Отчёт об экспериментально-клиническом изучении безопасности и биологической активности биологически активной добавки к пище «Активит Антиоксидант» производства ЗАО "Фармпроект"

 

  Главная      Учебники - Разные    

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 



 

 

image


 

Отчёт об экспериментально-клиническом изучении безопасности и биологической активности биологически активной добавки к пище «Активит Антиоксидант» производства ЗАО "Фармпроект"


 

 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ


 

-ЛП — -липопротеиды

F — female — самка

GLP — «Good Laboratory Practice» — «Добротная лабораторная практика» АлАТ — аланинаминотрансфераза

АО — антиоксиданты

АсАТ — аспартатаминотрансфераза

БАД — биологически-активная добавка (к пище) в/ж — внутрижелудочно

ДК — диеновые конъюгаты

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт КСО — ксантиноксидаза

ЛД50 — среднесмертельная доза ЛД50 — среднесмертельная доза ЛДГ — лактатдегидрогеназа

М — male — самец

МДА — малоновый диальдегид МК — массовый коэффициент

НАД — никотинамидадениндинуклеотид НАДФ — никотинамидадениндинуклеотид фосфат НСТ — нитросиний тетразолий

НЭЖК — неэтерифицированные жирные кислоты ОБ — общий билирубин

ОЛ — общие липиды

ОШ — основания Шиффа

ПОЛ — перекисное окисление липидов

РСЛЛ — реакция специфического лизиса лейкоцитов СОД — супероксиддисмутаза

СПП — суммационно-пороговый показатель ТГ — триглицериды

ТК — триеновые конъюгаты

УРПИ — условный рефлекс пассивного избегания ФЛ — фосфолипиды

Х — холестерин

ЧСС — частота сердечных сокращений ЩФ — щелочная фосфатаза

ЩФ — щелочная фосфатаза

ЭКГ — электрокардиограмма

РЕФЕРАТ


 

Отчет изложен на 68 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц, 8 рисунков и включает 64 литературных источника.

Объект исследования – многокомпонентная пищевая биологическая активная добавка (БАД) «Активит Антиоксидант», содержащая субстратные антиоксиданты, восстанавливающие их тиолы и ингибиторы изменения степени окисления металлов переменной валентности.

Цель работы – исследование безопасности БАД, содержащих антиоксиданты, и их эффективности на моделях ишемических поражений, а также в условиях воздействия на организм неблагоприятных факторов.

В ходе токсикологического эксперимента с применением фармакологических, электрофизиологических и морфологических методик были изучены параметры токсичности трех экспериментальных рецептур БАД с заданными антиоксидантными свойствами и проверена их эффективность на моделях влияния на организм неблагоприятных факторов.

В результате экспериментальных исследований был оптимизирован состав БАД

«Активит-эколоджи» и изучена ее безопасность и эффективность в соответствии с существующей нормативной документацией.

Показано, что исследуемая БАД малотоксична, безопасна и обладает антиоксидантным, антигипоксантным и адаптогенным действиями, эффективна при экспериментальном атеросклерозе, имеет кардио- и нейропротективные свойства.


 

Ключевые слова: БАД «Активит Антиоксидант»; безопасность; эффективность, антиоксиданты, адаптогенные свойства, профилактика сердечно-сосудистых заболеваний

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 7

  1. Литературный обзор: современные представления о цитопротективном действии антиоксидантов 9

  2. Цитируемая литература 14

  3. Методические подходы к созданию антиоксидантных рецептур 17

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 20

  1. Предварительное изучение биологической активности рецептур БАД

    «Активит-эколоджи» 20

    1. Влияние БАД на устойчивость крыс к воздействию высоких температур 20

    2. Влияние БАД на процессы памяти 21

    3. Влияние БАД на детоксикацию липофильных ксенобиотиков 23

    4. Влияние БАД на устойчивость крыс к воздействию

      гиперкапнической гипоксии 24

    5. Влияние БАД на степень ишемических повреждений головного

      мозга при стенозе двух сонных артерий 25

  2. Предварительное изучение безопасности рецептур БАД «Активит- эколоджи» 29

    1. Влияние БАД на прирост массы тела крыс 29

    2. Влияние БАД на поведение крыс и их условно-рефлекторную деятельность 30

    3. Влияние БАД на гематологические показатели у крыс 32

    4. Влияние БАД на выделительную функцию почек 34

    5. Влияние БАД на биохимические показатели у крыс 36

      6,32+0,32.............................................................................................................................. 36

    6. Влияние БАД на сердечно-сосудистую систему 37

    7. Влияние БАД на структуру внутренних органов 39

    8. Местно-раздражающее действие БАД 40

  3. Исследование безопасности новой отобранной рецептуры БАД

    «Активит-эколоджи» 44

    1. Санитарно-химический анализ 44

    2. Исследование острой токсичности 45

    3. Хроническая токсичность и способность к кумуляции 47

    4. Исследование раздражающего действия 51

      1. Местное действие на кожу 51

      2. Действие на слизистую оболочку глаз 51

    5. Сенсибилизирующее действие 52

    6. Изучение возможных отдаленных последствий 52

  4. Исследования биологической активности 54

    1. Измерение антиоксидантной активности in vitro 54

    2. Антигипоксическое действие 54

    3. Показатели функционального состояния адаптационных систем организма 56

    4. Влияние на длительность плавания мышей 57

    5. Влияние БАД на статико-силовую выносливость мышей 58

    6. Эффективность БАД при экспериментальном атеросклерозе 59

      1. Модель гиперлипидемии 59

      2. Эффективность БАД при экспериментальном атеросклерозе у

        крыс со специальной диетой 60

      3. Эффективность БАД «Активит Антиоксидант» при экспериментальном липолизе у крыс 62

    7. Кардио- и нейропротективное действие БАД при алкогольной интоксикации 63

      1. Материалы и методы исследования 63

      2. Результаты исследования 64

  5. Результаты применения БАД «Активит-эколоджи» добровольцами 66

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 67

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 68

ВВЕДЕНИЕ


 

Антиоксиданты традиционно используются для усиления сопротивляемости организма к различным воздействиям, однако, несмотря на многочисленные работы о механизмах их действия, порядке применения, эффективности при различных состояниях и побочных эффектах от несбалансированного применения остаются недостаточно разработанными. Поэтому ЗАО «Фармпроект» ( г. Санкт-Петербург) разработало БАД «Активит Антиоксидант», содержащую в своем составе известные антиоксиданты.

БАД показана как профилактическое средство при сердечно-сосудистых заболеваниях (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, гипертония), для улучшения состояния больных при постинфарктной реабилитации. Применяется по 1-2 капсулы в день во время приема пищи в течение 20-30 дней.

Настоящая работа была выполнена в Институте токсикологии МЗ РФ в испытательной токсикологической лаборатории лекарственных препаратов, продуктов питания и объектов окружающей среды «АНАЛЭКТ» (аттестат аккредитации № РОСС RU.0001.514726 от 06.02.2004; сертификат аккредитации № ГСЭН.RU.ЦОА.312 от 06.03.2002 Минздрава РФ).

Объем исследований включал санитарно-химический анализ и оценку следующих токсикологических характеристик:

  1. Острая токсичность при внутрижелудочном введении.

  2. Способность к кумуляции.

  3. Возможное раздражающее действие.

  4. Возможное сенсибилизирующее действие.

  5. Возможные отдаленные последствия.

Оценка предполагаемой биологической активности была проведена в трех направлениях:

  1. Изучение антиоксидантных и антигипоксантных свойств.

  2. Изучение адаптогенной активности.

  3. Изучение противосклеротического действия и эффективности на моделях заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Исследования были выполнены в соответствии со следующими нормативными документами:

  1. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище. МУК 2.3.2.721-98. МЗ РФ. М., 1999, 87 с.

  2. Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны. № 2163-80. М., 1980, 19 с.

  3. Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны. Методические рекомендации. № 2121-80, М., 1980, 16 с.

  4. СаНПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценностипродовольственного сырья и пищевых продуктов. М., 2002, 270 с.

    5. НРБ-99.


     

    При изучении безопасности и эффективности новой БАД исходили из того, что она является нутрицевтиком со свойствами парафармацевтика.

    1. Литературный обзор: современные представления о цитопротективном действии антиоксидантов


       

      Свободнорадикальные процессы играют существенную роль в обеспечении жизнедеятельности клеток. Регуляторная функция прооксидантов, а также присутствие их в качестве промежуточных продуктов в ряде жизненно важных ферментативных реакций, наряду с участием в процессах естественной деградации структур клеток, определяют актуальность исследований, посвященных оценке их продукции и инактивации. Совершенствование знаний о механизмах окислительно- восстановительных процессов в организме позволяет определить оксидативный стресс как состояние несоответствия продукции свободных радикалов (СР) емкости антиоксидантных систем, вследствие чего формируются предпосылки для избыточного окисления биосубстратов, модификации и необратимого изменения ферментных систем, нарушения структуры и проницаемости биологических мембран, энергетического дефицита и снижения жизнеспособности клеток. Несоответствие продукции прооксидантов степени их инактивации может развиваться как при чрезмерном образовании свободных кислородных радикалов, так и при истощении антирадикальных систем даже при стационарном уровне генерации биологических окислителей.

      Представления о биологической роли свободнорадикальных реакций претерпели за последнее десятилетие существенную эволюцию в связи с открытиями в области ферментативного катализа и регуляции клеточного цикла. Действительно, образование свободных радикалов как нестабильных чрезвычайно реактогенных соединений отмечено при протекании различных биологических процессов в условиях нормы и патологии. При патологических состояниях возможна чрезмерная продукция свободных радикалов, обеспечивающих в естественных условиях регуляторные функции и принимающих участие в биодеградации «изношенного» пластического материала, что приводит к развитию дополнительных повреждений структур клетки. Указанные обстоятельства определили пристальное внимание к оценке регуляции процессов свободнорадикального окисления и актуальность разработки антиоксидантных рецептур, компенсирующих недостаток эндогенных детоксикационных факторов.

      В аэробных биологических системах в той или иной мере всегда выполняются условия для поддержания процессов свободно-радикального окисления (СРО) [23]. При этом образуется целый ряд биологических окислителей, обладающих высокой химической активностью и способных модифицировать структуру любой биомолекулы. Поддержание такой окислительной модификации на стационарном уровне осуществляется при участии систем антиоксидантной защиты. В этой связи чрезвычайно важно выяснение соотношения между прооксидантными и

      антиоксидантными системами организма. Изменение этих соотношений может привести к избыточной активации СРО и фатальным изменениям в биологических системах.

      В настоящее время значительное распространение получил термин

      «оксидативный стресс», под которым понимают состояние гиперпродукции свободных радикалов при функциональной несостоятельности антиоксидантных систем. Изучение «оксидативного стресса» началось с оценки перекисного окисления липидов (ПОЛ), однако вскоре было показано, что окислению могут подвергаться не только полиненасыщенные жирные кислоты мембран, но и белки, часть из которых выполняет ферментативную функцию, а также ДНК, что проявляется в увеличении числа мутаций.

      Анализ публикаций, касающийся использования различных антиоксидантов патологических процессах, протекающих с гиперпродукцией СР убедительно свидетельствует о высокой эффективности многокомпонентных антиоксидантных рецептур, состоящих из витаминов (ретинола, токоферола и аскорбиновой кислоты) [3, 8, 25, 28, 29]. Показано, в частности, что усиление терапевтического действия жиро- и водорастворимых антиоксидантов происходит при их сочетанном применении [18, 29]. Кроме того, для обеспечения рециклирования окисленных форм жирорастворимых гасителей свободных радикалов необходимо присутствие водорастворимых антиоксидантов [41]. Было показано, что жирорастворимые антиоксиданты могут потенцировать активность друг друга [24, 48], которая существенно повышается в присутствии холестерина [41]. Активность жирорастворимых антиоксидантов значимо возрастает при сочетанном применении с селенитом натрия [15, 35, 36].

      Следует отметить, что биологические мембраны являются наиболее уязвимыми структурами, подверженными свободнорадикальным повреждениям. Благодаря наличию большого количества полиненасыщенных жирных кислот, в которых СН2 группы, стоящие между двойными связями, наиболее часто становятся донорами электронов при прооксидантной атаке, мембраны могут становиться местом протекания каскадных свободнорадикальных процессов, затрагивающих всю клетку. Сами мембраны, даже при высоком содержании окисленных фрагментов не перестают выполнять свои функции [8] до тех пор пока не изменяется их жидкокристалическое состояние, однако повреждение мембранных рецепторов и ионных каналов может приводить к фатальным повреждениям клеток.

      Для подавления свободнорадикальных реакций в липидном бислое целесообразно использовать жирорастворимые антиоксиданты (ретинол и токоферол).

      Витамин Е за счет гидроксильной группы при бензольном кольце представляет собой донор электронов, которые при рекомбинации с радикалом образует стабильное соединение. При взаимодействии с прооксидантом (окислителем) восстановитель токоферол формирует редокс-пару с окислительно-

      восстановительным потенциалом в несколько Вольт (для гидроксильного радикала 2,7 В), что обеспечивает однонаправленное протекание окислительно- восстановительной реакции [30]. Лишенный же электрона витамин Е превращается в малоактивный токоферильный радикал [37]. В присутствии восстановленной формы водорастворимого антиоксиданта аскорбиновой кислоты токоферол способен восстанавливать свою активность посредством прямого рециклирования [42, 44, 46].

