  хромосомы  в  новое  место)  или  инверсией  (изменением 

порядка  расположения  генов  в  хромосоме).  При  этом  геном  мутантного 

организма  претерпевает  изменения  ведущие  в  одних  случаях  к  потере 

мутантом  определенного  признака,  а  в  других - к  возникновению  у  него 

нового  признака.  Гены  на  новых  местах  оказываются  под  контролем  иных 

 

16

регуляторных  систем.  Кроме  того,  в  клетках  мутанта  могут  появиться 

несвойственные исходному организму гибридные белки за счет того, что под 

контролем одного промотора оказываются полинуклеотидные цепи двух (или 

более) структурных генов, ранее отдаленных друг от друга. 

Немалое значение для биотехнологического производства могут иметь и так 

называемые  «точечные»  мутации.  В  этом  случае  изменения  происходят  в 

пределах только одного гена. Например, происходит  выпадение или вставка 

одного  или  нескольких  оснований.  К  «точечным»  мутациям  относятся 

трансверсия (когда происходит замена пурина на пиримидин) и транзиция  

(замена  одного  пурина  на  другой  пурин  или  одного  пиримидина  на  другой 

пиримидин).  Замены  в  одной  паре  нуклеотидов  (минимальные  замены)  при 

передаче  генетического  кода  на  стадии  трансляции    ведут  к  появлению  в 

кодируемом  белке  вместо  одной  аминокислоты - другой.  Это  может  резко 

изменить 

конформацию 

данного 

белка 

и, 

соответственно, 

его 

функциональную  активность,  особенно  в  случае  замены  аминокислотного 

остатка в активном или аллостерическом центре.  

 

Одним  из  самых  блестящих  примеров  эффективности  мутагенеза  с 

последующей  селекцией  по  признаку  увеличения  образования  целевого 

продукта  является  история  создания  современных  суперпродуцентов 

пенициллина.  При  этом  работа  с  исходными  биообъектами  (штаммы  гриба  

Penicillium chrysogenum) выделенными  из  природных  источников,  велась, 

начиная с сороковых годов прошлого века, в течение несколько десятилетий  

во  многих  лабораториях.  Вначале  некоторый    успех  был    достигнут  при 

отборе  мутантов,  появившихся  в  результате  спонтанных  мутаций.  Затем 

перешли  к  индуцированию  мутаций  физическими  и  химическими 

мутагенами.  В  результате  ряда  удачных  мутаций и ступенчатого  отбора  все 

более продуктивных мутантов, активность штаммов Penicillium chrysogenum, 

(используемых  в  промышленности  тех  стран,  где  производят  пенициллин), 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..   1  2  3   ..