Организация и проведение микробиологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза. Клинические рекомендации (2014 год)

Утверждены 03.10.2014 г. на Всероссийской научно-практической

конференции Российского Общества Фтизиатров (РОФ)

и Национального научного общества инфекционистов (ННОИ)

с международным участием «Туберкулёз и и ВИЧ-инфекция -

угроза двойной эпидемии. Актуальные вопросы профилактики,

диагностики и лечения»

А15. ТУБЕРКУЛЕЗ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ, ПОДТВЕРЖДЕННЫЙ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИ

А16. ТУБЕРКУЛЕЗ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ, НЕ ПОДТВЕРЖДЕННЫЙ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИ ИЛИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИ

A17+. ТУБЕРКУЛЕЗ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

А18. ТУБЕРКУЛЕЗ ДРУГИХ ОРГАНОВ

А19. МИЛИАРНЫЙ ТУБЕРКУЛЕЗ

Оглавление

1. МЕТОДОЛОГИЯ

2. Список сокращЕНИЙ

3. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

4. Обследуемые пациенты и диагностический

материал, подвергаемый исследованию для диагностики

ТУБЕРКУЛЕЗА

5. Микробиологическая и молекулярно-генетическая

диагностика ТУБЕРКУЛЕЗА

5.1. Современные методы и технологии микробиологической

и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза

5.2. Этапы микробиологического и молекулярно-генетического

обследования

Приложение 1.

Приложение 2.

Приложение 3.

Медицинские профессиональные некоммерческие организации

разрабатывают и утверждают клинические рекомендации

(протоколы лечения) по вопросам оказания медицинской помощи

Статья 76. п. 2 Федерального закона

Российской Федерации от 21 ноября 2011 г.

№ 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан

в Российской Федерации»

Упоминание тех или иных компаний или названий продуктов отдельных из-

готовителей не означает, что РОФ отдает им предпочтение по сравнению с дру-

гими компаниями или продуктами аналогичного характера, не упомянутыми

в тексте.

Основная цель этих рекомендаций - дать объективную основу для разработ-

ки пациент-ориентированной тактики противотуберкулезной помощи и опти-

мизации лечения пациентов: лечение больного должно предотвращать смерть,

рецидив, приобретение или нарастание устойчивости возбудителя к противо-

туберкулезным препаратам и дальнейшее распространение туберкулеза.

Основной целевой аудиторией рекомендаций являются клиницисты (фти-

зиатры), врачи-бактериологи, организаторы здравоохранения вместе с други-

ми медицинскими работниками, занятыми лечением больных туберкулезом.

Рекомендации направлены на получение данных для лечения активного ту-

беркулеза у взрослых. Они не содержат многие смежные темы, которые описа-

ны в других публикациях.

Рекомендации содержат отдельные положения по микробиологической

и молекулярно-генетической диагностике туберкулеза, влияющие на принятие

решения в проведении необходимой и достаточной диагностики туберкулеза,

выборе необходимого режима лечения, адекватного диагностированному слу-

чаю заболевания. Они не исключают дополнительных мер диагностики, уточ-

няющих характеристику микроорганизма, пациента и дающих возможность

применять более обоснованно арсенал терапевтических мероприятий.

1. Методология

Рекомендации выстроены по иерархическому принципу и имеют разную

силу и уровни доказательности.

Методы, использованные для сбора/селекции доказательств:

поиск в электронных базах данных.

Описание методов, использованных для сбора/селекции доказательств:

доказательной базой для рекомендаций являются публикации, вошедшие

в Кохрайновскую библиотеку, базы данных EMBASE и MEDLINE. Глубина по-

иска составляла 5 лет.

Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств:

•

консенсус экспертов;

•

оценка значимости в соответствии с рейтинговой схемой (схема при-

лагается).

Рейтинговая схема для оценки силы рекомендаций

Уровни доказа-

Описание

тельств

1++

Метаанализы высокого качества, систематические обзоры ран-

домизированных контролируемых исследований (РКИ) или РКИ

с очень низким риском систематических ошибок

Качественно проведенные метаанализы, систематические обзоры

или РКИ с низким риском систематических ошибок

Метаанализы, систематические обзоры или РКИ с высоким ри-

ском систематических ошибок

2++

Высококачественные систематические обзоры исследований слу-

чай-контроль или когортных исследований. Высококачественные

обзоры исследований случай-контроль или когортных исследова-

ний с очень низким риском эффектов смешивания или системати-

ческих ошибок и средней вероятностью причинной взаимосвязи

Хорошо проведенные исследования случай-контроль или когорт-

ные исследования со средним риском эффектов смешивания или

систематических ошибок и средней вероятностью причинной вза-

имосвязи

Исследования случай-контроль или когортные исследования с вы-

соким риском эффектов смешивания или систематических оши-

бок и средней вероятностью причинной взаимосвязи

Уровни доказа-

Описание

тельств

Неаналитические исследования

(например, описания случаев,

серий случаев)

Мнение экспертов

Методы, использованные для анализа доказательств:

•

обзоры опубликованных метаанализов;

•

систематические обзоры с таблицами доказательств.

Описание методов, использованных для анализа доказательств

При отборе публикаций, как потенциальных источников доказательств,

использованная в каждом исследовании методология изучается для того,

чтобы убедиться в ее валидности. Результат изучения влияет на уровень до-

казательств, присваиваемый публикации, что в свою очередь влияет на силу

вытекающих из нее рекомендаций.

Методологическое изучение базируется на нескольких ключевых вопросах,

сфокусированных на тех особенностях дизайна исследования, которые оказы-

вают существенное влияние на валидность результатов и выводов.

На процессе оценки, несомненно, может сказываться и субъективный фак-

тор. Для минимизации потенциальных ошибок каждое исследование оцени-

валось независимо, т.е. по меньшей мере двумя независимыми членами рабо-

чей группы. Какие-либо различия в оценках обсуждались уже всей группой

в полном составе. При невозможности достижения консенсуса привлекался

независимый эксперт.

Таблицы доказательств:

таблицы доказательств заполнялись членами рабочей группы.

Методы, использованные для формулирования рекомендаций:

консенсус экспертов.

Рейтинговая схема для оценки силы рекомендаций

Сила

Описание

По меньшей мере один метаанализ, систематический обзор или РКИ, оце-

ненные как 1++, напрямую применимые к целевой популяции и демонстри-

рующие устойчивость результатов,

Сила

Описание

или

группа доказательств, включающая результаты исследований, оцененные

как 1+, напрямую применимые к целевой популяции и демонстрирующие

общую устойчивость результатов

Группа доказательств, включающая результаты исследований, оцененные

как 2++, напрямую применимые к целевой популяции и демонстрирующие

общую устойчивость результатов,

или

экстраполированные доказательства из исследований, оцененных как 1++

или 1+

Группа доказательств, включающая результаты исследований, оцененные

как 2+, напрямую применимые к целевой популяции и демонстрирующие

общую устойчивость результатов,

или

экстраполированные доказательства из исследований, оцененных как 2++

Доказательства уровня 3 или 4,

или

экстраполированные доказательства из исследований, оцененных как 2+

Индикаторы доброкачественной практики (Good Practice Points - GPPs):

рекомендуемая доброкачественная практика базируется на клиническом

опыте членов рабочей группы по разработке рекомендаций.

Экономический анализ:

анализ стоимости не проводился, публикации по фармакоэкономике

не анализировались.

Метод валидизации рекомендаций:

•

внешняя экспертная оценка;

•

внутренняя экспертная оценка.