      Другой жирорастворимый антиоксидант ретинол, который в большинстве случаев находится в тканях в виде эфиров пальмитиновой кислоты накапливается в печени в виде суданофильной грануляции в клетках Ито [40]. Было показано, что его антиоксидантные свойства существенно возрастают при сочетанном применении с селенитом натрия [2]. Доказано также, что при комбинации витаминов А и Е можно достичь потенцирования антиоксидантного эффекта в случае избытка токоферола, тогда как избыток ретинола будет снижать антиоксидантные свойства композиции [48]. По-видимому, витамины А и Е могут формировать в мембране динамичные сенсорно-проводящие комплексы, обеспечивающие гашение свободно-радикальных процессов в диэлектрической среде, когда одна молекула антиоксиданта приходится в среднем на 300-500 молекул фосфолипидов [22].

      Ингибирование ферментных систем генерации активных форм кислорода хорошо известными фармакопейными препаратами может быть весьма эффективным лечебным мероприятием [14, 49], однако, следует отметить, что ферментативные и неферментативные составляющие антиоксидантной защиты эффективно работают только в соответствующих комплексах [7].

      Особую роль в функционировании как вне-, так и внутриклеточных антиоксидантных систем организма играют соединения, в состав которых входят SH- содержащие аминокислоты: цистеин, цистин, метионин. Наиболее значимое место среди водорастворимых тиолов принадлежит глутатиону, трипептиду цистеина, глутаминовой кислоты и глицина, формирущего окислительно-восстановительную тиолдисульфидную систему [11, 26, 45]. Установлено, что SH-содержащие соединения подвергаются окислению в первую очередь, предохраняя тем самым другие функциональные группы и молекулы [38]. Сдвиги равновесия между SH- и SS- формами тиолов приводят к радикальной перестройке режимов жизнедеятельности клетки: изменению фукционального состояния клеточных рецепторов и факторов транскрипции, активности ферментов (в т.ч. антиоксидантных), проницаемости клеточных мембран, интенсивности метаболических процессов [1, 12]. Отклонение равновесия в сторону окисления может оказаться критическим для клеточных физиологических процессов и имеет существенное значение в генезе различных форм патологии [26, 39]. Поэтому соотношение восстановленных и окисленных SH-групп в биосредах, их способность к окислительной модификации (антирадикальная емкость) считаются важными критериями неспецифической резистентности организма [26, 27, 31].

      SH-содержащим соединениям, в первую очередь глутатиону, принадлежит ведущая роль в защите клеток от радикала ОН., в восстановлении окисленных форм других жиро-и водорастворимых антиоксидантов, в поддержании специфической активности антиоксидантных энзимов, а также в обеспечении функционирования биохимических механизмов детоксикации ксенобиотиков. Именно поэтому глутатион принято считать узловым звеном биохимического гомеостатирования внутренней среды организма [16, 32].

      В настоящее время невозможно пополнение внутриклеточного пула глутатиона посредством его введения извне, даже в виде его эфиров – тиопоэтинов [5], вследствие отсутствия у него пенетрантной способности по отношению к клеточным мембранам. Поэтому основной путь повышения антирадикальной емкости биологических систем состоит в насыщении биосред малотоксичными легкоокисляющимися соединениями, своеобразными химическими ловушками активных форм и радикалов кислорода. В качестве таких гасителей радикалов могут выступать глюкоза, диметилсульфоксид, мочевая кислота, одно- и многоатомные спирты. Именно исходя из этого, можно объяснить слабый радиопротекторный эффект алкоголя в дозах, вызывающих среднюю степень опьянения [17, 34]. Этим соединениям еще предстоит найти свое место среди препаратов, предназначенных для фармокологической коррекции проявлений оксидативного стресса.

      Селен выступает в роли аналога серы, элемента 6 группы, проявляющий в достаточно малых концентрациях сильный токсический эффект [19], тогда как в микроколичествах способный усиливать действие антиоксидантов [2]. Суммарные данные о токсичности и потребности селена получены приемущественно учеными из Новосибирского научного центра и сведены в таблице 1.1 [19].


       

      Таблица 1 . 1

      Действие селена на организм при различном содержании в воде и в пище


       

      Суммарная суточная доза, мкг/кг

      Действие

      8

      Дефицит

      25-33

      Оптимальное

      750

      Токсическое


       

      Эпидемиологические исследования доказали тесную отрицательную связь между заболеваемостью населения злокачественными новообразованиями и содержанием селена в потребляемой пище. Снижение содержания селена в крови ниже 45 мкг/л (при норме 150-250 мкг/л [10]) увеличивает риск возникновения рака в 3,1 раза [47]. Установление роли селена как незаменимого для организма микроэлемента послужило основанием для его включения в список обязательных нутриентов в европейских странах и США для беременных и кормящих матерей в количестве 55- 75 мкг/сутки [6], что почти вдвое превышает данные российских ученых.

      Селен входит в состав активного центра ключевого фермента антирадикальной защиты глутатионпероксидазы, повышение активности которой реципрокно активирует другие ферменты обмена глутатиона [9, 13, 21, 43]. Кроме того, сам селен в составе селенита натрия имеет степень окисления +4 и обладает свойствами достаточно сильного окислителя с потенциалом +0,74 В [33]. Из этого следует, что селенитный ион способен выполнять в организме роль прооксиданта, превращаясь в элементарный селен. Действительно селенит натрия способен окислять аскорбиновую кислоту до дигиброаскорбиновой [4], ненасыщенные углеводороды в спирты [20], а также 6-метилурацил ДНК до его дериватов [50]. Этим определяются токсические эффекты селена и трудность его использования в составе антиоксидантных рецептур, содержащих аскорбиновую кислоту. Вместе с тем, именно благодаря прооксидантным эффектам селен в микроколичествах способен стабилизировать степень окисления металлов переменной валентности, предотвращая реакции Фентона с образованием самого сильного биологического окислителя – гидроксильного радикала. Будучи аналогом серы селен способен образовывать селеноспирты и селенокислоты, а восстановительные свойства группы SeH, заметно выше, чем у тиольной группировки SH.

      Таким образом, современные представления о развитии процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул определяют комплексный подход в применении антиоксидантов и актуализируют создание высокоэффективных сбалансированных хорошо переносимых рецептур на основе:

      • ловушек свободных радикалов, реализующих свои эффекты в водо- (аскорбат)

        и жирорастворимой (этанол, токоферол) фазах;

      • восстанавливающих их низкомолекулярных тиолов (метионин, унитиол, липоевая кислота, эфиры цистеина), выполняющих роль протеза глутатиона, попытки введения которого извне были малоэффективными;

      • соединений селена, усиливающих действие антиоксидантов. Соединения селена должны применяться в адекватных количествах, исключающих токсические эффекты микроэлемента.

    2. Цитируемая литература

  1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.Н. Человек и противоокислительные вещества. - Л.: Наука. Ленингр.отд-ние. - 1985. - 232 с.

  2. Авакян А.О., Мкртчян М.А., Тапалцян С.Х. и др. // Теоретические и прикладные аспекты изучения питания человека / Ин-т питания АМН СССР. – М., 1980. – С. 114.

  3. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудрящов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. – СПб.: Наука, 1992. – 148 с.

  4. Берка А., Вултерин Я., Зыка Я. Новые редокс-методы в аналитической химии.

    – М.: Химия 1968. – 318 с.

  5. Борисов А.Е., Кожемякин Л.А., Антушевич А.Е. и др. // Вестн. хирургии. – 2001. – Т. 160, № 4. – С. 32-38.

6. Воронцов И.М. // Педиатрия. – 1999. - № 5. – С. 87-92.

  1. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. // Вопр. мед.химии. - 1992. - № 4. - с.21.

  2. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: Пер. с англ. – М.: Мир, 1997. – 624 с.

  3. Гусейнов Г.М., Насибов Э.М., Джафаров А.И. // Биохимия. – 1990. – Т. 55, № 3. – С. 499-507.

  4. Иванов В.Н., Никитина Л.П., Вощенко А.В. // Экологозависимые состояния: Тез. докл. Всерос. научно-практической конф. – Чита, 1998. – С. 45-46.

  5. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. // Успехи соврем.биологии. - 1989. - Т. 107, № 2. - С.179-194.

  6. Котеров А.Н., Филиппович И.В. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1995. - Т.35, № 2. - С. 162-180.

  7. Кругликова Г.О., Штутман Ц.М. // Укр. бiохим. журн. -. 1976. – Т. 48, № 2. – С. 223-228.

  8. Мамучишвили Н.К., Фролов Ю.И., Гончар-Зайкин А.П., Яковлев А.Я. // Воен.- мед. журн. - 1996. - № 1. - С.29-31.

  9. Меджидов М.М., Алиев А.А., Рзаева Д.А. и др. // Тез. докл. IV конф.

    «Биоантиоксидант». – М., 1993. – Т. 1. – С. 138.

  10. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. // Успехи соврем.биологии. - 1993. - Т. 113, № 4. - С. 442-455.

  11. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. // Успехи соврем.биологии. - 1997. - Т. 117, № 2. - С. 155-171.

  12. Морозова Т.С., Суколинский В.Н., Стрельников А.В. // Вопр. мед. химии. – 1991. – Т. 37., № 6. – С. 59-61.

  13. Новиков Ю.В., Плитман С.И., Секлетина Н.И., Ноаров Ю.А. // Гигиена и санитария. – 1984. - № 9. – С. 66-68.

  14. Общая органическая химия / Под ред. Д. Бартона, В.Д. Оллиса. – М.: Химия, 1982. – Т. 2. – 528 с.

21. Паранич А.В. // Физиол. журн. – 1984. - № 2. – С. 217-222.

  1. Плужников Н.Н., Бакулина Л.С., Легеза В.И. и др. // Актуальные проблемы и перспективы развития военной медицины. – Т. 4. Под ред. Н.Н. Плужникова. – СПб, 2003. - С. 123-139.

  2. Плужников Н.Н., Чиж С.И., Юзвинкевич Л.С. и др. // Актуальные проблемы и перспективы развития военной медицины. – Т. 2. Под ред. Н.Н. Плужникова. – СПб, 2000. - С. 193-223.

  3. Рутковская Ж.А. Антиоксидантная система организма и ее коррекция новым комплексом -каротина и витаминов А, Е, С при действии ионизирующего излучения: Автореф. дисс. … канд. биол. наук. – Минск, 1996. – 17 с.

  4. Рябченко Н.И., Иванник Б.П., Хорохорина В.А. и др. // Радиац. биология. Радиоэкология. – 1996. – Т. 36., № 6. – С. 895-898.

26. Соколовский В.В. // Вопр.мед.химии. - 1988. - Т.34, № 6. - С.2-11.

27. Соколовский В.В. Толдисульфидное соотношение крови как показатель неспецифической резистентности организма: Учеб. пособие. - СПб.: МАПО, 1996. - 29 с.

28. Степуро И.И. // Вопр. мед. химии. – 1992. – Т. 38, № 4. – С. 26-33. 29. Суколинский В.Н. // Вопр. онкологии. – 1990. – Т. 36, № 2. – С. 138-144.

30. Тимофеев-Ресовский Н.В., Савич А.В., Шальнов М.И. Введение в молекулярную радиобиологию (физико-химические основы). – М.: Медицина, 1981. – 320 с.

31. Тиунов Л.А. // Вестн.РАМН. - 1995. - № 3. - С.9-13.

  1. Тиунов Л.А., Иванова В.А. // Вестн. АМН СССР. - 1988. - № 1. - С.62-69.

  2. Турьян Я.И. Окислительно-восстановительные потенциалы в аналитической химии. – М.: Химия, 1989. – 243 с.

  3. Ушаков И.Б., Лапаев В.Э., Воронцова З.А., Должанов А.Я. Радиация и алкоголь. - Воронеж, 1998. - 248 с.

  4. Холмухамедова Н.М. // Тез. докл. IV конф. «Биоантиоксидант». – М., 1993. – Т. 2. – С. 93-94.

  5. Холмухамедова Н.М., Зиямутдинова З.К., Николаев А.И. // Тез. докл. IV конф.

«Биоантиоксидант». – М., 1993. – Т. 1. – С. 180.

37. Храпова Н.Г. // Биофизика. – 1977. – Т. 22, № 3. – С. 436-443.

  1. Arnhold J. Hammerschmidt S., Arnold K. // Biohim.Biophys.Acta. - 1991. - Vol. 1097, № 2. - P.145-151.

  2. Fliss H., Menard M. // Arch. Biochem. Biophys. - 1992. - Vol.293, № 1. - P.195- 199.

40. Friedman S.L. // Semin. Liver Dis. – 1999. – Vol. 19, N 2. – P. 129-140.

  1. Fukuzawa K., Chida M., Duchi S. et al. // Vitamins. – 1982. – Vol. 56, N 12. – P. 641-652.

  2. Halpner A.D., Handelman G.J., Harris J.M. et al. // Arch. Biochem. Biophis. – 1998.

– Vol. 359, N 2. – P. 305-309.