Основные рекомендации:

сила рекомендаций (А-D), уровни доказательств (1++, 1+, 1-, 2++, 2+, 2-, 3,

4) и индикаторы доброкачественной практики - good practice points (GPPs)

приводятся при изложении текста рекомендаций.

2. Список сокращений

БЛ - бактериологическая лаборатория

КУМ - кислотоустойчивые микроорганизмы

ЛУ - лекарственная устойчивость

ЛЧ - лекарственная чувствительность

МБ - микобактерии

МБТ - микобактерии туберкулеза

МБТК - микобактерии туберкулезного комплекса

МГМ - молекулярно-генетические методы

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

МЛУ-ТБ - туберкулез, вызванный возбудителем с МЛУ

НТМБ - нетуберкулезные микобактерии

ППС - плотные питательные среды

ПТП - противотуберкулезный препарат

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТБ - туберкулез

Ц - Н - окраска по Цилю - Нельсену

ШЛУ - широкая лекарственная устойчивость

ШЛУ-ТБ - туберкулез, вызванный возбудителем с ШЛУ

LED - (Light Emission Diode) светодиод

3. Определения

ЛЧ МБТ - восприимчивость микроорганизмов к содержанию в питатель-

ной среде лекарственных препаратов.

ЛУ МБТ - устойчивость микроорганизмов к содержанию во внешней среде

любого из лекарственных препаратов.

Монорезистентность - устойчивость МБТ только к одному ПТП.

Полирезистентность - устойчивость МБТ к двум ПТП и более, но не к со-

четанию изониазида и рифампицина.

МЛУ - устойчивость МБТ к сочетанию изониазида и рифампицина неза-

висимо от наличия устойчивости к другим ПТП.

ШЛУ - сочетанная устойчивость МБТ к изониазиду, рифампицину, любому

препарату из группы фторхинолонов и канамицину и/или амикацину и/или ка-

преомицину независимо от наличия устойчивости к другим ПТП.

Пациенты с высоким риском МЛУ-ТБ - впервые выявленные из контактов

с МЛУ-ТБ, случаи повторного лечения.

МБТК - группа микроорганизмов внутри рода Mycobacterium, вызывающих

специфические туберкулезные поражения органов и тканей.

НТМБ - представители рода Mycobacterium, не входящие в группу МБТК;

патогенные/условно-патогенные виды способны вызывать заболевания у чело-

века (лепру, микобактериоз).

4. Обследуемые пациенты

и диагностический материал,

подвергаемый исследованию

для диагностики туберкулеза

Диагностика пациентов с подозрением на туберкулез органов дыхания

Среди лиц, подлежащих обследованию на ТБ или микобактериоз, в соответ-

ствии с действующим Порядком оказания медицинской помощи больным ТБ

в Российской Федерации, обследованию с целью диагностики ТБ органов ды-

хания подлежат пациенты, имеющие кашель с мокротой, или другие пациенты

при наличии соответствующей клинико-рентгенологической картины и после

консультации фтизиатра, в том числе выявленные при скрининговом рентге-

нологическом обследовании органов грудной клетки.

Обследование пациентов с целью дифференциальной диагностики ту-

беркулеза внелегочной локализации

Обследованию подлежат больные с длительными хроническими заболе-

ваниями, с выраженными клинико-лабораторными и рентгенологическими

изменениями и не отвечающие на неспецифическую антибактериальную те-

рапию и/или другие методы терапии. У лиц, живущих с ВИЧ, а также у паци-

ентов с другими иммунодефицитными и иммуносупрессивными состояниями

при проявлении симптомов заболеваний внелегочной локализации необходи-

мо проведение исследований для исключения диагноза «туберкулез» или «ми-

кобактериоз».

Диагностический материал

При ТБ легких, наиболее распространенной и эпидемически опасной фор-

ме заболевания, доступным и часто исследуемым диагностическим материалом

является мокрота. При подозрении на другие формы ТБ органов дыхания или

при невозможности собрать мокроту у пациента с подозрением на ТБ легких, мо-

гут исследоваться и другие виды диагностических материалов (промывные воды

бронхов, аспирационный материал, БАЛ, браш-биоптат, биоптат, экссудат и др.).

Исследования внелегочных диагностических материалов проводятся толь-

ко с целью дифференциальной диагностики ТБ внелегочной локализации,

при наличии показаний, по назначению фтизиатра и/или после консультации

фтизиатра соответствующего профиля. Приоритетным является подтвержде-

ние/исключение наличия МБТК в диагностическом материале методами с мак-

симальной доступной чувствительностью и специфичностью. В связи с этим

основными методами являются культуральные исследования на жидких

и плотных питательных средах и МГМ.

5. Микробиологическая и молекулярно-

генетическая диагностика туберкулеза

5.1. Современные методы и технологии микробиологической

и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза

Методы микроскопии

Диагностическая чувствительность метода микроскопии обычно составля-

ет не более 50% среди впервые выявленных больных ТБ легких, однако если

говорить о наиболее инфекционно-опасных больных (у которых бактериовы-

деление подтверждено культуральным методом), диагностическая чувстви-

тельность метода микроскопии в этом случае достигает 90%.

Методы микроскопии не позволяют дифференцировать МБТ от НТМБ

и дают возможность выявлять КУМ только при наличии по крайней мере

5 000-10 000 бактериальных клеток в 1 мл мокроты.

В настоящее время методы микроскопии, обладающие относительно невы-

сокой чувствительностью, тем не менее сохраняют свою актуальность, так как

позволяют быстро и с минимальными финансовыми затратами выявлять наи-

более эпидемически значимых больных ТБ и оценивать массивность бактерио-

выделения.

Методы микроскопии в обязательном порядке включаются во все схе-

мы обследования пациентов в связи с необходимостью определения статуса

бактериовыделения согласно классификатору заболеваний и дальнейшему

диспансерному наблюдению пациента или при необходимости его целевой

госпитализации в специализированное отделение противотуберкулезных уч-

реждений.

Современные методы микроскопии требуют обучения персонала.

Методы микроскопии настоятельно рекомендуется включать

в алгоритм микробиологической диагностики ТБ

Микроскопия с окраской по Цилю - Нельсену

Световая микроскопия препаратов с окраской по Ц - Н, приготовленных

непосредственно из нативных образцов мокроты или других диагностических

материалов, доступна для лабораторий всех уровней. В БЛ медицинских орга-

низаций фтизиатрического профиля субъекта РФ данный метод является ак-

туальным при необходимости экстренного (в течение 1 ч) выявления больных

ТБ и микобактериозом на первичном этапе обследования до госпитализации

с целью определения статуса бактериовыделения.

Идентификация выросших микроорганизмов микроскопией с окраской

по Цилю-Нельсену

При получении роста культуры микроорганизмов на плотной и/или жидкой

питательных средах необходимо провести ее идентификацию, а также исклю-

чить наличие контаминации посторонней микрофлорой.

Метод окраски по Ц - Н может быть использован для идентификации вы-

росших микроорганизмов при отсутствии возможности использования совре-

менных молекулярных методов.

Методы люминесцентной микроскопии

В БЛ медицинских организаций фтизиатрического профиля субъекта РФ

в качестве основного метода микроскопического исследования рекомендует-

ся применять методы люминесцентной микроскопии, где в качестве источника

излучения может использоваться ртутная лампа или светодиодный излучатель

(LED).

Основное преимущество люминесцентной микроскопии перед микроско-

пией с окраской по Ц - Н состоит в экономии времени, затрачиваемого на про-

смотр препарата, за счет использования меньших увеличений объектива и,

соответственно, возможности просматривать большую площадь мазка в поле

зрения.

Диагностическая чувствительность микроскопии с окраской люминес-

центными красителями в среднем на 10% выше, чем микроскопии с окраской

по Ц - Н, однако метод люминесцентной микроскопии требует значительной

технической компетенции, а также более высоких капиталовложений и расхо-

дов.

Светодиодная (LED) микроскопия

LED-технология позволяет сделать микроскопию более доступным анали-

зом за счет более низкой стоимости как самих микроскопов, так и их сервисно-

го обслуживания.

Оценка, проведенная ВОЗ, подтвердила диагностическую точность LED-

микроскопии по сравнению с традиционной люминесцентной микроскопией

и большую эффективность LED по сравнению с микроскопией по Ц - Н. Поэ-

тому можно рекомендовать заменять традиционную люминесцентную микро-

скопию LED-микроскопией, которая в качестве альтернативы традиционной

световой микроскопии по Ц - Н может применяться как в крупных, так и в не-

больших лабораториях.

В связи с тем, что светодиодные люминесцентные микроскопы не требуют

высококвалифицированного технического обслуживания и имеют значитель-

но больший срок службы ламп по сравнению с обычными моделями люми-

несцентных микроскопов, применение данного метода является оправданным

с экономической точки зрения и позволяет широко распространить техноло-

гию люминесцентной микроскопии для диагностики ТБ.

Метод светодиодной люминесцентной микроскопии (LED)

может быть рекомендован к применению вместо традиционной

микроскопии

Культуральные методы

Культуральные методы диагностики (методы посева диагностического ма-

териала на питательные среды с последующей идентификацией выросших ми-

кроорганизмов) являются основными методами выделения МБТ. Их специфич-

ность превышает таковую микроскопических методов, а предел обнаружения

значительно выше: он позволяет выявить МБ при наличии в 1 мл исследуемого

диагностического материала нескольких сотен и даже десятков жизнеспособ-

ных микроорганизмов.

При культивировании используют разные по составу питательные среды,

дающие разные возможности роста МБТ. Культивирование МБ обеспечивает

точную диагностику ТБ, значительно увеличивая число случаев выявления

возбудителя и позволяя подтвердить достоверность поставленного диагноза

«туберкулез».

Диагностическая чувствительность культурального метода достигает

70-80% среди впервые выявленных больных ТБ легких.

С помощью культурального метода удается выявить на 20-40% больше слу-

чаев ТБ с бактериовыделением по сравнению с методом микроскопии среди

впервые выявленных больных. Культуральный метод позволяет выделить

культуру возбудителя, необходимую для определения его видовой принадлеж-

ности и определения спектра и степени ЛУ.

Видовая идентификация выделенной культуры с помощью комплекса со-

временных молекулярных методов позволяет сразу же дифференцировать

МБТ от НТМБ и неспецифической микрофлоры.

Культуральные исследования являются достаточно трудоемкими и тре-

буют значительных капиталовложений, наличия помещений и материально-

технической базы для приготовления питательных сред, обработки образцов

и культивирования микроорганизмов, специализированного лабораторного

оборудования и надлежащих условий, обеспечивающих биологическую без-

опасность. Кроме того, культуральная диагностика требует специализирован-

ного обучения персонала.

Медленный рост МБТ требует значительного времени ожидания результа-

тов исследования. В среднем при посеве диагностического материала от впер-

вые выявленных больных для получения результатов на плотных средах требу-

ется 21-36 дней, на жидких средах - 12-22 дня.

Методы культивирования на жидкой и плотной питательных средах могут

осуществляться в БЛ разных уровней.

Культивирование на плотных питательных средах

Метод культивирования МБ на плотных средах является менее дорогосто-

ящим, чем в системах культивирования на жидких средах, но получение роста

МБ на плотных средах занимает гораздо более длительное время (до получения

отрицательного результата - 12 недель), чем культивирование МБ на жидких

средах (42-46 дней). Процесс приготовления ППС проводится в каждой БЛ са-

мостоятельно и сложно поддается стандартизации.

Однако указанный метод позволяет получить культуру МБ для проведения

ее дальнейших исследований и может быть рекомендован для использования

в БЛ на всех этапах диагностики и контроля химиотерапии.

Метод культивирования на плотной питательной среде

остается востребованным и рекомендуется к использованию

в лабораторной практике в комплексе с другими методами

исследования

Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной

системе учета роста микроорганизмов

С 2006 г. международным сообществом были одобрены несколько новых

тестов и диагностических подходов, включая использование жидких питатель-

ных сред с быстрой идентификацией в качестве стандартного эталона для под-

тверждения этиологии заболевания.

Культивирование на жидкой среде повышает выявление МБ примерно

на 10% по сравнению с ППС. В настоящее время широко используются системы

с автоматической детекцией учета роста МБ, которые позволяют значительно

ускорить получение результата.

В БЛ медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преоблада-

ющей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.

Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC

MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на ППС обеспечива-

ются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных

по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных

протоколов исследований.

Посев на жидкие питательные среды настоятельно

рекомендуется при проведении диагностических исследований,

для обследования впервые выявленных больных и повторных

случаев лечения

Идентификация микобактерий

Идентификация микобактерий по культуральным свойствам

При посеве на ППС на основании скорости роста бактерий, морфологии

и окраски колоний можно сделать предварительное заключение о принадлеж-

ности культуры либо к комплексу МБТ, либо к НТМБ.

Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов

Дифференциация МБТК и НТМБ основана на их культуральных свойствах

и способности расти на дифференциально-диагностических средах. Наиболее

часто применяемые: тест на наличие роста на среде, содержащей 1 000 мкг/мл

натрия салициловокислого; рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида ти-

офен-2 карбоксиловой кислоты (TCH); рост на среде, содержащей 500 мкг/мл

паранитробензойной кислоты; рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия.

Для дифференциации МБ внутри рода применяют следующие основные

биохимические исследования: тест на наличие способности продуцировать

никотиновую кислоту (ниациновый тест); тест на наличие нитратредуктаз-

ной активности; тест на наличие термостабильной каталазы; тест на наличие

пиразинамидазы и др. Эти исследования являются достаточно длительными,

трудоемкими и требуют дополнительных капиталовложений, материально-

технической базы, надлежащих условий, обеспечивающих биологическую без-

опасность. Эти методы требуют специализированного обучения персонала.

Для подтверждения наличия либо отсутствия контаминации при культи-

вировании на жидкой/плотной питательной среде проводят посев культур

на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста культуры через 24-72 ч ин-

кубации при +37°С свидетельствует о контаминации материала посторонней

микрофлорой.

Микробиологические и биохимические методы идентификации

МБ до вида обладают рядом ограничений, и в настоящее время

рекомендуется заменить их молекулярно-биологическими

методами идентификации

Методы определения лекарственной чувствительности МБТ

Для определения ЛЧ МБТ в качестве основных рекомендуется использовать

фенотипические методы, т.е. культивирование МБТ в присутствии ПТП:

- модифицированный метод пропорций на жидкой питательной среде в си-

стеме с автоматизированным учетом роста микроорганизмов;

- метод абсолютных концентраций на ППС Левенштейна - Йенсена;

- нитратредуктазный метод абсолютных концентраций на ППС с использо-

ванием реактива Грисса.

На жидких питательных средах с использованием анализатора BACTEC

MGIT 960/320 проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид,

рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда

(амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этио-

намид, протионамид, капреомицин, ПАСК, линезолид) (Приложение 1).

На ППС Левенштейна - Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом

абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин,

этамбутол, стрептомицин) и к ПТП второго ряда (канамицин, офлоксацин,

этионамид, протионамид, капреомицин, циклосерин, ПАСК) (Приложение 1).