43. Harrison J.H., Conrad H.R. // J. Dairy Sci. – 1984. – Vol. 67, N 19. – P. 2464-2470.

  1. May S.M., An Z., Mendiratta S. // Arch. Biochem. Biophis. – 1998. – Vol. 359, N 2.

    – P. 281-289.

  2. Meister A., Anderson M.E. Glutathione // Ann.Rev.Biochem. - 1983. - Vol.52, № 3. - P.711-760.

  3. Scarpa M., Regio A., Majorino M. et al. // Biochem. Biophis. Acta. – 1985. – Vol. 801. – N. 2. – P. 201-237.

  4. Shamberger R.T. // Biochem. Essent. Ultratruse. Elem. – N.Y., 1984. – P. 215-219.

  5. Tesoriere L., Bongiorno A., Pintandi A.M. et al. // Arch. biochem. biophis. – 1996.

    – Vol. 326, N 1. – P. 57-63.

  6. Trojsi E., Battaglia D., Costume A., Bertini A. II ruolo della riperfusione nella pato- genesi della sindrome da schiacciamento // G. Med. Milit. - 1997. - Vol.143, № 2.

    - P.180-183.

  7. Zee-Chang K.Y., Cheng C.C. // J. Heterocycl. Chem. – 1967. – Vol. 4, N 1. – P. 163-165.

3. Методические подходы к созданию антиоксидантных рецептур


 

Совершенствование знаний о механизмах окислительного повреждения при развитии различных патологических процессов позволит направленно применять препараты, блокирующие образование свободных радикалов, однако в настоящее время реализовать данный подход к профилактике и терапии повреждений не представляется возможным. Его реализация не может обеспечить универсального безопасного применения антиоксидантных рецептур по аналогии с естественными метаболитами – ловушками свободных радикалов.

Известны попытки создания фармакопейных витаминно-минеральных комплексов и БАД, содержащих несколько антиоксидантов, однако ни в одном случае, кроме рецептур семейства «Активит» не был реализован комплексный подход к формированию антиоксидантной рецептуры.

Фирма ICN осуществляла выпуск препарата «Олигогал-Se», включающий витамины А, С и Е, а также органически связанный Se. К сожалению, этот высокоэффективный комплекс в настоящее время отсутствует на фармацевтическом рынке. Наиболее близким аналогом этого препарата являются сложные витаминно- минеральные комплексы «Триовит» и «Сельмевит». Из числа инъекционных форм следует привести препарат «Аскотиол», содержащий тиосульфат натрия, трансформирующийся в SH-содержащий изомер, и аскорбиновую кислоту. Препарат удобен для неотложной терапии, однако в этом случае липотропные антиоксиданты должны добавляться отдельно.

Известен опыт создания БАД с антиоксидантами. В частности препарат «Селен- актив» содержит 50 мг аскорбиновой кислоты и органически связанный селен. Хорошо изучены антиоксидантные свойства БАД, содержащих -каротин, витамины С и Е. Эти препараты оказывали умеренное адаптогенное действие и рекомендовались для применения в гериатрической практике для продления работоспособного возраста пожилых людей. Вместе с тем ни один препарат не содержит обоснованного набора компонентов, способных эффективно взаимодействовать друг с другом в составе антиоксидантных комплексов. Необходимость введения серы в состав рецептур впервые после гомеопатических средств была актуализирована фирмой «Эскомон», которая организовала производство пивных дрожжей с селеном, серой, аскорбиновой кислотой, цинком и др. Остается сожалеть, что данные компоненты вводились в рецептуру поодиночке. Вместе с тем, это достаточно эффективные комплексы, которые в определенной степени можно считать прототипами заявляемых препаратов, однако ни в одном из них принцип комплексного составления антиоксидантных рецептур не реализован полностью. Отсутствует адекватно обоснованное соотношение антиоксидантов с

учетом их роли в процессах детоксикации свободных радикалов, что снижает антирадикальную емкость рецептур.

Предметом дискуссии остается включение в профилактическую рецептуру других витаминов и микроэлементов, наподобие препарата «Сельмевит». Известно, что при комбинации более 7 средств побочные эффекты препаратов могут превышать прямой терапевтический эффект. Проблема обостряется тем, что в многокомпонентных препаратах зачастую компоненты, содержащиеся в микроколичествах, инактивируются друг другом или компонентом наиболее представленным в комплексе. Эти обстоятельства существенно снижают ценность большинства многокомпонентных рецептур, составленных только на основании суточной потребности организма в определенных витаминах и микроэлементах. При создании рецептур группы «Активит» было установлено, что Активит Антиоксидант как восстановитель взаимодействует с селенитом натрия как сильным окислителем. Этим, с одной стороны, снижаются прооксидантные свойства селенита при его трансформации в элементарный селен, который хорошо усваивается в организме. С другой стороны, при окислении аскорбиновой кислоты в дигидроаскорбиновую ее антиоксидантные свойства существенно не меняются, особенно при избытке аскорбата.

Особый вопрос возникает при дозировании препаратов селена. Многочисленные опыты на крысах, проведенные при участии специалистов ЗАО «Фармпроект», свидетельствуют о токсических эффектах селена при месячном применении в дозах, рекомендованных американскими учеными. Вследствие этого при создании рецептур группы «Активит» учтены данные новосибирских исследователей, а дозы селена приняты оптимальная за 25-30 мкг, максимальная – 50 мкг.

Накапливаются данные об опасности передозировки витамина А, проявляющейся в том числе и в остеопорозе и повышенном риске тератогенеза, что является препятствием к беременности на протяжении 6 месяцев после приема препарата в стандартной терапевтической дозировке. Это было учтено при создании комплекса

«АктивиАнтиоксидант», в который витамин А введен в объеме суточной потребности организма для потенцирования эффектов токоферола.

Учитывая большую метаболическую значимость тиолов, целесообразно применять препараты, которые при своем метаболизме образуют структурные компоненты глутатиона, как компонента биологической антиоксидантной защиты клеток. К числу таких средств относится метионин. Кроме того, следует учитывать, что липоевая (тиоктовая) кислота, кроме своей антиоксидантной сущности является кофактором ферментативных реакций, в том числе и пируватдегидрогеназного комплекса, обеспечивающего сопряжение цитозольных и митохондриальных процессов энергетического обмена клеток.

Анализируя вышеизложенное следует заключить, что эффективно только комплексное применение низкомолекулярных антиоксидантов совместно с

восстанавливающими их тиолами и блокаторами металлов переменной валентности. Подобная комбинация обеспечивает взаимное усиление эффектов и предупреждает возможность развития прооксидантных свойств. Учитывая двойственную сущность низкомолекулярных антиоксидантов, их способность при определенных условиях выступать в качестве прооксидантов, чрезвычайно важно соблюдение строго определенного молярного соотношения тиолов и других компонентов в комплексе препаратов, а также соблюдение общей антирадикальной емкости рецептуры. В создании нового поколения рецептур «Активит» учтена возможность использования тиолов (липоевой кислоты) с дополнительной метаболической активностью, что также можно рассматривать как новый принцип в построении подобных БАД.

Таким образом, при создании БАД «Активит Антиоксидант» были применены три варианта рецептур, различающихся по содержанию селенита натрия:

Рецептура № 1:

Витамин Е – ацетат - 50 мг

Витамин А – ацетат - 1,5 мг

Витамин С - 80 мг

Селенит натрия (в пересчете на селен) - 0,02 мг Метионин - 100 мг

Липоевая кислота - 80 мг

Микрокристалическая целлюлоза - до массы содержимого капсулы 390 мг


 

Рецептура № 2:

Витамин Е – ацетат - 50 мг

Витамин А – ацетат - 1,5 мг

Витамин С - 80 мг

Селенит натрия (в пересчете на селен) - 0,05 мг Метионин - 100 мг

Липоевая кислота - 80 мг

Микрокристалическая целлюлоза - до массы содержимого капсулы 390 мг


 

Для выбора наиболее биологически активной и безопасной рецептуры были проведены предварительные скрининговые эксперименты. Их результаты представлены в следующем разделе.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

  1. Предварительное изучение биологической активности рецептур БАД «Активит Антиоксидант»


     

    Эффективность БАД оценивали на крысах после четырехнедельного ежедневного однократного внутрижелудочного (через зонд) применения рецептур «Активит Антиоксидант» в одиночной и удвоенной дозе. Дозу БАД рассчитывали, исходя из массы капсулы (390 мг), предназначенной для приема среднестатистическим человеком массой 60 кг. Опыты выполняли на белых крысах-самцах, полученных из питомника РАМН «Рапполово» с начальной массой тела 220-300 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария на пищевом рационе, регламентированном приказом МЗ № 1179 от 10.10.83 г.


     

    1. Влияние БАД на устойчивость крыс к воздействию высоких температур

      Воздействие температурного фактора традиционно используется для оценки адаптогенных свойств БАД и позволяет провести комплексную оценку влияния средств на метаболичекие системы, устойчивость функционирования которых в условиях гипертермии определяет выживаемость особей.

      Для оценки устойчивости крыс в условиях гипертермии группы по 6 животных в клетке (одна экспериментальная группа) помещали в вентилируемый термостат и выдерживали при температуре 60 оС. Устройство термокамеры позволяло обеспечить адекватный газообмен, достаточный для предупреждения кислородной недостаточности, и предусматривало наблюдение за животными через смотровое застекленное отверстие. В ходе наблюдения регистрировали развитие симптоматики поражения и отмечали время манифестации судорожного синдрома и время гибели особей. Результаты экспериментов приведены в таблице 1.1.1.

      Таблица 1 . 1 . 1

      Влияние комплексных антиоксидантных БАД при четырехнедельном введении на устойчивость крыс к воздействию высоких температур (X+mx, n=6)


       

      Вариант введения БАД

      Контролируемый показатель, мин

      Начало судорог

      Время гибели

      Дистиллированная вода (контроль)

      33,2+1,6

      40,0+2,2

      «Активит-эколоджи», рецептура № 1, 1 доза

      40,8+1,7

      44,7+1,9

      «Активит-эколоджи», рецептура № 2, 1 доза

      37,5+2,2

      40,7+2,0

      Примечание: различия с контролем не достоверны


       

      Данные, приведенные в таблице 1.1.1, свидетельствуют о том, что исследуемые рецептуры БАД при четырехнедельном применении оказывают положительное

      влияние на устойчивость крыс к гипертермии. Насыщение тканей тиоловыми антиоксидантами, по-видимому, способствует более интенсивной инактивации кислородных и азотистых радикалов, роль которых в развитии судорожной готовности в настоящее время считается доказанной. Скорость развития судорожного синдрома у животных, получавших БАД, имела отчетливую тенденцию к снижению, а продолжительность жизни животных подопытных групп в условиях гипертермии достоверно увеличивалась при приеме БАД с низким содержанием селена (рецептура

      № 1).

      Результаты экспериментов дают основание считать, что исследуемые рецептуры БАД, в особенности рецептура № 1, обладают адаптогенным действием и при курсовом применении способны увеличить устойчивость к воздействию экстремальных факторов, а также повысить толерантность организма к физическим нагрузкам.


       

    2. Влияние БАД на процессы памяти

      Для определения нейротрофических эффектов рецептур БАД с антиоксидантами оценивали их влияние на память крыс, оцениваемую по степени формирования и закрепления у крыс элементарных оборонительных условных рефлексов, в частности условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Наблюдение за угасанием УРПИ дает возможность регистрировать нарушения высшей нервной деятельности (ВНД) в динамике и может быть использовано в хроническом опыте.

      Аппарат для выработки рефлекса пассивного избегания представлял собой длинный фанерный ящик, разделенный на 6 отсеков. Каждый отсек состоял из освещенной камеры, в которой монтировали лампу накаливания мощностью 40 Вт, и затемненной камеры, пол которой выполнен медными стержнями диаметром 2 мм, к которым через латер и замыкающий ключ подавали ток от сети. Камеры были разделены перегородкой с отверстием, которое перекрывалось заслонкой.

      Предварительно производили отбор крыс с легко вырабатываемым рефлексом. Отбраковывали животных, которые после помещения в светлую камеру не заходили в темную зону в течение 60 секунд или находились в ней менее 15 секунд.

      Для выработки рефлекса 6 крыс одномоментно помещали в освещенную камеру, хвостом к отверстию в перегородке. Обследуя светлую камеру, крысы находили отверстие и переходили в темную зону. В это время отверстие закрывали перегородкой и крыс подвергали импульсному воздействию электрического тока (пять ударов продолжительностью по 10 секунд при напряжении 40 В). После раздражения отверстие открывали и крысы переходили в ярко освещенные камеры. Рефлекс считался выработанным и сохранившимся в случае пребывания крысы в освещенной зоне более 1 мин. УРПИ формировали через 14 суток после начала применения БАД, а его проявления регистрировали до окончания приема БАД и на

      22

      протяжении недельного восстановительного периода. Результаты экспериментов представлены на рисунке 1.2.1.


       


       

      Контроль Активит Антиоксидант

       


       

      Рисунок 1.2.1. Частота воспроизведения УРПИ после однократной стимуляции крыс (напряжение 10 В, продолжительность 2 секунды) в контрольной группе и при приеме рецептуры № 2 «Активит Антиоксидант» в одной дозе на протяжении 28 суток.


       


       

      Контроль Активит Антиоксидант

       


       

      Рисунок 1.2.2. Частота восстановления УРПИ после однократной стимуляции крыс (напряжение 10 В, продолжительность 2 секунды) в контрольной группе и при приеме рецептуры № 2 «Активит Антиоксидант» в одной дозе на протяжении 28 суток.

      23

      Результаты экспериментов, представленные на рисунке 1.2.1, дают основание заключить, что применение рецептур БАД «Активит Антиоксидант» позволяет активировать когнитивные процессы и в большей степени закрепить сформированный оборонительный рефлекс. Через 4 и 10 суток после электроболевого воздействия память о нем в большей степени сохраняется у крыс, получавших БАД. В последующем периоде наблюдения достоверных различий между экспериментальными группами и контролем не отмечено. Установлено, что отмена применения БАД не влияет на скорость угасания УРПИ у крыс.

      Анализируя лабильность памяти (рисунок 1.2.2) по показателю забывания или восстановления рефлекса пассивного избегания у крыс можно сделать вывод о том, что применение «Активит Антиоксидант» незначительно замедляет забывание болевого раздражения и в большей степени восстанавливает память о нем при длительном приеме.

      Таким образом, исследованные БАД оказывают позитивное влияние на когнитивные процессы, а их применение способствует лучшему запоминанию информации, что может быть использовано при операторской деятельности и при необходимости обработки большого количества информации.


       

    3. Влияние БАД на детоксикацию липофильных ксенобиотиков

      Тест, характеризующий степень влияния БАД на метаболизм липофильных ксенобиотиков в печени обычно используют при оценке переносимости БАД, определяя степень угнетения метаболических процессов. Вместе с тем, в данном случае результаты экспериментов могут быть приведены как показатель эффективности БАД, способствующих интенсификации процессов печеночной детоксикации.

      Крысам контрольной и опытных групп, получавшим на протяжении 28 суток БАД

      «Активит Антиоксидант» (рецептура № 2) в одной и двух дозах, внутрибрюшинно вводили барбитурат барбамил, претерпевающий печеночный метаболизм, обеспечивающий его детоксикацию и нивелирование терапевтического снотворного действия. Барбитурат вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг, достаточной для достижения снотворного эффекта у 100 % интактных животных. Регистрировали количество заснувших животных в каждой экспериментальной группе. Время наступления сна отмечали в момент принятия животным бокового положения, а временем окончания сна считали момент возвращения крысы в ортостатическое положение. Результаты экспериментов приведены в таблице 1.3.1.

      Результаты, представленные в таблице 1.3.1 свидетельствуют о чрезвычайно высокой вариабельности показателей у крыс контрольной и опытной групп. Вместе с тем, при введении крысам исследуемой рецептуры БАД на протяжении 28 суток при отсутствии значимых изменений в продолжительности барбитуратного сна отмечали

      отсрочку развития каталепсии, приблизительно в два раза превышающую контрольные показатели. Этот эффект не был дозозависимым и не отмечался при приеме БАД в удвоенной дозе. Это свидетельствует, с одной стороны, об адекватной переносимости БАД, а с другой стороны, не исключает их позитивного влияния на процессы печеночной детоксикации липофильных ксенобиотиков, в том числе и алкоголя.

      Таблица 1 . 3 . 1

      Влияние комплексных антиоксидантных БАД при четырехнедельном введении на продолжительность барбамилового сна у крыс (X+mx, n=6)


       

      Группа эксперимента

      Количество заснувших крыс, голов

      Контролируемый показатель, мин

      Время засыпания

      Время пробуждения

      Продолжительнос ть сна

      Крысы, получавшие дистиллированну ю воду (контроль)

      6

      4,73+0,28

      120,54+11,41

      115,82+11,42

      Крысы, получавшие БАД, рецептура № 2,

      1 доза

      6

      10,04+3,39*

      110,34+8,91

      100,3+9,50

      Крысы, получавшие БАД, рецептура № 2,

      2 дозы

      6

      5,94+0,51

      116,35+4,49

      110,41+4,26

      * - различие с контролем достоверно


       

      Результаты этих экспериментов позволяют рекомендовать БАД при приеме токсичных веществ и лекарств, метаболизируемых в печени, с предупреждением о необходимости корректировки их дозы. Не исключено, что предлагаемые БАД могут оказывать мягкое гепатопротективное действие и применяться для восстановления функций органа после операций, травм и воспалительных заболеваний.


       

    4. Влияние БАД на устойчивость крыс к воздействию гиперкапнической гипоксии

      Традиционно эффективность БАД, обладающих адаптогенными и цитопротективными свойствами, оценивается при гипоксических нагрузках в силу универсальности данного состояния при различных экстремальных воздействиях и патологических состояниях.

      Установлено, что достаточной антигипоксической активностью обладают вещества из группы гутимина, основной эффект которых сопряжен с оптимизацией

      расходования кислорода посредством редукции его потребления альтернативными по отношению к митохондриальной дыхательной цепи процессами. К числу таких процессов, ингибируемых препаратами данной группы, относится гидроксилирование ксенобиотиков в печени при участии цитохрома Р-450 и монооксигеназ смешанных функций. Ранее был показан антигипоксический эффект ингибиторов синтетазы оксида азота. Рассматриваемые БАД содержат тиольные группы, способные связать оксид азота и образовавшиеся свободные радикалы, однако они не препятствуют их образованию. В то же время, было показано позитивное влияние БАД на кислородзависимый процесс детоксикации ксенобиотиков.

      Гипоксию моделировали эксикаторе с водяным замком, позволяющим обеспечивать нормобарическую гипоксию при постоянном увеличении количества углекислого газа за счет поступления выдыхаемого животными воздуха. Крыс помещали в камеру попарно (по одной из каждой экспериментальной группы) и наблюдали до развития смертельного исхода, регистрируя частоту и скорость развития судорожного синдрома, а также продолжительность жизни животных. Результаты экспериментов приведены в таблице 1.4.1.

      Таблица 1 . 4 . 1

      Влияние комплексных антиоксидантной БАД при четырехнедельном введении на устойчивость крыс при гиперкапнической гипоксии (X+mx, n=6)

      Группа эксперимента

      Контролируемый показатель, мин

      Начало судорог

      Время гибели

      Крысы, получавшие дистиллированную воду (контроль)

      26,0+1,4

      28,8+0,9

      Крысы, получавшие БАД, рецептура № 2, в одной дозе

      42,2+2,3*

      44,3+2,0*

      * - различие с контролем достоверно

      Результаты теста свидетельствуют о том, что применение «Активит Антиоксидант» способствует значимому повышению устойчивости животных при воздействии неблагоприятных факторов, моделирующих условия закрытых помещений, задымленной среды и подземного транспорта. Результаты этих наблюдений могут позволить позиционировать БАД как средство для приема городскими жителями для профилактики экологозависимых патологических состояний.


       

    5. Влияние БАД на степень ишемических повреждений головного мозга при стенозе двух сонных артерий

      Известно, что наибольшую угрозу среди болезней цивилизации составляют сердечно-сосудистые заболевания, доля которых в общей структуре болезней постоянно возрастает. Совершенно очевидно, что БАД не должны рассматриваться как средства основной терапии сосудистых катастроф, таких как инфаркт миокарда и

      инсульт головного мозга. Их применение должно снижать риск развития подобных состояний, способствовать ограничению объемов и выраженности повреждений, обеспечивать более быстрое восстановление функций. Исследование эффективности БАД было проведено также на моделях ишемии головного мозга. В этой связи проводили оценку профилактической эффективности созданной БАД на модели ишемического инсульта по показателям развития оксидативного стресса с регистрацией как его выраженности, так и исходов в виде накопления продуктов пероксидации, что позволяет всесторонне охарактеризовать эффекты антиоксидантных БАД.

      Из четырех сосудов, принимающих участие в кровоснабжении головного мозга крысы, были одномоментно перевязаны 2 сонные артерии. Операцию выполняли под кетаминовым наркозом. Наблюдение за наркотизированными животными осуществляли в течение 2,5 ч после стенозирования, после чего крыс декапитировали и извлекали головной мозг для биохимического исследования. Активность каталазы эритроцитов оценивали по скорости распада перекиси водорода, введенной в среду в известном количестве. Антирадикальную емкость плазмы крови и гомогенатов головного мозга оценивали по восстановлению свободного радикала, дифенилпикрилгидразила, причем более низкие показатели оптической плотности этого окрашенного продукта свидетельствовали о восстановлении радикала и характеризовали эффект антиоксидантных препаратов. Диеновые конъюгаты гидроперекисей жирных кислот экстрагировали из крови и гомогенатов головного мозга изопропанолом и гептанолом для раздельного определения в фосфолипидной фракции мембран. Известно, что продукты пероксидации способны поглощать проходящий свет с =232 нм, тогда как неокисленные двойные связи поглощают при длине волны =220 нм. Отношение показателей экстинции свидетельствовало о доли продуктов пероксидации в общей липидной фракции. Определение показателей оптической плотности производили на спектрофотометре СФ-26. Результаты спектрофотометрии проб крови приведены в таблице 1.5.1.


       

      Таблица 1 . 5 . 1

      Показатели перекисного окисления липидов в крови крыс после двусторонней перевязки сонных артерий на фоне четырехнедельного применения

      «Активит Антиоксидант»


       

      Показатель

      Группа

      Интактные (без перевязки)

      Дистиллированная вода

      (контроль)

      БАД, рецептура

      № 2, 1 доза

      Активность каталазы

      0,250+0,009

      0,242+0,021

      0,219+0,025*

      Восстановление дифенилпикрилгидразила

      0,573+0,023

      0,556+0,028

      0,474+0,026*


       

      Диеновые конъюгаты – изопропанольная фракция

      0,201+0,031

      0,238+0,029

      0,166+0,035

      Диеновые конъюгаты – гептанольная фракция

      0,842+0,031

      0,851+0,057

      0,735+0,027*

      Примечание: * - различие с позитивным контролем достоверно


       

      При исследовании крови животных выявлены наиболее существенные различия между показателями контрольных групп и группы с применением БАД. Доказано, что активность каталазы в крови у животных, принимавших «Активит Антиоксидант» остается на низком уровне, что отражает отсутствие субстрата для данного фермента, появляющегося в ходе реакций оксидативного стресса. Не исключено, что даже в случае появления перекиси водорода в крови она будет инактивирована неферментативным звеном антиоксидантной системы, о чем свидетельствует высокий уровень инактивации дифенилпикрилгидразина у крыс, в течение четырех недель употреблявших в пищу антиоксидантные препараты. Диеновые конъюгаты гидроперекисей жирных кислот выявляли в крови подопытных крыс в гораздо меньшем количестве, по сравнению с контрольными группами.

      Все прослеженные изменения позволяют предполагать, что применение антиоксидантных БАД способствует инактивации свободных радикалов и снижает повреждающие эффекты последних при развитии сосудистой патологии.

      Кроме характеристик содержания продуктов перекисного окисления липидов в крови проводили изучение процессов перекисного окисления непосредственно в очаге повреждения. Результаты спектрофотометрии проб гомогенатов головного мозга приведены в таблице 1.5.2.


       

      Таблица 1 . 5 . 2

      Показатели перекисного окисления липидов в головном мозге крыс после двусторонней перевязки сонных артерий на фоне четырехнедельного применения

      «Активит-эколоджи»


       

      Показатель

      Группа

      Интактные (без перевязки)

      Дистиллированная вода

      (контроль)

      БАД, рецептура

      № 2, 1 доза

      Восстановление дифенилпикрилгидразила

      0,095+0,022

      0,103+0,035

      0,048+0,010*

      Диеновые конъюгаты – изопропанольная фракция

      0,179+0,035

      0,168+0,021

      0,145+0,008*

      Диеновые конъюгаты – гептанольная фракция

      0,555+0,030

      0,546+0,009

      0,552+0,005

      Примечание: * - различие с позитивным контролем достоверно

      Результаты, приведенные в таблице 1.5.2 дают основание считать, что применение БАД снижает содержание диеновых конъюгатов в экстрагируемой изопропанолом фосфолипидной мембранной фракции, чем обеспечивает защитный эффект на уровне клеток и тканей. Применение БАД способствует существенной активации неферментативного звена антиоксидантной защиты.

      Таким образом, применение исследованных БАД в течение четырех недель позволяет достичь адекватного цитопротективного эффекта, сопряженного с ограничение пероксидации липидов и существенной активацией неферментативного звена антиоксидантной системы.

      В целом, исследованные рецептуры БАД (особенно рецептура № 1) по результатам комплексных тестов проявили достаточную активность и могут быть рекомендованы для широкого применения в качестве нутрицевтиков с парафармацевтическими свойствами, обладающие значимым цитопротективным эффектом.

  2. Предварительное изучение безопасности рецептур БАД «Активит Антиоксидант»


     

    Острую токсичность БАД определяли табличным методом В.Б. Прозоровского на мышах посредством перорального введения добавки в виде водной эмульсии через зонд. Установлено, что при введении БАД мышам в дозе 2,0 г/кг из расчета 0,2 мл суспензии на 10 г массы тела гибели животных в течение 3-х суток не отмечено. БАД признаны низкотоксичными, вследствие чего ЛД50 не уточнялась.