Критические концентрации ПТП для определения ЛЧ МБТ

на жидких и плотных средах различаются

Определение лекарственной чувствительности НТМБ

Для определения ЛЧ НТМБ рекомендуется использовать метод на основе

определения минимальных ингибирующих концентраций препаратов. Ме-

тод основан на культивировании выделенной культуры НТМБ в 96-луночном

планшете в жидкой питательной среде, содержащей разные концентрации ан-

тибактериальных, в том числе и ПТП (Приложение 2).

Для медленнорастущих и быстрорастущих НТМБ ЛЧ определяется к раз-

ному спектру препаратов. Для быстрорастущих НТМБ такими препаратами

являются триметоприм/сульфамтоксазол, ципрофлоксацин, моксифлоксацин,

цефоксицин, амикацин, доксициклин, тайгециклин, кларитромицин, линезо-

лид, имипенем, цефепим, амоксициллин/клавулоновая кислота, цефтриаксон,

миноциклин, тобрамицин. Для медленнорастущих НТМБ - кларитромицин,

ципрофлоксацин, стрептомицин, доксициклин, этионамид, рифабутин, этам-

бутол, изониазид, моксифлоксацин, рифампицин, триметоприм, амикацин, ли-

незолид (Приложение 2).

Критические концентрации ПТП для определения ЛЧ

НТМБ не разработаны и не утверждены ВОЗ. Для выбора

препаратов для лечения микобактериоза проводят определение

минимальных ингибирующих концентраций на жидких

питательных средах в планшетном формате и соотносят их

с фармакокинетикой препарата

Молекулярно-генетические методы

Длительность получения результатов культуральным методом исследова-

ния неблагоприятно сказывается на эффективности химиотерапии, особенно

в связи с вероятностью неправильного выбора схемы химиотерапии при нали-

чии ЛУ у возбудителя и расширением спектра устойчивости МБТ.

Основное преимущество молекулярных методов в том, что они являются

«быстрыми» методами, позволяющими получить результаты в относительно

короткий временной период. Заключение о наличии МБ в диагностическом

материале делается на основании выявления ДНК МБ, а вывод о ЛУ - на осно-

вании выявления мутаций в генах, ассоциированных с ЛУ.

Выявление ДНК МБТ

В настоящее время в РФ зарегистрировано большое количество тест-систем

для выявления ДНК МБТ методом ПЦР (Приложение 3), отличающихся спо-

собом детекции результатов. Предпочтительными являются тест-системы, ис-

ключающие кросс-контаминацию образцов, с детекцией результата в режиме

реального времени. Получение положительного результата методом ПЦР по-

зволяет в течение 1 рабочего дня установить наличие МБТ в диагностическом

материале.

Картриджная технология рекомендована для экстренного

выявления возбудителя ТБ с одновременной диагностикой его

устойчивости к рифампицину

Однократное выявление ДНК возбудителя без подтверждения микроскопи-

ей или культуральными методами требует осторожной интерпретации поло-

жительного результата и согласования с клинико-анамнестическими данными.

Методы идентификации

Методы идентификации, основанные на ПЦР, имеют преимущество в специ-

фичности и быстроте анализа по сравнению с культуральными и биохимиче-

скими методами.

Молекулярные методы дифференциации МБТ от НТМБ основаны на вы-

явлении видоспецифических структур в геноме или белковом спектре возбу-

дителя. Ряд методов направлен только на то, чтобы дифференцировать МБТК

от НТМБ, ряд - пригоден для точной видовой идентификации возбудителя.

К методам, дифференцирующим МБТК от НТМБ, относится ПЦР, выявля-

ющая вставочную последовательность ДНК IS6110, присутствующую только

у МБТК.

При обследовании больных с поствакцинальными осложнениями, включая

костные поражения, больных ВИЧ-инфекцией и больных с иммуносупресси-

ей, при подтверждении наличия ДНК и/или выделения культуры МБТ, необхо-

димо исключить наличие M. bovis или M. bovis BCG в диагностическом матери-

але. Для этого необходимо провести идентификацию возбудителя с помошью

молекулярно-генетических тест-систем (Приложение 3).

Иммунохроматографический метод (метод поддержан ВОЗ), основанный

на определении наличия специфического антигена МБТ МРТ-64, отличается

простотой выполнения и обеспечивает идентификацию МБТ за 15 мин. Дан-

ный метод может быть рекомендован в качестве основного при проведении

идентификации культур, выросших на жидких и/или плотных питательных

средах, а также в контаминированных культуральных образцах (Приложе-

ние 3).

Иммунохроматографический тест на основе выявления белка

MPT-64 рекомендован в качестве основного при проведении

идентификации культур, выросших на жидкой и/или плотных

питательных средах

Методики, обеспечивающие точную видовую идентификацию НТМБ, более

трудоемки и требуют больших материальных затрат. К ним относятся гибри-

дизационные технологии на нейлоновых мембранах (ДНК-стрипы), позволя-

ющие идентифицировать следующие виды НТМБ: M. avium ssp., M. chelonae,

M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum,

M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum, M. ulcerans,

M. xenopi и M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis,

M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai, M. intermedium,

M. phlei, M. haemophilum, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum и M. shimoidei. Этим

методом можно исследовать культуры с плотной и жидкой питательных сред

и получить результат в течение 1-2 дней.

Идентификация МБ до вида может проводиться также с помощью ПЦР в режи-

ме реального времени, секвенирования, MALDI-ToF масс-спектрометрии, высоко-

эффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии, резуль-

таты которых основаны на выявлении уникальных для каждого вида МБ структур.

Методики точной видовой идентификации НТМБ могут быть

рекомендованы для хорошо оснащенных БЛ с подготовленным

персоналом

Молекулярно-генетические методы определения ЛУ

Генотипические методы определения ЛУ МБТ основаны на выявлении специ-

фических мутаций, связанных с резистентностью к определенным ПТП.

Основным преимуществом МГМ является быстрое и достоверное выявле-

ние больных МЛУ-ТБ, так как они позволяют выявить ЛУ МБТ к рифампици-

ну и изониазиду, а также к важнейшим препаратам второго ряда, позволяя ис-

пользовать разделение потоков больных и включать в режим лечения наиболее

эффективные препараты.

Использование МГМ для определения ЛУ является первоначальным

этапом обследования больных и не исключает необходимость применения

традиционных культуральных методов определения ЛЧ возбудителя, т.к.

молекулярно-генетические тест-системы определения ЛУ в настоящее вре-

мя разработаны не для всех ПТП и диагностическая чувствительность их

в некоторых случаях недостаточная для назначения корректного режима

лечения.

Молекулярно-генетические тест-системы на определение ЛУ представлены

тремя основными технологиями:

1) гибридизационные технологии, основанные на гибридизации продуктов

ПЦР со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизированными на ма-

трице, которая может представлять собой биологический микрочип, или ДНК-

стрип (Приложение 3);

2) мультиплексная ПЦР в режиме реального времени (Приложение 3);

3) «картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут авто-

матически в специальном картридже) (Приложение 3).

Гибридизационные технологии

Гибридизационные технологии позволяют в культуре с плотной или жид-

кой питательной среды или непосредственно в мокроте (при положительном

результате микроскопического исследования на КУМ) в течение 1-2 дней вы-

являть наиболее распространенные мутации в генах МБТ, связанных с устой-

чивостью к основным ПТП первого ряда - изониазиду и рифампицину и не-

которым ПТП второго ряда (в зависимости от тест-системы).

Данная группа методов основана на том, что амплифицированные в резуль-

тате ПЦР целевые последовательности гибридизуются с зондами, нанесенными

на соответствующую матрицу. По результатам гибридизации делается вывод

о наличии мутаций, приводящих к устойчивости к ПТП.

Биологические микрочипы

В настоящее время на территории РФ зарегистрированы две отечественные

тест-системы, использующие микрочиповую технологию: «ТБ-Биочип», кото-

рая позволяет определять ЛУ к рифампицину и изониазиду (гены rpoB, katG,

inhA, ahpC) с чувствительностью метода более 95% при установлении устой-

чивости к рифампицину и более 85% - к изониазиду (специфичность 95%),

и «ТБ-Биочип-2», позволяющая определять устойчивость к фторхинолонам

с чувствительностью не менее 85% (ген gyrA).

Использование микрочиповой технологии позволяет определять точный

тип мутаций, приводящих к устойчивости возбудителя ТБ к перечисленным

ПТП.

Особенностью этой технологии является наличие этапа «вложенной» ПЦР,

позволяющей нарабатывать необходимое количество целевых последователь-

ностей в предварительно амплифицированном участке гена, с последующей

гибридизацией продуктов амплификации с иммобилизованными на матри-

це специфическими зондами, позволяющими выявлять наличие наиболее

распространенных мутаций, приводящих к устойчивости к ПТП. Поскольку

метод вложенной ПЦР повышает риск контаминации образцов, при исполь-

зовании гибридизационных молекулярно-генетических тест-систем для опре-

деления ЛУ МБТ предъявляются высокие требования к зонированию помеще-

ний и к квалификации персонала.

Получение и анализ изображения гибридизационной картины производит-

ся специальным аппаратно-программным комплексом, который анализирует

свечение ячеек биочипа и выдает отчет о наличии мутаций и устойчивости

возбудителя, его видовой идентификации (Приложение 3).

ДНК-стрипы

Метод позволяет определять ЛУ к рифампицину, изониазиду, фторхиноло-

нам, этамбутолу, аминогликозидам/циклическим пептидам (Приложение 3).

Этот тест представляется в настоящее время наиболее приемлемым для мо-

ниторинга штаммов с устойчивостью к основным препаратам второго ряда,

в том числе и ШЛУ-ТБ, поскольку этот набор предоставляет возможность те-

стирования ЛУ к наибольшему числу ПТП, а сам метод является менее трудо-

емким по сравнению с методом биочипов.

Метод основан на множественной обратной гибридизации на ДНК-стрипах

и лежит в основе тест-системы GenoType MTBDRplus, применяемой для опре-

деления ЛЧ к изониазиду и рифампицину, и тест-системы GenoType MTBDRsl

для определения ЛУ к фторхинолонам, аминогликозидам/циклическим пепти-

дам и этамбутолу.

После одноэтапной амплификации со специфическими праймерами про-

дукты ПЦР гибридизуются с олигонуклеотидами, иммобилизованными

на стрипах. Гибридизация ампликонов проходит в открытых ванночках, что

увеличивает риск контаминации.

Результат гибридизации визуализируется на нейлоновой мембране - стрипе

в виде набора полос, которые вручную или с помощью прибора сравнивают

с шаблоном и определяют наличие мутаций, ассоциированных с ЛУ.

Чувствительность и специфичность набора GenoType MTBDRplus, по дан-

ным метаанализа публикаций группы экспертов ВОЗ, высоки и составляют

98,1 и 98,7% для рифампицина и 84,3 и 99,5% для изониазида соответственно.

Специфичность набора GenoType MTBDRsl, по данным метаанализа публи-

каций группы экспертов ВОЗ, для ПТП второго ряда превышает 95%, а чув-

ствительность при определении устойчивости к фторхинолонам составляет

83,5%, а для канамицина, амикацина и капреомицина - около 95%. При опре-

делении устойчивости к этамбутолу были показаны более низкая чувствитель-

ность и специфичность - 56 и 81% соответственно.

Метод рекомендуется для исследования культур МБТ

и образцов диагностического материала с положительными

результатами микроскопии

Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени

Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации,

ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду (АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ).

Преимуществом данного метода перед вышеописанными технологиями яв-

ляется отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реаль-

ного времени, что позволяет снизить возможность контаминации. Использо-

вание зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью

и специфичностью (94 и 99% соответственно) выявлять мутации в генах rpoB,

katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду

(Приложение 3).

ПЦР в режиме реального времени является наиболее

перспективным методом, т.к. в течение одного дня позволяет

детектировать устойчивость МБТ к рифампицину и изониазиду

из диагностического материала

Картриджная технология

Использование системы GeneXpert MTB/RIF позволяет непосредственно

из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 ч) одновремен-

но проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять

устойчивость МБТ к рифампицину.

Указанный метод обладает не только хорошими диагностическими характе-

ристиками, позволяя получить своевременные и достоверные данные для кли-

нического и эпидемиологического использования, к его достоинствам можно

также отнести простоту проведения исследования и отсутствие строгих требо-

ваний к зонированию рабочих помещений.

ВОЗ рекомендует использовать данный тест для быстрой диагностики

МЛУ-ТБ, особенно в странах с высоким бременем ТБ и распространением

ВИЧ-инфекции.

Картриджная технология может использоваться не только

в лабораториях учреждений фтизиатрического профиля,

но и в лабораториях учреждений первичной медико-

санитарной помощи

5.2. Этапы микробиологического и молекулярно-генетического

обследования

Для получения достоверных и информативных результатов наличия МБТ

в диагностическом материале и данных о ЛЧ возбудителя необходимо прово-

дить комплексные лабораторные исследования.

Этапы микробиологического и молекулярно-генетического обследования

с целью диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза:

Выявление возбудителя ТБ в диагностическом материале, собранном до на-

чала химиотерапии:

Используют все доступные методы, обеспечивающие возможно быстрое по-

лучение результатов с наибольшей достоверностью:

- люминесцентная/LED-микроскопия,

- МГМ,

- культуральные исследования с посевом на жидкие и плотные питатель-

ные среды.

По результатам экспресс-исследований определяют статус больного, форму

помощи и направляют его в соответствующее отделение.

Скрининг ЛУ ТБ - максимально быстрое выявление генетических маркеров

устойчивости к препаратам, определяющим стартовые режимы лечения (ри-

фампицин, изониазид, фторхинолоны и другие ПТП) для назначения адек-

ватного режима лечения и перевода пациента в соответствующее отделение.

Полная характеристика выделенной культуры для подтверждения результа-

тов скрининговых исследований и обоснования назначения индивидуали-

зированной схемы лечения согласно ЛЧ возбудителя.

На данном этапе используют один или несколько из общепринятых куль-

туральных методов определения ЛЧ МБТ (в зависимости от спектра и ха-

рактера устойчивости), а также проводят дифференциацию и более полную

идентификацию выделенных культур иммунохроматографическими, МГМ,

биохимическими и другими методами.

4. Исследования, проводимые с целью обоснования и контроля химиотерапии.

Обследование до начала лечения

Выявление и идентификация возбудителя, скрининг ЛУ

Для выявления возбудителя ТБ рекомендуется проводить анализ двух об-

разцов диагностического материала, собранных до начала лечения, по следую-

щей схеме:

1-й образец (все исследования проводятся из одной и той же пробы):

- люминесцентная/LED-микроскопия из осадка,

- посев на 1 пробирку с жидкой питательной средой (для культивирования

в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов) и парал-

лельно на 1 пробирку с ППС,

- ПЦР-исследование для обнаружения ДНК МБТ/ДНК МБТ с определением

ЛУ к рифампицину.