    Для оценки подострой токсичности БАД вводили крысам внутрижелудочно через зонд в дозе, эквивалентной приему человеком 60 кг капсулы с 390 мг рецептуры, в виде водной эмульсии один раз в день ежедневно на протяжении 28 суток.


     

    1. Влияние БАД на прирост массы тела крыс

      Оценка динамики массы тела крыс представляет собой объективный показатель, часто используемый для интегральной характеристики общетоксического действия БАД. Крыс взвешивали еженедельно в течение всего периода введения БАД в виде масляных суспензий. Взвешивание осуществляли утром до кормления. Динамика массы тела крыс при приеме БАД в одиночной и удвоенной дозе, а также в контрольной группе отражена в таблице 2.1.1.

      Несмотря на отсутствие достоверных различий в динамике прироста массы тела между крысами контрольной и подопытных групп, более выраженная потеря массы тела крысами, получавшими БАД в удвоенной дозе, послужила основанием для анализа причин подобного эффекта. Было предположено, что токсические эффекты могли быть связаны с высокой дозой селена, тогда как остальные компоненты рецептуры в выбранных дозах не проявляют значимой токсичности, что доказано ранее проведенными многочисленными многоцентровыми исследованиями.

      Отсутствие потери массы тела в группе, получавшей БАД в одной дозе, позволило обосновать снижение дозы селена до 0,03 мг и испытать рецептуру в соответствие с прописью № 1.

      Таблица 2 . 1 . 1 .

      Изменение массы тела крыс при введении БАД с антиоксидантами


       

      Эксперимент альная группа

      Показатель

      Продолжительность приема БАД, сутки

      Исходные показатели

      7

      14

      21

      28

      Дистиллиров анная вода (контроль 1)

      Масса

      219+5

      243+5

      243+4

      248+5

      250+5

      Прибавка за неделю

      -

      24+2

      0+1

      5+2

      2+3

      «АктивитАнт иоксидант», рецептура

      № 2, 1 доза

      Масса

      224+5

      239+5

      242+6

      248+5

      254+5

      Прибавка за неделю

      -

      15+3

      3+2

      6+3

      6+2

      «АктивитАнт иоксидант», рецептура

      № 2, 2 дозы

      Масса

      233+6

      243+6

      231+10

      241+9

      251+8

      Прибавка за неделю

      -

      10+0

      -13+6

      10+3

      10+3

      «АктивитАнт иоксидант», рецептура

      № 1, 1 доза

      Масса

      227+4

      232+4

      238+4

      243+5

      249+4

      Прибавка за неделю

      -

      5+1

      7+3

      4+3

      7+2

      Отсутствие токсических эффектов при приеме БАД в одной дозе при доказанной эффективности композиции позволяет предположить возможность приема БАД (рецептура № 1) два раза в день в течение короткого промежутка времени для быстрого достижения требуемого адаптационного эффекта.


       

    2. Влияние БАД на поведение крыс и их условно- рефлекторную деятельность

      Проявление токсического действия лекарственных средств и БАД может сопровождаться нарушениями регуляции движений и процессов сенсомоторной координации, вызывать ощущения дискомфорта и настороженности, что отражается на поведении животных. Эти обстоятельства определяют целесообразность проведения исследований, позволяющих выявить особенности ориентировочно- исследовательской деятельности и оценить уровень эмоциональной реактивности животных, получавших исследуемую БАД в различных вариантах компановки в одной и двух дозах.

      С этой целью традиционно применяют тест "черно-белая камера". Этот тест используют, прежде всего, в силу его простоты и адекватности, высокой чувствительности и возможности выявления эффектов воздействия на ЦНС различных химических соединений в пороговых дозах и концентрациях. Тест "черно- белая камера" основан на противодействии ориентировочно-исследовательской

      реакции и чувства страха, в данном случае перед освещенным открытым пространством светлого отсека камеры. Черно-белая камера представляет собой закрытый ящик из оргстекла с центральной перегородкой посередине, состоящий из двух равных отсеков размерами 25 х 25 х 25 см. Отсеки сообщаются между собой через отверстие в перегородке (5х10 см). Сверху оба отсека снабжены открывающимися наверх крышками. Один из отсеков (а также перегородка и ее дверца, пол и крышка), изнутри поверх оргстекла полностью обклеен черной светонепроницаемой бумагой ("темный отсек"). Стенки "светлого отсека" остаются прозрачными, сверху по центру на высоте 15 см над его прозрачной крышкой располагают электрическую лампу мощностью 40 Вт.

      Для оценки изменений поведения крыс при введении БАД животных опытной и контрольной групп поодиночке помещали в светлый отсек, в течение 5 минут регистрировали количество стоек в светлом отсеке (вертикальная ориентировочная активность), время латентного периода первого перехода из светлого отсека в темный, и количество переходов из отсека в отсек (норковое поведение, горизонтальная ориентировочная активность). По окончании наблюдения подсчитывали количество животных, которые не входят в темный отсек, и рассматривали их как крыс с нарушенным норковым рефлексом.

      Результаты оценки поведения крыс при приеме «Активит Антиоксидант» приведены в таблице 2.2.1.

      Результаты исследований позволяют сделать заключение о том, что применение БАД, составленной по прописи № 2 в удвоенной дозе приводит к срыву норкового рефлекса у крыс, что свидетельствует о передозировке селен-содержащих продуктов в композиции. Отсутствие токсических эффектов у крыс, употреблявших БАД, составленной по прописи № 2 и № 1, в одной дозе свидетельствуют о том, что срыв показателей высшей нервной деятельности у животных действительно связан с передозировкой селенита натрия, который в отличие от ранее заявленных рецептур, содержащих аскорбиновую кислоту и дрожжевую основу, представлен в «Активит Антиоксидант» в иной комбинации компонентов.

      Таким образом, на основании результатов проведенных экспериментов обоснована безвредность БАД в виде композиции, составленной по прописи № 1. Учитывая данные группы, получавшей БАД в виде композиции по прописи № 2 в одной дозе, можно допустить прием «Активит Антиоксидант» (рецептура № 1) два раза в день.

      Влияние БАД на поведение крыс в тесте «черно-белая камера»


       

      Экспериментальн ая группа

      Время регистрации (продолжительность приема БАД)

      Показатель

      Латентный период первого перехода, сек

      Количество переходов

      Количество стоек

      Дистиллированна я вода (контроль)

      Исходное состояние

      12,00+2,74

      2,67+0,67

      0,33+0,21

      2 недели

      4,83+0,83

      2,67+0,49

      0,33+0,21

      4 недели

      3,67+0,49

      1,33+0,21

      0,17+0,17

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2,

      1 доза

      Исходное состояние

      10,17+4,38

      3,5+0,62

      0,83+0,54

      2 недели

      5,17+1,90

      1,83+0,31

      0,00+0,00

      4 недели

      11,33+4,33

      1,50+0,34

      0,67+0,33

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2,

      2 дозы

      Исходное состояние

      9,00+2,07

      3,17+0,79

      1,17+0,75

      2 недели

      5,00+0,86

      1,33+0,21

      0,00+0,00

      4 недели

      31,17+18,40*

      1,00+0,00

      0,17+0,17

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 1,

      1 доза

      Исходное состояние

      13,50+3,77

      3,50+0,76

      0,83+0,54

      2 недели

      8,50+1,95

      1,33+0,21

      0,33+0,21

      4 недели

      5,00+0,97

      1,17+0,17

      0,33+0,33

      Примечание: * - различие с контролем достоверны


       

    3. Влияние БАД на гематологические показатели у крыс

      Влияние рецептур БАД «Активит Антиоксидант»в одной и двух дозах на кровь оценивали стандартными методами. Количество гемоглобина определяли с помощью гемометра Сали. Подсчет лейкоцитарной формулы проводили на мазках крови из хвостовой вены крысы, окрашенных азур-эозином по Романовскому-Гимзе.

      Показатели свойств и состава периферической крови при применении БАД, а также при применении растворителя – дистиллированной воды в эквивалентной дозе представлены в таблицах 2.3.1, 2.3.2 и 2.3.3.

      Согласно данным, представленным в таблице 2.3.1., при применении БАД

      «Активит Антиоксидант» (рецептура № 2) в одной дозе достоверных изменений гематологических показателей у подопытных крыс не выявлено.

      Гематологические показатели у крыс, получавших в течение 4-х недель дистиллированную воду (контроль) (X+mx, n=6)


       

      Показатель

      Продолжительность применения, сутки

      Исходное состояние

      14

      28

      Гемоглобин, г/л

      136,7+3,6

      136,3+1,58

      141,3+3,08

      Время свертывания (фибриновые нити), сек


       

      21,5+5,41


       

      17,7+2,16


       

      19,0+2,29

      Время свертывания (сформированный сгусток), сек


       

      250,0+12,58


       

      214,2+8,00


       

      200,0+5,32

      Количество эритроцитов, x1012

      5,1+0,35

      4,6+0,19

      4,5+0,13

      Количество лейкоцитов, x109

      19,6+2,11

      14,7+1,80

      15,5+1,97

      Палочкоядерные нейтрофильные гранулоциты, %


       

      0,8+0,17


       

      0,7+0,21


       

      1,0+0,00

      Сегментоядерные нейтрофильные гранулоциты, %


       

      46,8+1,30


       

      46,8+1,40


       

      44,8+1,89

      Базофильные гранулоциты, %

      0,3+0,21

      0,3+0,21

      0,5+0,22

      Эозинофильные гранулоциты, %

      1,8+0,40

      2,5+0,43

      2,7+0,33

      Моноциты, %

      2,5+0,50

      2,5+0,50

      2,8+0,48

      Лимфоциты, %

      47,7+1,23

      47,2+1,05

      48,5+1,54


       

      Таблица 2 . 3 . 2

      Гематологические показатели у крыс, получавших в течение 4-х недель БАД

      «Активит Антиоксидант» (рецептура № 2) в одной эквивалентной дозе (X+mx, n=6)


       

      Показатель

      Продолжительность применения БАД, сутки

      Исходное состояние

      14

      28

      Гемоглобин, г/л

      140,3+2,89

      138,0+1,71

      141,7+1,74

      Время свертывания (фибриновые нити), сек


       

      21,0+1,97


       

      19,0+2,67


       

      22,5+1,18

      Время свертывания (сформированный сгусток), сек


       

      241,7+13,70


       

      232,5+11,67


       

      183,3+11,67

      Количество эритроцитов, x1012


       

      5,7+0,16


       

      5,0+0,12


       

      5,4+0,12

      Количество лейкоцитов, x109

      20,6+2,78

      17,2+1,75

      18,5+2,37

      Палочкоядерные нейтрофильные гранулоциты, %


       

      0,2+0,17


       

      0,7+0,21


       

      0,3+0,21

      Сегментоядерные нейтрофильные гранулоциты, %


       

      45,8+1,99


       

      46,2+1,58


       

      43,2+1,78

      Базофильные гранулоциты, %

      0,7+0,21

      0,5+0,22

      0,2+0,17

      Эозинофильные гранулоциты, %

      2,3+0,42

      2,8+0,48

      1,5+0,43

      Моноциты, %

      4,3+0,42

      3,8+0,40

      3,2+0,31

      Лимфоциты, %

      46,5+1,69

      46,0+1,69

      51,7+1,69

      Таблица 2 . 3 . 3

      Гематологические показатели у крыс, получавших в течение 4-х недель БАД

      «Активит Антиоксидант» (рецептура № 2) в удвоенной дозе (X+mx, n=6)


       

      Показатель

      Продолжительность применения БАД, сутки

      Исходное состояние

      14

      28

      Гемоглобин, г/л

      140,3+1,96

      138,5+2,45

      139,7+3,2

      Время свертывания (фибриновые нити), сек


       

      20,0+3,44


       

      19,5+2,38


       

      18,7+2,20

      Время свертывания (сформированный сгусток), сек


       

      239,2+14,17


       

      187,5+3,82


       

      180,0+9,66

      Количество эритроцитов, х1012


       

      4,9+0,28


       

      4,7+0,17


       

      5,2+0,14

      Количество лейкоцитов, х109

      15,4+1,65

      15,4+1,35

      19,4+2,11

      Палочкоядерные нейтрофильные гранулоциты,

      %


       

      1,2+0,31


       

      0,8+0,17


       

      0,3+0,21

      Сегментоядерные нейтрофильные гранулоциты,

      %


       

      46,2+2,23


       

      46,7+1,67


       

      46,0+1,48

      Базофильные гранулоциты, %

      0,7+0,21

      0,3+0,21

      0,3+0,21

      Эозинофильные гранулоциты,

      %


       

      1,8+0,48


       

      1,5+0,22


       

      1,5+0,22

      Моноциты, %

      4,5+0,56

      4,2+0,60

      4,5+0,56

      Лимфоциты, %

      45,5+1,43

      46,7+1,86

      47,3+1,63


       

      При применении БАД в удвоенной дозе также не отмечали никаких отклонений в показателях клеточного состава и физико-химических свойств крови от данных контрольной группы.