2-й образец (все исследования проводятся из одной и той же пробы):

- люминесцентная/LED микроскопия из осадка,

- посев на 1 пробирку с жидкой средой и на 1 пробирку с плотной средой

либо (при ограниченных ресурсах) посев на 2 пробирки с разными по со-

ставу ППС,

- ПЦР-исследование для обнаружения ДНК МБТ (при ограниченных ресур-

сах рекомендуется проводить по показаниям, в случае, если первый резуль-

тат тестирования методом ПЦР был отрицательным).

При ограниченных ресурсах допускается исследовать 2-й образец только

методом микроскопии.

Для обнаружения ДНК МБТ предпочтительно использовать метод ПЦР

в режиме реального времени.

На этапе выявления МБТ, в случае получения методом ПЦР положительного

результата на ДНК МБТ, выделенный из диагностического материала образец

ДНК рекомендуется сразу же направить на тестирование ЛУ к ПТП первого

ряда одним из МГМ. При получении положительного результата на устойчи-

вость образец ДНК направляется на исследование к ПТП второго ряда.

В случае недостаточного содержания ДНК МБТ в диагностическом матери-

але и невозможности получения результата ЛУ МБТ из диагностического ма-

териала рекомендуется провести молекулярно-генетическое исследование ЛУ

МБТ для соответствующей культуры, выделенной из этого материала при по-

севе его на жидкую или плотную питательные среды.

Перед началом лечения рекомендуется назначить МГМ

диагностики ЛУ МБТ к изониазиду и рифампицину или только

к рифампицину, а при выявлении МЛУ - к фторхинолонам

При выделении культуры микобактерий проводят:

- дифференциацию МБТ от НТМБ,

- определение ЛЧ выделенной культуры.

Для дифференциации МБТ от НТМБ рекомендуется использовать, в первую

очередь, микроскопию культуры с окраской по Ц - Н, при получении культуры

на плотной среде - проводить учет культуральных особенностей (скорость ро-

ста, пигментообразование), а также использовать иммунохроматографический

тест. Кроме того, могут быть использованы методы: ПЦР на наличие ДНК МБТ,

ПЦР на ДНК НТМБ, ДНК-стриповая технология, другие доступные методы.

При культивировании на жидкой/плотной питательной среде проводится

тестирование на контаминацию неспецифической микрофлорой (посев на кро-

вяной агар) перед направлением культуры МБТ на определение ЛЧ.

Определение лекарственной чувствительности фенотипическими

методами

С целью подтверждения/валидации результатов скрининговых исследова-

ний и обоснования назначения индивидуализированной схемы лечения в со-

ответствии с ЛЧ возбудителя используют культуральные методы определения

ЛЧ МБТ.

При выделении культуры, выросшей из диагностического

материала, собранного до начала лечения, необходимо провести

определение ЛЧ МБТ на жидкой и/или плотных питательных

средах к максимально широкому спектру ПТП

Определение ЛЧ МБТ к изониазиду, рифампицину, этамбутолу,

амикацину или канамицину, офлоксацину настоятельно

рекомендуется

Определение ЛЧ МБТ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этам-

бутолу, офлоксацину, этионамиду, протионамиду, капреомицину, канамицину

и ПАСК может быть проведено либо на жидкой (метод BACTEC MGIT 960/320),

либо на плотной (метод абсолютных концентраций) питательных средах. Ду-

блирование исследований (к одному и тому же препарату на разных средах

одновременно) не рекомендуется.

ЛЧ МБТ к пиразинамиду, амикацину, левофлоксацину, моксифлоксацину,

линезолиду рекомендуется определять на жидких питательных средах.

ЛЧ МБТ к циклосерину можно определять только на ППС.

В регионах РФ с широким распространением случаев МЛУ-ТБ и ШЛУ-ТБ

рекомендуется по возможности (при наличии положительного результата

на устойчивость, полученного с помощью МГМ), не ожидая получения резуль-

татов определения ЛЧ МБТ микробиологическими методами к ПТП первого

ряда, сразу же осуществлять тестирование ЛЧ МБТ одновременно к ПТП пер-

вого и второго рядов, чтобы в максимально короткие сроки получить данные

по всему спектру устойчивости возбудителя.

Обследование с целью контроля лечения

Обследование для контроля химиотерапии включает двукратное исследова-

ние диагностического материала в течение 3-5 рабочих дней:

1-й образец (все исследования проводятся из одной и той же пробы):

- люминесцентная/LED микроскопия из осадка,

- посев на 2 (или 1) пробирки с ППС либо (при наличии показаний) на 1

пробирку с жидкой и 1 пробирку с ППС.

2-й образец (все исследования проводятся из одной и той же пробы):

- люминесцентная/LED-микроскопия из осадка,

- посев на 2 (или 1) пробирки с ППС.

Кратность и периодичность обследования пациента определяется назна-

ченным режимом лечения и его длительностью, а также необходимостью кон-

трольного обследования для показаний к выписке из стационара.

При сохраняющемся бактериовыделении или появлении бактериовыделе-

ния, обнаруженного методом микроскопии, в конце интенсивной фазы или

в фазе продолжения лечения следует провести посев на жидкие питательные

среды и исследование ЛЧ МБТ на жидких/плотных питательных средах к мак-

симально широкому спектру ПТП.

В случае возможности определения маркеров ЛУ МГМ их следует дополни-

тельно использовать для оценки риска развития ЛУ.

Рекомендуемая частота обследований в процессе лечения:

При химиотерапии по I, II и III стандартным режимам микроскопическое

исследование и посев на плотные/жидкие среды из двух образцов диагностиче-

ского материала проводят со 2-го месяца лечения, затем не реже 1 раза в месяц

не менее чем из 2 образцов.

При химиотерапии по IV режиму микроскопическое исследование и посев

на плотные/жидкие среды из двух образцов диагностического материала про-

водят по исходу 2-го месяца, далее - ежемесячно до получения отрицательных

результатов посевов в течение 2 последовательных месяцев, в фазе продолже-

ния те же исследования проводят каждые 3 месяца, и по завершении лечения -

не менее чем из 2 образцов, после завершения химиотерапии - каждые полгода

в течение 3 лет.

При химиотерапии по V режиму микроскопическое исследование и посев

на плотные/жидкие среды из двух образцов диагностического материала про-

водят по исходу 3-го, далее ежемесячно до получения отрицательных результа-

тов посевов в течение 4 последовательных месяцев, в фазе продолжения те же

исследования проводят каждые 3 месяца, и по завершении лечения - не менее

чем из 2 образцов, после завершения химиотерапии - каждые полгода в тече-

ние 3 лет.

В интенсивной фазе химиотерапии определение ЛЧ МБТ проводят после

2-го месяца лечения ежемесячно при лечении по I, II и III режимам, после 2, 4

и 6-го месяцев - при лечении по IV и после 3-го и 6-го месяцев - по V режиму.

В фазе продолжения лечения определение ЛЧ МБТ проводят при обнаружении

МБТ любым методом с использованием ускоренных тестов на ЛЧ. При химио-

терапии по II, IV и V режимам повторные определения ЛЧ проводят только

к тем ПТП, к которым МБТ ранее были чувствительны.

При наличии у больного признаков неэффективной химиотерапии и со-

хранении бактериовыделения по окончании интенсивной фазы химиотерапии

рекомендуется, помимо исследований, проводимых традиционными методами

(микроскопия и посев на плотные среды), выполнить повторные культураль-

ные исследования на жидких средах с тестированием ЛЧ ко всем ПТП, а также

использовать МГМ для быстрого определения ЛУ МБТ с целью своевременной

коррекции химиотерапии в случае формирования приобретенной ЛУ.

Краткий стандарт обследования пациентов, состоящих на диспансерном

учете, микробиологическими и МГМ представлен в таблице.

Методы исследования, кратность

МГМ

BACTEC MGIT

Плотные среды

Этап наблюдения / лече-

Люм/

ГДУ

LED

ТЛЧ

ния

Посев

микро-ско-

Наличие

(если нет

ДНК МБТ

(на 1 пробир-

ТЛЧ

(на 1 или 2

пия

мутаций

данных

ку MGIT)

пробирки)

BACTEC)

Перед постановкой на учет

из 2 об-

из 1 или 2 об-

1-кр. при

из 1 или 2

1-кр. при

из 2 образ-

1-кр. при

(далее ежемесячно)

разцов

ДНК МБТ+

образцов

МБТ+

цов

МБТ+

из 2 об-

из 1 или 2 образ-

1-кр. при

из 1 или 2

1-кр. при

из 2 образ-

1-кр. при

До лечения

разцов

цов (кр. II А)

ДНК МБТ+

образцов

МБТ+

цов

МБТ+

Интенсивная фаза х/т

из 1 образца

из 2 об-

1-кр. при

из 2 образ-

1-кр. при

(частота обследования - в

при наличии по-

при наличии

I-А

разцов

ДНК МБТ+

МБТ+

цов

МБТ+

зависимости от режима х/т)

казаний

показаний

I-Б

II-А

Фаза продолжения х/т

из 1 образца

из 2 об-

1-кр. при

из 2 образ-

1-кр. при

(частота обследования - в

при наличии по-

при наличии

разцов

ДНК МБТ+

МБТ+

цов

МБТ+

зависимости от режима х/т)

казаний

показаний

из 2 об-

из 2 образ-

Завершение курса лечения

разцов

цов

По показаниям, но не реже

из 2 об-

из 2 образ-

1-кр. при

II-Б

1 раза в шесть месяцев

разцов

цов

МБТ+

Перед зачислением в груп-

из 2 об-

из 2 образ-

III

пу, в дальнейшем - не реже

разцов

цов

1 раза в 6 мес.

IV-А

Перед зачислением в груп-

из 2 об-

из 1 или 2 об-

1-кр. при

из 1 или 2 об-

1-кр. при

из 2 образ-

1-кр. при

IV-Б

пу, в дальнейшем -

разцов

ДНК МБТ+

разцов

МБТ+

цов

МБТ+

IV-В

не реже 1 раза в 6 мес.

V-А

Перед зачислением в

из 2 об-

из 1 или 2 об-

1-кр. при

из 1 или 2 об-

1-кр. при

из 2 образ-

1-кр. при

V-Б

группу, в дальнейшем - по

разцов

ДНК МБТ+

разцов

МБТ+

цов

МБТ+

V-В

показаниям

Перед зачислением в

VI-А

из 2 об-

из 1 или 2 об-

1-кр. при

из 1 или 2 об-

1-кр. при

из 2-х об-

1-кр. при

группу, в дальнейшем - по

VI-Б

разцов

ДНК МБТ+

разцов

МБТ+

разцов

МБТ+

показаниям

Приложение 1. Методы определения лекарственной

чувствительности и критические концентрации

противотуберкулезных препаратов

Критические концентрации (мкг/мл)

для определения ЛЧ в зависимости от

используемого метода и питательной

среды

Среда, используемая

Группа препара-

для определения

Среда Левен-

Среда Ле-

ПТП

тов ¹

лекарственной чув-

штейна - Йен-

венштейна

Система

ствительности

сена (метод

- Йенсена

BACTEC

абсолютных

(метод

MGIT

концентра-

пропор-

960/320 ³

ций) ²

ций) ³

Группа 1

изониазид

плотная, жидкая

0,2

0,1

(пероральные

рифампицин

плотная, жидкая

40,0

1,0

противотубер-

этамбутол

плотная, жидкая

2,0

5,0

кулезные пре-

пиразина-

параты первой

жидкая

100,0

мид

линии)

плотная,

стрептомицин

4,0

1,0

жидкая

Группа 2

плотная,

(инъекционные

канамицин

30,0

2,5 ⁴

жидкая

противотубер-

плотная,

кулезные пре-

амикацин

30,0 ⁴

1,0

жидкая

параты)

плотная,

капреомицин

40,0

2,5

жидкая

плотная,

офлоксацин

4,0 ⁴

2,0

жидкая

Группа 3

плотная,

левофлоксацин

1,5 ⁴

(фторхинолоны)

жидкая

плотная,

моксифлоксацин

0,5/2,0 ⁴

жидкая

Группа 4

плотная,

этионамид

40,0

5,0

(пероральные

жидкая

бактериостати-

плотная,

протионамид

40,0

2,5

ческие противо-

жидкая

туберкулезные

циклосерин

плотная

30,0 ⁴

препараты

P-аминосалициловая

плотная,

1,0

4,0 ⁴

второго ряда)

кислота

жидкая

Группа 5

клофазимин

жидкая

(противоту-

амоксициллин/

отсутству-

беркулезные

клавуланат

ет

препараты с

отсутству-

кларитромицин

неясной эф-

ет

фективностью,

не рекомендо-

ванные ВОЗ

для рутинного

линезолид

жидкая

1,0

использования

при лечении

больных с МЛУ-

ТБ)

¹ World Health Organization. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant

tuberculosis. Geneva, WHO, 2008 (WHO/HTM/TB/2008.402) - Руководство ВОЗ по программному

ведению лекарственно-устойчивого ТБ.

² Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных

мероприятий в Российской Федерации».

³ World Health Organization. Policy guidance on drug-susceptibility testing (DST) of second-line

antituberculosis drugs. Geneva, WHO, 2008 (WHO/HTM/TB/2008.392) - Рекомендации ВОЗ для

определения ЛЧ к ПТП 2-го ряда. (Рекомендуется использование непрямого метода пропорций,

так как другие методы с использованием плотных питательных сред (метод отношений устойчи-

вости, метод абсолютных концентраций) недостаточно валидированы для препаратов второго

ряда).

⁴ Salman H. Siddiqi. Guidelines for Second-line Drug Susceptibility Testing in MGIT Based on

Published Studies. Critical Concentrations and Procedures - Рекомендации по тестированию чув-

ствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам второго ряда с

использованием MGIT, основанные на опубликованных результатах исследований. Критические

концентрации и процедуры. - 2014. - 28 с.

Приложение 2. Препараты и их концентрации

(мкг/мл) для определения лекарственной чувствительности

нетуберкулезных микобактерий

Для быстрорастущих мико-

Для медленнорастущих

бактерии, нокардий и других

Препарат

микобактерий

аэробных актиномицетов

Концентрации (мкг/мл) для определения ЛЧ

Амикацин

1-64

Амоксициллин/клавулановая

н/п

2/1-64/32

кислота 2:1

Цефепим

н/п

1-32

Цефокситин

н/п

4-128

Цефтриаксон

н/п

4-64

Ципрофлоксацин

0,12-16

0,12-4

Кларитромицин

0,06-64

0,06-16

Доксициклин

0,12-16

Этамбутол

0,5-16

н/п

Этионамид

0,3-20

н/п

Имипенем

н/п

2-64

Изониазид

0,25-8

н/п

Канамицин

н/п

Линезолид

1-64

1-32

Миноциклин

н/п

1-8

Моксифлоксацин

0,12-8

0,25-8

Рифабутин

0,25-8

н/п

Рифампицин

0,12-8

н/п

Стрептомицин

0,5-64

н/п

Тайгециклин

н/п

0,015-4

Тобрамицин

н/п

1-16

Триметоприм/сульфаметок-

0,12/2,38-8/152

0,25/4,75-8/152

сазол

н/п - не проводится

Приложение 3. Зарегистрированные в Российской

Федерации наборы реагентов для диагностики туберкулеза

и микобактериоза микробиологическими и молекулярно-

генетическими методами

Наборы реагентов для определения роста и чувствительности микобакте-

рий на жидкой питательной среде в системе автоматического учета роста

BACTEC MGIT 960/320 (Производство BD «Бектон Дикинсон энд Компа-

нии» США). Регистрационное удостоверение ФСЗ 2009/04404 от 27/05/2009.