      В целом результаты экспериментов свидетельствуют об отсутствии токсического влияния исследованной БАД на гемопоэз и свойства крови.


       

    4. Влияние БАД на выделительную функцию почек

      Влияние БАД на процессы формирования мочи и мочевыделения оценивали стандартными методами. Животных на сутки высаживали в специальные собирательные клетки с дозированным количеством воды (10-15 мл) и пищи. Устройство клетки позволяло собирать суточную мочу в охлаждаемую тару. Измеряли количество мочи, ее плотность, кислотность, наличие уробилиногена, билирубина, кетонов, глюкозы и белка. Пробы мочи центрифугировали и проводили микроскопию осадка, подсчитывая количество цилиндров и кристаллов солей.

      Изменяемые показатели свойств мочи сведены в таблице 2.4.1.

      Таблица 2 . 4 . 1

      Влияние БАД при четырехнедельном приеме на свойства суточной мочи


       

      Экспериментальная группа

      Время регистрации

      Показатель

      Общее количество, мл

      Плотность, ед

      Кислотность, ед

      Дистиллированная вода (контроль)

      Исходное состояние

      4,00+0,59

      1,018+0,004

      5,00+0,00

      2 недели

      5,97+1,28

      1,017+0,003

      5,00+0,00

      4 недели

      5,60+0,62

      1,013+0,004

      6,17+0,17

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2, 1 доза

      Исходное состояние

      7,05+1,52

      1,014+0,003

      5,67+0,21

      2 недели

      5,28+0,76

      1,018+0,002

      5,20+0,20

      4 недели

      4,05+0,89

      1,013+0,001

      5,00+0,00

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2, 2 дозы

      Исходное состояние

      4,23+1,23

      1,017+0,003

      5,67+0,21

      2 недели

      2,78+1,12

      1,015+0,004

      5,00+0,00

      4 недели

      2,37+0,64

      1,016+0,002

      5,50+0,34

      Установлено, что в моче отдельных крыс в минимально определяемых количествах присутствовали следы белка и уробилиногена. Эти явления отмечали с одинаковой частотой, как в контрольной группе, так и в группах крыс, получавших БАД, в разные сроки наблюдения. Учитывая возможность таких изменений у половозрелых крыс-самцов в норме, они не расценивались как патологические и в дальнейшем анализе не учитывались. При микроскопии осадка мочи патологических изменений не выявлено.

      Концентрационная функция почек остается без изменений, плотность мочи, равно как и ее количество, при одинаковом водопотреблении значимо не снижается.

      Таким образом, данных о токсическом действии БАД на процессы мочеобразования и нарушениях мочевыделительной системы при их применении не получено.

    5. Влияние БАД на биохимические показатели у крыс

      Интегральная оценка влияния БАД на системы детаксикации была проведена в ходе исследования продолжительности барбамилового сна. Результаты этих экспериментов изложены в таблице 1.3.1 и свидетельствуют об отсутствии токсических эффектов у композиций «Активит-эколоджи». Метаболические процессы в организме изучены в ходе биохимического исследования крови. Определение биохимических параметров выполняли после окончания эксперимента у интактных крыс, а также у животных, получавших в течение 28 суток дистиллированную воду и водные эмульсии рецептур БАД. Кровь отбирали после декапитации животных. Плазму отделяли при центрифугировании и замораживали при температуре t= -18 оС. Объем проб был достаточным, для выполнения исследования на аппарате Техникон без объединения образцов. Биохимический анализ выполняли в биохимической лаборатории больницы № 28 Санкт-Петербурга.

      Результаты биохимических исследований обобщены в таблице 2.5.1.

      Показано, что по используемым контролируемым параметрам исследованные рецептуры БАД не обладают токсическим действием на метаболизм. Различия между группами недостоверны.

      Таблица 2 . 5 . 1

      Биохимические показатели плазмы крови крыс при четырехнедельном применении БАД с антиоксидантными свойствами (Х+m, n=6)


       

      Показатель

      Единица измерени я

      Вариант введения БАД

      Дистиллированная вода (контроль)

      «Активит- эколоджи», рецептура № 2,

      1 доза

      «Активит- эколоджи», рецептура № 2,

      2 дозы

      АлАТ

      мМ/л

      117,0+3,78

      124,33+5,48

      127,5+6,84

      АсАТ

      мМ/л

      280,3+5,90

      269,5+5,63

      263,67+6,58

      Билирубин общий

      мкМ/л

      17,67+1,15

      14,88+1,76

      13,47+1,58

      Мочевина

      мМ/л

      6,07+0,66

      5,93+0,66

      6,27+0,56

      Креатинин

      мкМ/л

      65,67+7,77

      67+6,31

      54,3+4,11

      Глюкоза

      мМ/л

      5,7+0,39

      6,17+0,31

      6,32+0,32

      Холестерин

      мМ/л

      4,35+0,54

      4,52+0,33

      4,33+0,28

      Общий белок

      г/л

      75,17+2,47

      75,0+3,75

      80,17+2,72

      Фибриноген

      г/л

      3,24+0,34

      4,75+0,69

      4,72+0,71

      Протромбиновы й индекс

      %

      99,5+2,27

      99,0+3,85

      96,83+4,24

      Натрий

      ммоль/л

      150,17+7,45

      148,33+6,46

      153,0+5,56

      Калий

      ммоль/л

      7,77+0,17

      7,2+0,19

      7,17+0,22

    6. Влияние БАД на сердечно-сосудистую систему

      Влияние «Активит Антиоксидант»на функции сердечно-сосудистой системы оценивали посредством измерения артериального давления непрямым методом в артериях хвоста крысы, а также при ЭКГ-исследовании крыс под тиопенталовым наркозом. Регистрацию систолического артериального давления и ЭКГ-показателей выполняли с помощью полиграфа RM-400.

      Систолическое артериальное давление у крыс было чрезвычайно вариабельным и колебалось в пределах 110-150 мм рт. ст. Достоверных различий между крысами контрольной группы и животными, получавшими БАД (рецептура № 2) в одной и двух дозах, не получено.

      Электрокардиографические показатели сведены в таблице 2.6.1.


       

      Таблица 2 . 6 . 1

      Влияние БАД на электрическую активность сердца крыс при четырехнедельном применении (Х+m, n=6)


       

      Показатель

      Вариант введения БАД

      Дистиллированная вода (контроль)

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2,

      1 доза

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2,

      2 дозы

      ЧСС, уд/мин

      408,4+15,2

      398,5+23,0

      401,2+18,9

      R-R, сек

      0,15+0,01

      0,15+0,01

      0,15+0,01

      Амплитуда зубца Р, мВ

      0,19+0,01

      0,20+0,02

      0,19+0,02

      Амплитуда зубца Q, мВ

      0,15+0,02

      0,16+0,02

      0,14+0,02

      Амплитуда зубца R, мВ

      1,33+0,14

      1,32+0,12

      1,30+0,15

      Амплитуда зубца S, мВ

      0,83+0,12

      0,75+0,13

      0,82+0,13

      Амплитуда зубца T, мВ

      0,39+0,03

      0,31+0,03

      0,35+0,04


       

      Результаты наблюдений, представленные в таблице, дают основание заключить, что исследуемые композиции БАД значимо не влияют на автоматизм и проведение импульса в сердечной мышце (рисунки 2.6.1-2.6.3).

      Таким образом, исследованная БАД «Активит Антиоксидант» не оказывает токсического действия на сердечно сосудистую систему и по этому показателю также может быть признана безвредной.


       

      image


       

      Рис. 2.6.1. Вариант нормальной ЭКГ крысы при четырехнедельном введении дистиллированной воды

      image

      Рис. 2.6.2. Вариант нормальной ЭКГ крысы при четырехнедельном введении «Активит Антиоксидант» (рецептура № 2) в одной дозе

      image

      Рис. 2.6.2. Вариант нормальной ЭКГ крысы при четырехнедельном введении «Активит Антиоксидант» (рецептура № 2) в удвоенной дозе

    7. Влияние БАД на структуру внутренних органов

      По окончании эксперимента крыс групп контроля и животных, получавших БАД

      «Активит Антиоксидант» в одной и двух дозах, декапитировали. Состояние внутренних органов оценено визуально при аутопсии, измерена масса органов и рассчитаны удельные значения этого показателя, а также после высушивания в муфельном шкафу определена степень влагонасыщения тканей перенхиматозных органов. Учитывая, что выраженных патологических изменений у крыс как контрольной, так и подопытных групп не отмечено, выполняли гистологическое исследование случайным образом отобранных образцов тканей крыс по три из каждой группы, а также места введения БАД (гастродуоденальная зона) у всех крыс.

      Образцы тканей фиксировали нейтральным формалином, проводили через спирты возрастающей крепости и заливали в парафин. Готовили парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином-эозином и исследовали при увеличении стандартного светового микроскопа.

      При определении относительной массы органов (таблица 2.7.1) убедительных данных о наличии отека тканей, нарушении кровоснабжения или кровоизлияний не получено. Достоверных различий между группами по гравиметрическим коэффициентам не выявлено.


       

      Таблица 2 . 7 . 1

      Удельная масса внутренних органов при четырехнедельном введении БАД с антиоксидантами


       

      Орган

      Группа

      Дистиллированная вода (контроль)

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2, 1 доза

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2, 1 доза

      Мозг

      0,80+0,04

      0,71+0,02

      0,73+0,02

      Печень

      4,17+0,20

      3,73+0,38

      3,95+0,32

      Легкие

      0,68+0,02

      0,62+0,03

      0,79+0,08

      Почка

      0,31+0,01

      0,26+0,02

      0,33+0,01

      Сердце

      0,33+0,01

      0,35+0,02

      0,37+0,01

      Селезенка

      0,37+0,03

      0,33+0,02

      0,36+0,04

      Тимус

      0,059+0,004

      0,052+0,005

      0,043+0,005

      Надпочечни

      0,0077+0,0004

      0,0072+0,0003

      0,0083+0,0010

      к

           

      Семенник

      0,53+0,05

      0,52+0,03

      0,59+0,03


       

      После высушивания паренхиматозных органов определяли степень влагонасыщения, характеризующую развитие отека тканей при формировании воспалительного процесса. Результаты исследований приведены в таблице 2.7.2.

      Таблица 2 . 7 . 2

      Степень влагонасыщения внутренних органов при четырехнедельном введении БАД с антиоксидантами


       

      Орган

      Группа эксперимента

      Дистиллированная вода (контроль)

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2, 1 доза

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2, 1 доза

      Сердце

      77,5+0,3

      78,6+1,2

      77,6+1,8

      Печень

      75,5+1,1

      73,6+1,2

      73,0+1,2

      Почки

      74,9+0,4

      74,7+1,2

      69,2+6,8

      Мозг

      78,7+0,2

      79,4+0,9

      78,2+0,2

      Легкие

      78,9+0,2

      76,6+1,4

      76,9+0,6

      Селезенка

      77,3+1,2

      77,4+0,9

      75,3+0,7


       

      Различий в степени влагонасыщения органов у животных экспериментальных групп не выявлено.

      При гистологическом исследовании образцов тканей внутренних органов крыс контрольных и опытных групп отклонений от нормы не обнаружено. Варианты строения тканей представлены на рисунках 2.8.1 и 2.8.2.

      Таким образом, по данным гравиметрических тестов и результатам гистологических исследований токсических эффектов БАД не выявлено.


       

    8. Местно-раздражающее действие БАД

      При оценке подострой токсичности БАД «Активит Антиоксидант» рецептуры вводили в виде водной эмульсии внутрижелудочно через зонд. Результаты исследований распадаемости капсул указывают на то, что их содержимое будет высвобождаться уже через 3-10 минуты после приема, то есть также поступать в желудок.

      При макроскопическом исследовании во время аутопсии крыс, получавших БАД в одной и двух дозах, данных о наличии изъязвлений, патологических очаговых или тотальных гиперемий слизистой желудка не получено.


       

      image


       

      Рис. 2.8.1. Варианты нормального строения коры головного мозга (а), печени (б), легких (в), и миокарда (г) у крыс после четырехнедельного применения «Активит Антиоксидант» (рецептура № 2) в удвоенной дозе. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 40х3х1,25


       

      image


       

      Рис. 2.8.2 Почка крысы, получавшей БАД «Активит Антиоксидант» (рецептура № 1) в одиночной дозе. Патологических изменений в органе не выявлено


       

      При гистологическом исследовании образцов тканей желудка и двенадцатиперстной кишки, окрашенных гематоксилин-эозином патологических изменений также не выявлено (рисунок 2.8.3).


       


       

      image


       

      Рис 2.8.3. Неизмененная слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки крысы, получавшей

      «Активит Антиоксидант», рецептура № 2, в одной дозе на протяжении 4 недель. Окраска гематоксилин-эозином, ув. х100


       

      Результаты экспериментов могут свидетельствовать о том, что исследуемые БАД не обладают местно-раздражающим действием.

      Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют обосновать состав нового БАД, безвредного при применении в течение 28 суток, и оказывающего положительное влияние на процессы обмена веществ, повышая устойчивость к воздействиям неблагоприятных факторов:


       

      Витамин Е – ацетат - 50 мг

      Витамин А – ацетат - 1,5 мг

      Витамин С - 80 мг

      Селенит натрия (в пересчете на селен) - 0,02 мг Метионин - 100 мг

      Липоевая кислота - 80 мг

      Микрокристалическая целлюлоза - до массы содержимого капсулы 390 мг

  3. Исследование безопасности новой отобранной рецептуры БАД «АКТИВИТ АНТИОКСИДАНТ»

    1. Санитарно-химический анализ

      Подготовка проб проводилась по ГОСТ 26929–86 «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения токсичных элементов». Токсичные элементы и вещества определялись по методическим указаниям № 01- 19/47-11, ГОСТ 26930, 30171-96, 26927 и МУ 3208-85 с использованием

      газожидкостного хроматографа «Карло Эрба» (модель HRGC 5700, заводской номер 205485) и атомно-адсорбционного спектрометра «Перкин-Элмер» (модель 303, заводской номер 50463).

      Суммарная удельная радиоактивность образцов БАД измерялась на гамма- спектрометре «УСК-Гамма-плюс» (Россия).

      Результаты исследования представлены в таблицах 3.1.1 и 3.1.2.


       

      Таблица 3 . 1 . 1

      Содержание токсичных элементов и токсикантов


       

      Показатели

      Норма по СанПиН 2.3.2.1078-01, п. 1.5.2

      БАД

      «Активит Антиоксидант»

      Элементы

      Свинец, мг/кг

      1.0

      0.01

      Кадмий, мг/кг

      0.1

      0.03

      Ртуть, мг/кг

      0.01

      0.002

      Мышьяк, мг/кг

      1.0

      0.01


       

      Хлорорганические пестициды

      ГХЦГ, мг/кг, контроль по сырью

      0.005

      <0.001

      ДДТ и метаболиты, мг/кг

      0.005

      <0.001


       

      Таблица 3 . 1 . 2

      Удельная радиоактивность образцов БАД, Бк/кг


       


       

      Радионуклиды

      Норма по СанПиН 2.3.2.1078-01, п.1.5.2

      БАД

      «Активит Антиоксидант»

      90Sr

      100

      25

      137Cs

      160

      32


       

      Таким образом, по результатам проведенных измерений содержание вредных и опасных для здоровья веществ в БАД «Активит Антиоксидант» не превышает допустимых уровней.


       

    2. Исследование острой токсичности

      Для определения показателей острой токсичности содержимое капсул БАД

      «Активит Антиоксидант» в виде водных разведений вводили белым крысам обоего пола внутрижелудочно (через атравматичный металлический зонд) в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Большие дозы вводили повторно в течение 15 минут. Расчеты средней эффективной дозы и ее ошибки проводили по В.Б. Прозоровскому. Контрольным животным вводили аналогичные объемы воды (контроль объема).

      Гибель животных при внутрижелудочном введении смертельных доз БАД (более

      7 г/кг) наблюдалась в течение 1,5–5 часов от момента введения при явлениях возбуждения, последующей вялости, заторможенности, оглушения, бокового положения, резкого поверхностного дыхания, судорог в агональной стадии и паралича.

      Зависимые от дозы эффекты представлены в таблице 3.2.1.

      Вскрытие погибших при внутрижелудочном введении животных выявило, помимо признаков венозного полнокровия внутренних органов, субплевральные, субдуральные кровоизлияния, а также мелкие кровоизлияния в продолговатом мозге и больших полушариях коры. В желудке и кишечнике наблюдались признаки раздражения слизистых оболочек.

      Таблица 3 . 2 . 1

      Летальные эффекты (пало/всего) БАД при в/ж введении крысам обоего пола


       

      БАД

      Доза, мг/кг

      5000

      6000

      7000

      8000

      9000

      10000

      «Активит- эколоджи»

      0/5

      0/5

      000/5

      2/5

      3/5

      5/5


       

      ЛД50 «Активит-эколоджи» 8500  500 мг/кг


       

      Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными в периоде после острого отравления, а также данные патоморфологических исследований позволяют позиционировать БАД

      «Активит-эколоджи» как практически нетоксичное парафармацевтическое средство (V класс практически нетоксичных лекарственных веществ) (H. Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.; K.K. Сидоров, 1973).


       

      По результатам вскрытия и макроскопического исследования внутренних органов выживших экспериментальных животных каких-либо патологических изменений не обнаружено.

      Животные нормального телосложения, средней упитанности. Шерсть блестящая, опрятного вида. Очагов облысения не наблюдалось. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Передние и задние конечности изменений не представляли. Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледные, блестящие, гладкие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь. Половые органы самцов правильно выражены.

      Листки плевры и органы грудной клетки не изменены. Легкие бледно-розовые, воздушные, без уплотнений на ощупь. Размеры сердца в пределах нормы. В полостях сердца содержится небольшое количество жидкой крови. Мышца сердца плотная, коричневой окраски.

      Желудок заполнен небольшим количеством плотной пищи. Слизистая оболочка блестящая, складчатая, слегка розоватой окраски. Слизистая тонкого кишечника блестящая, гладкая, розоватой окраски.

      Размеры и форма печени не отличаются от контроля. Поверхность печени гладкая. Капсула тонкая, прозрачная. Рисунок печени на разрезе не изменен. Ткань печени умеренно полнокровна.

      Почки обычной величины и формы, коричневатого цвета, плотные, с отчетливыми корковым и мозговым веществом на разрезе. Щитовидная железа, надпочечники и поджелудочная железа по внешнему виду не отличаются от контроля.

      При осмотре гистологических препаратов желудка и паренхиматозных органов отличий в структуре между опытными и контрольными группами не обнаружено.

      Сосуды легких были умеренно полнокровны. Эпителий альвеол и внутрилегочных бронхов изменений не представлял. Альвеолы были заполнены воздухом. Отека либо воспаления легочной ткани не наблюдалось.

      Миофибриллы левого желудочка сердца и межжелудочковой перегородки имели отчетливую поперечную исчерченность, ядра кардиомиоцитов были светлыми. Сосуды миокарда умеренно полнокровные.

      Дольчатое строение печени сохранялось. Границы гепатоцитов были четкими, цитоплазма гепатоцитов –– слабобазофильной, зернистой; ядра с достаточным содержанием хроматина и тонкой ядерной мембраной. При окраске замороженных срезов печени суданом IV признаков жировой дистрофии не наблюдалось.

      Эпителий извитых канальцев почек изменений не представлял. Цитоплазма его была зернистой, оксифильной, ядра светлыми. Сосуды клубочков умеренно полнокровные.

      Строение слизистой оболочки фундальной части желудка не отличалось от контроля. Ядра эпителия слизистой и желез были светлыми. В базальных отделах желез сохранилась зернистость в цитоплазме.

      Эпителий ворсинок и крипт слизистой тонкой кишки был сохранен, в криптах присутствовали митозы.

      Таким образом, по показателю летальной токсичности (ЛД50 выше 5000 мг/кг) и данным морфологического исследования (внутренние органы не изменены) БАД «Активит Антиоксидант» можно отнести к нетоксичным (относительно безвредным по С.Д. Заугольникову) и малоопасным (IV класс опасности по ГОСТ 12.1.007) веществам.


       

    3. Хроническая токсичность и способность к кумуляции

      Исследования хронической токсичности проводились на белых нелинейных крысах обоего пола в течение 30 дней. Введение БАД осуществлялось внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд. Суточная доза составляла 1.0 г/кг, так что за 30 дней общее количество БАД составило 30 г/кг. Контрольные животные получали дистиллированную воду в тех же объемах.

      Измерение основных физиологических показателей производилось в конце исследования, через 30 дней ежедневного введения БАД.

      На протяжении всего периода наблюдения летальных эффектов не наблюдалось; общее состояние и поведение подопытных оставалось нормальным и не отличалось от контроля в течение всего эксперимента.

      Результаты исследования основных физиологических показателей подопытных и контрольных животных представлены в таблице 3.3.1. Как можно видеть БАД достоверно снижала продолжительность гексеналового сна по сравнению с контролем, что, безусловно, является одним из результатов их фармакологического действия (повышение детоксицирующей функции печени). По остальным из исследованных показателей не имелось статистически значимых (на 95% доверительном уровне) различий с контролем или патологических отклонений за пределы варьирования физиологической нормы.

      Таблица 3 . 3 . 1

      Влияние хронического введения БАД «Активит Антиоксидант» на показатели общей нелетальной токсичности белых крыс, М ± m


       

      Показатель и единицы

      Контроль

      БАД «Активит-эколоджи»

      Вес тела, г

      212 ± 10

      221 ± 4

      Массовые индексы органов, г/100 г массы тела

      легкие

      5.9± 0.1

      5.9 ± 0.2

      печень

      29.8 ± 1.1

      29.6 ± 1.6

      почки

      7.5 ± 1.2

      7.5 ± 1.5

      селезенка

      4.8 ± 0.09

      5.0 ± 0.2

      сердце

      3.4 ± 0.1

      3.1 ± 0.1

      Показатели мочи

      Белок мочи, мг%

      4.2 ± 0.3

      4.5 ± 0.5

      Удельный вес мочи, г/мм3

      1.001 ± 0.045

      1.030 ± 0.035

      Биохимические показатели крови

      Сахар крови, мг%

      82 ± 6

      82 ± 6

      Белок сыворотки, г%

      7.98 ± 0.19

      8.21 ± 0.20

      Липидный фосфор, ммоль/л

      34.12 ± 0.55

      30.70 ± 0.43

      АлТ, мккат/л

      0.43±0.05

      0.40±0.01

      АсТ, мккат/л

      0.88±0.04

      0.89±0.04

      ЩФ, мккат/л

      0.96 ± 0.16

      0.90 ± 0.17

      Тимоловая проба, ед. помутн.

      1.80 ± 0.21

      1.87 ± 0.17

      Морфологические показатели крови

      Эритроциты, млн./мм3

      6.2 ± 0.08

      6.3 ± 0.08

      Гемоглобин, г%

      11.9 ± 0.1

      12.5 ± 0.4

      Лейкоциты, тыс./мм3

      6.8 ± 0.2

      6.9 ± 0.09

      Физиологические показатели

      СПП, В

      14.1 ± 1.3

      14.3 ± 1.8

      Продолжительность гексеналового сна, мин.

      34.5 ± 2.5

      22.0 ± 2.0*


       

      * — достоверные отличия от контроля при P<0.05

      Патоморфологические исследования проводились на следующий день после последнего введения. По результатам макроскопического исследования изучаемых органов различий между опытными и контрольной группами не установлено. Крысы правильного телосложения, удовлетворительного питания. При наружном осмотре выделений из естественных отверстий не обнаружено. Шерсть блестящая, опрятного вида, очагов облысения не определяется. Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Половые органы самцов развиты правильно, деформации или отека конечностей нет.

      Грудная и брюшная полости выпота не содержали. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей нарушений не представляло. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие.

      Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы овальной формы, бледно- желтого или розоватого цвета, с гладкой поверхностью, тонкой капсулой, не спаяны между собой и подлежащими тканями. Поверхность разреза однородной окраски.

      Щитовидная железа красноватого цвета, обычной величины и формы, умеренно плотной консистенции.

      Тимус треугольной формы, беловатого цвета, умеренно плотной консистенции, обычных размеров.

      Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен. Листки перикарда тонкие, прозрачные, гладкие. Величина и форма сердца изменений не представляют. Левый желудочек сокращен, в правом содержится незначительное количество темной жидкой крови. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие. Мышца сердца на разрезе однородной коричневатой окраски, умеренно плотная.

      Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно- розовой окраски.

      Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка безжелезистой части желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая тела желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая. Слизистая оболочка толстой кишки сероватого цвета, блестящая, гладкая.

      Форма и величина печени изменений не представляли. Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно плотная.

      Поджелудочная железа плоской формы, бледно-розового цвета, дольчатая, умеренно плотной консистенции.

      Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно- красном фоне селезенки видны мелкие сероватого цвета фолликулы.

      Величина и форма почек не изменены. Поверхность почек коричневатого цвета, гладкая, капсула тонкая, прозрачная, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество.

      Надпочечники округлой формы, бледно-желтого цвета, с гладкой поверхностью, умеренно плотные. На разрезе четко видно темноокрашенное мозговое вещество.

      Мочевой пузырь заполнен прозрачной мочой. Слизистая оболочка пузыря гладкая, блестящая, бледной окраски.

      Тело матки самок обычной плотности, величины и формы. Рога матки тонкие, слизистая — блестящая, бледная. Яичники темно-красного цвета, с неровной поверхностью, умеренно плотные. Яички самцов беловатого цвета, обычных размеров и плотности.

      Оболочки головного мозга тонкие, прозрачные. Вещество мозга обычной плотности, поверхность мозга гладкая. На фронтальных разрезах мозга отчетливо выделяются серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет.

      При гистологическом исследовании препаратов легких, миокарда, печени, почек и слизистой желудка подопытных животных дистрофических, воспалительных или некробиотических изменений указанных выше органов не наблюдалось.