Набор реагентов SD BIOLINE Туберкулез Антиген MPT64. Регистрационное

удостоверение ФСЗ (производство SD, Корея). Регистрационное удостове-

рение № 2009/05702 от 09.12.2009.

Набор реагентов идентификационный тест BD MGIT TBc для диагности-

ки туберкулеза BD MGIT™ TBc ID Test Device (Производство BD «Бектон

Дикинсон энд Компании» США). Регистрационное удостоверение ФСЗ

2010/06481 от 21.04.2011.

Панель RAPMICO для быстрорастущих микобактерий, нокардий и дру-

гих аэробных актиномицетов (Производство TREK Diagnostic Systems,

Magellan Biosciences Sensititre, Англия). Регистрационное удостоверение

ФСЗ 2008/02636 от 17/09/2008.

Панель SLOWMYCO, MIC для медленнорорастущих микобактерий.

(ПроизводствоTREK Diagnostic Systems, Magellan Biosciences Sensititre, Ан-

глия). Регистрационное удостоверение ФСЗ 2008/02636 от 17/09/2008.

Комплект реагентов «Проба-Рапид» Комплект реагентов для выделения

ДНК. Компания «ДНК-технология» Россия. Регистрационное удостовере-

ние ФСР 2008/02939.

Комплект реагентов «ПРОБА-НК»/«ПРОБА-НК-ПЛЮС». Комплект реаген-

тов для выделения РНК и ДНК (Компания «ДНК-технология» Россия). Реги-

страционное удостоверение ФСР № 2010/08857.

Комплект реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза

(Mycobacterium tuberculosis - Mycobacterium bovis complex) (Компания «ДНК-

технология» Россия). Регистрационное удостоверение ФСР № 2008/03849.

Комплект реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза

(Mycobacterium tuberculosis) (Компания «ДНК-технология» Россия). Реги-

страционное удостоверение ФСР № 2008/03849.

10. Комплект реагентов для обнаружения M. tuberculosis (с целью дифференци-

ровки от M. bovis) (Компания «ДНК-технология» Россия). Регистрационное

удостоверение ФСР 2008/03849.

11. Комплект реагентов М-СОРБ-ТУБ. Специально адаптированный набор для

выделения ДНК из клинического материала. (НПК СИНТОЛ, Россия). Реги-

страционное удостоверение № ФСР 2010/07635.

12. Комплект реагентов АМПЛИТУБ-РВ. Набор реагентов для обнаружения

и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного ком-

плекса (НПК СИНТОЛ, Россия). Регистрационное удостоверение № ФСР

2010/07635.

13. Комплект реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ. Набор реагентов для быстрого

определения антибиотикоустойчивости микобактерий туберкулезного ком-

плекса (НПК СИНТОЛ, Россия). Регистрационное удостоверение № ФСР

2010/07636.

14. АМПЛИТУБ-ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ. Набор реагентов для дифференциаль-

ной диагностики видов микобактерий, входящих в M. tuberculosis complex

(M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG и др. виды). (НПК СИНТОЛ, Россия).

15. Комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала

«РИБО-преп». ООО («ИнтерЛабСервис», Россия). Регистрационное удосто-

верение: № ФСР 2008/03147.

16. Набор реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза

(Mycobacterium tuberculosis complex) в клиническом материале, культурах

микроорганизмов и объектах окружающей среды методом полимеразной

цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией Ам-

плиСенс® («ИнтерЛабСервис», Россия).

17. Набор реагентов для выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis complex в

клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с

электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном

геле «АмплиСенс® МБТ-EPh» («ИнтерЛабСервис», Россия). Регистрацион-

ное удостоверение: № ФС 012б2006/4776.

18. Набор реагентов РеалБест ДНК МВТС для выявления ДНК микобактерий

туберкулезного комплекса методом ПЦР в режиме реального времени (Век-

торБест, Россия). Регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13150.

19. Набор реагентов для определения лекарственной чувствительности к ри-

фампицину, изониазиду «ТБ-БИОЧИП-МДР» (ТБ-БИОЧИП, Россия). Реги-

страционное удостоверение № ФС 032б2004/0889-04.

20. Набор реагентов для определения лекарственной чувствительности к оф-

локсацину «ТБ-БИОЧИП-2» (ТБ-БИОЧИП, Россия). Регистрационное удо-

стоверение № ФС 01012006/3257-06.

21. Наборы реагентов для дифференциации видов внутри комплекса

M. tuberculosis: M. tuberculosis/M. canetti, M. africanum, M. bovis BCG, M. bovis

ssp bovis, M. bovis ssp. caprae, M. microti. HAIN-GenoTypeDRМТВС (Hain

Lifescience, Германия). Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02292

от 15/07/2008.

22. Наборы реагентов для определения ЛЧ к рифампицину и изониазиду (1-й

ряд) HAIN-GenoTypeDRplus (Hain Lifescience, Германия) Регистрационное

удостоверение № ФСР 2008/02292 от 15/07/2008.

23. Наборы реагентов для определения ЛЧ к фторхинолонам, аминогликозидам

и/или циклическим пептидам и этамбутолу (2-й ряд) HAIN-GenoTypeDRsl

(Hain Lifescience, Германия). Регистрационное удостоверение

№ ФСР

2011/09233 от 09/03/2011.

24. GenoType® Mycobacteria Direct. Определение комплекса микобактерий ту-

беркулеза (M. tuberculosis complex) и четырех клинически значимых видов

микобактерий (Hain Lifescience, Германия). Регистрационное удостоверение

№ ФСР 2011/09232 от 09/03/2011.

25. Наборы реагентов для выявления M. tuberculosis complex из диагностическо-

го материала и определения ЛЧ к рифампицину Xpert MTB/RIF (экспресс

случаи) картридж Xpert MTB/RIF (Cepheid, США). Регистрационное удосто-

верение ФСЗ 2009/05723 от 28/06/2012.

26. Наборы реагентов для идентификации микобактерий HAIN-GenoTypeCM

- 14 видов M. avium ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae,

M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense,

M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, M.xenopi, M. tuberculosis complex. (Hain

Lifescience, Германия). Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02294

от 15/07/2008.

27. Наборы реагентов для идентификации микобактерий HAIN-GenoTypeAS

- 17 видов M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis,

M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai, M. intermedium,

M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum,

M. shimoidei (Hain Lifescience, Германия). Регистрационное удостоверение №

ФСР 2008/02296 от 15/07/2008.

28. Наборы реагентов для идентификации микобактерий HAIN-GenoType

MTBС - микобактерий внутри туберкулезного комплекса M. tuberculisis

complex - M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti, M. canettii (Hain

Lifescience, Германия). Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02297

от 15/07/2008.