      Эпителий альвеол и внутрилегочных бронхов изменений не представлял, альвеолы были воздушными. Ателектазов либо отека легочной ткани не наблюдалось. Поперечная исчерченность миофибрилл миокарда была отчетливой. Строение печени нарушений не представляло. Границы гепатоцитов отчетливые, цитоплазма зернистая, слабобазофильная, ядра светлые с тонкой мембраной и отчетливыми ядрышками. Нефроэпителий имел оксифильную зернистую цитоплазму, ядра были четкими, светлыми. Эпителий слизистой желудка сохранен, главные и обкладочные клетки желез желудка не изменены.

      Таким образом, ежедневное в течение 30 дней внутрижелудочное применение БАД «Активит Антиоксидант» у крыс в дозе 1.0 г/кг не вызывает летальных эффектов, не приводит к значимым изменениям физиологических показателей, не вызывает дистрофических или деструктивных изменений паренхиматозных органов и не сопровождается раздражением слизистых оболочек желудочно- кишечного тракта. По интегральным показателям хронической нелетальной токсичност, БАД «Активит Антиоксидант» не обладает способностью к кумуляции и нетоксична.

    4. Исследование раздражающего действия

      1. Местное действие на кожу

        Действие на кожу и кожно-резорбтивное действие БАД «Активит Антиоксидант» изучалось на белых крысах в соответствии с методическими указаниями «Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнения кожи (методические указания)», № 2162- 79, М., 1980, 23 с.

        Для этого животные (крысы) помещались в специальные домики и их хвосты на 2/3 опускали на 4 часа в водные взвеси, приготовленные из содержимого капсул БАД

        «Активит Антиоксидант». Через 1 и 16 часов после окончания однократной аппликации не отмечалось эритемы или отека кожи хвостов (величина отека измерялась путем измерения толщины хвостов в средней части при помощи толщинометра типа ТР-1-10).

        20-кратная аппликация БАД не вызывала гибели подопытных животных и не выявляла раздражающего действия на кожу в течение 5-дневного срока последующего наблюдения.

        Морфологически кожа хвостов на месте нанесения БАД изменений не представляла. Эпидермис и придатки кожи были без изменений. Слои эпидермиса отчетливо выражены, базальная мембрана сохранена. Эпителиальные клетки наружных и внутренних корневых влагалищ волосяных фолликулов и соединительно- тканная сумка хорошо выражены.


         

        Следовательно, БАД «Активит Антиоксидант» не обладает раздражающим действием на кожу и кожно-резорбтивным действием, т.е. нетоксична при попадании на кожу или при контакте с ней.


         

      2. Действие на слизистую оболочку глаз

        При однократном внесении 2 капель взвеси, приготовленной из содержимого капсул БАД «Активит Антиоксидант» в конъюнктивальный мешок глаза кролика не отмечалось гиперемии, слезотечения или блефароспазма.


         

        Следовательно, БАД «Активит Антиоксидант» не обладает раздражающим действием на слизистую оболочку глаза кролика.

          1. Сенсибилизирующее действие

            Изучение сенсибилизирующего действия БАД «Активит Антиоксидант» проводили в соответствии с методическими рекомендациями на морских свинках. Для этого в кожу наружной поверхности уха морской свинки туберкулиновым шприцем вводили однократно 0.2 мл водного разведения БАД в соотношении 1 : 2, а через 10 дней на предварительно выстриженные участки кожи боковой поверхности спины размером 2х2 см наносили и фиксировали порошок содержимого капсул из расчета 20 мг/см2. Кровь у животных брали через 3 часа после постановки кожных проб. При этом на коже спины не отмечалось признаков раздражения, а в периферической крови — признаков сенсибилизации (эозинофилии или увеличения уровня лизиса в РСЛЛ по сравнению с контролем) (таблица 3.5.1).

            Таблица 3 . 5 . 1

            Влияние введения БАД «Активит Антиоксидант» на показатели сенсибилизирующего действия


             

            Показатели

            Контроль

            Опыт

            Лейкоциты, тыс./мм3

            10.2 ± 0.4

            10.6 ± 0.6

            Эозинофилы,%

            5 ± 0

            6 ± 1

            Лимфоциты, %

            34 ± 3

            35 ± 4

            Моноциты, %

            4 ± 0

            6 ± 1

            Нейтрофилы, %

            54 ± 6

            60 ± 5

            РСЛЛ, % лизиса

            10± 1

            9 ± 1


             

            Следовательно, БАД «Активит Антиоксидант» при эпикутанном контакте не обладает сенсибилизирующим действием, т.е. не провоцирует развитие аллергии.


             

          2. Изучение возможных отдаленных последствий

        Изучение возможного гонадотоксического эффекта проводилось в соответствии с методическими рекомендациями [11] по показателям, обязательным при первичной оценке химических веществ [12]. Изучение мутагенной активности проводили по частоте образования микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга

        (из бедренной кости) белых мышей в соответствии с методическими рекомендациями [13, 14].


         

        Результаты изучения возможных гонадотоксического и мутагенного эффектов в дозе 1 г/кг (вводились 10 дней) через 15 дней после окончания введения представлены в таблице 3.6.1.

        Таблица 3 . 6 . 1

        Показатели гонадотоксичности и мутагенного действия БАД , М± m


         

        Показатель и единицы его измерения

        Контроль

        «Активит Антиоксидант»

        Весовой коэффициент

        гонад крыс-самцов, г/100 г веса тела

        6,98±0,36

        7,01±0,47

        Количество спермиев, 106/мл

        156±25

        186±38

        Продолжительность движения спермиев,мин.

        96±12

        101±4

        Осмотическая резистентность МNaCl

        2,47±0,09

        2,46±0,12

        Число проанализиро-ванных клеток костного мозга мышей

        4200±100

        4200±120

        Частота клеток с микроядрами, %

        0,036±0,004

        0,035±0,012


         

        Они свидетельствуют об отсутствии достоверно значимых сдвигов показателей гонадотоксичности и мутагенности при введении животным БАД.

        Не наблюдалось угнетения сперматогенеза или увеличения частоты мутаций.

        Следовательно, БАД «Активит Антиоксидант» не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию и не оказывает мутагенного эффекта. Это свидетельствует о её безопасности в плане развития отдаленных негативных последствий у человека.

  4. Исследования биологической активности

    1. Измерение антиоксидантной активности in vitro

      Общая антиоксидантная активность БАД определялась по стандартной методике спектрофотометрически с дианидизиновым реактивом и рибофлавином по оптической плотности при длине волны 460 нм.

      Для анализа использовался спектрофотометр СФ-56 (Россия). Результаты представлены в таблице 4.1.1.

      Таблица 4 . 1 . 1

      Общая антиоксидантная активность БАД «Активит Антиоксидант», ед. оп. плот./мг белка


       


       

      Образец

      Показатель антиоксидантной


       

      активности

      Контроль (рибофлавин)

      4.8 ± 0.6

      БАД «Активит Антиоксидант»

      26.1 ± 2.4


       

      Результаты анализа свидетельствуют о том, что БАД «Активит Антиоксидант» обладает высокой антиоксидантной активностью in vitro.


       

    2. Антигипоксическое действие

      Дыхание из замкнутого пространства — рересперация — является достаточно адекватной и простой моделью острой гипоксии [1, 2]. Животное, поглощая кислород из замкнутого пространства вследствие дыхания, вызывает развитие его дефицита — гипоксическую гипоксию, что позволяет оценивать исследуемую БАД по интегральным показателям летальности за определенное время наблюдения и устойчивости к дефициту кислорода (максимальной продолжительности жизни).

      Исследуемую БАД вводили ежедневно per os на протяжении 20 дней белым нелинейным мышам с помощью дозатора с атравматическим наконечником в 10 часов утра в дозе 50 мг/кг (экстраполированная доза на грызунов, исходя из средней рекомендуемой дозы для человека массой 60 кг, принимающего 2 капсулы в день).

      Животные помещались в банку объемом 250 мл, плотно закрытую стеклянной крышкой, смазанной герметиком. Фиксировали с помощью секундомера максимальную продолжительность жизни и симптомы танатогенеза. Банки с животными во время исследования находились в кондиционере, обеспечивающем постоянство условий эксперимента (температура + 20°C, влажность — 65–70%, атмосферное давление). Контролем служили интактные животные.

      После гибели у каждого животного ex tempore получали головной мозг, проводили его гемогенезацию (400 об/мин, 10 ходов пестика) [3] и определяли в гомогенате активность каталазы, уровень диеновых конъюгатов и гидроперекисей липидов[4, 5]. Эти показатели позволяют оценивать также антиоксидантные свойства БАД.


       

      Таблица 4 . 2 . 1

      Эффективность БАД «Активит-эколоджи» в тесте «баночной гипоксии» (M

      ± m)


       


       

      Группы животных

      Показатель

      Продолжительност ь жизни, мин

      Малоновый диальдегид, нмоль/мг белка

      Каталаза, мкмольH2O2/мг мин

      Гидроперекиси липидов, ед. опт. плотности при 480 нм

      Интактные

      2.86 ± 0.30

      9.29 ± 0.62

      0.11 ± 0.009

      Контроль

      31.7 ± 2.4

      5.04 ± 0.48

      3.53 ± 0.51

      0.53 ± 0.05

      БАД «Активит Антиоксидант»

      51.6 ± 1.9*

      3.13 ± 0.23*

      6.56 ± 0.49*

      0.25 ± 0.05*


       

      * — достоверные отличия от контроля при P < 0.05


       

      Оказалось, что БАД достоверно увеличивает время жизни мышей, при этом стабилизировались показатели перекисного окисления липидов (снижались уровни малонового диальдегида и гидроперекисей липидов мозга) и восстанавливалась антиокислительная (каталазная) активность, что свидетельствует об увеличении резервной антиокислительной активности мозга.

    3. Показатели функционального состояния адаптационных систем организма

      Показатели, характеризующие энергетический обмен, обмен липидов и антитоксическую активность организма при назначении БАД «Активит Антиоксидант» мышам в средней терапевтической дозе в течение 20 дней, представлены в таблице 4.3.1.


       

      Таблица 4 . 3 . 1

      Показатели функционального состояния адаптационных систем организма


       


       

      Показатели

      Группы животных

      Контроль

      БАД

      Масса тела, г

      24.8 ± 1.4

      26.1 ± 1.0

      Общие липиды, сыворотка, г/л

      3.6 ± 0.1

      2.8 ± 0.09*

      Холестерин, сыворотка, ммоль/л

      1.75±0.45

      1.12±0.20*

      Билирубин общий, сыворотка, ммоль/л

      3.2 ± 0.3

      2.7 ± 0.4

      -SHгр, сыворотка, мг%

      1670 ± 79

      1539 ± 49

      Восстановленный глутатион, печень, мг%

      166 ± 9

      171 ± 11

      Гликоген, печень, мг%

      2539±100

      2590±150

      Глюкоза, сыворотка, мг

      %

      88 ± 10

      81 ± 12

      Глюкоза, мышцы, мг%

      142 ± 29

      158 ± 24

      АТФ, сердце, мкмоль/г

      2.0 ± 0.2

      2.8 ± 0.1*

      АТФ, мышцы, мкмоль/г

      4.8 ± 0.2

      5.4 ± 0.2*

      Интенсивность тканевого дыхания, сердце,

      мкл О2/100 мг/час


       

      50 ± 5


       

      70 ± 3*

      Интенсивность тканевого дыхания, мышцы,

      мкл О2/100 мг/час


       

      18 ± 3


       

      23 ± 2


       

      * — достоверные отличия от контроля при P < 0.05


       

      Представленные результаты свидетельствуют об адаптационной направленности действия всех изучаемой БАД.


       

    4. Влияние на длительность плавания мышей

      Плавание является тяжелой физической динамической нагрузкой, позволяющей оценить эффективность адаптогенов и активность окислительно-восстановительных процессов в мышцах [6]. Оно осуществлялось с грузом (свинцовая трубка на резиновом кольце, прикрепляемая к корню хвоста), равным 5% от веса тела, при температуре воды 38°–39°C. Критерием утомления и прекращения плавания считали первое «ныряние» с погружением носовых ходов в воду. В большой ванне одновременно плавали по 5 животных из каждой наблюдаемой группы. Тестирование мышей проводили через 20 дней после ежедневного приема БАД (таблица 4.4.1).


       

      Таблица 4 . 4 . 1

      Длительность плавания мышей с грузом после введения БАД «Активит-эколоджи» (M ± m)


       

      Группы животных

      Длительность плавания, мин

      Контроль

      26.3 ± 4.7

      БАД «Активит Антиоксидант»

      43.1 ± 4.4*


       

      * — достоверные отличия от контроля при P < 0.05


       

      Результаты показывают, что БАД «Активит Антиоксидант» увеличивает продолжительность плавания, т.е. оказывает протективное действие и снижает утомляемость.

    5. Влияние БАД на статико-силовую выносливость мышей

      Влияние БАД на статико-силовую выносливость изучали, регистрируя время висения мышей опытных и контрольной групп на вертикальной сетке. Животных тестировали после 20-дневного введения парафармацевтика. Критерием истощения статической силы считали время, когда мышь уже не могла удерживать вес своего тела и падала с сетки вниз (собственный вес мышей составлял в среднем 25 г). Результаты эксперимента представлены в таблице 4.5.1. Они демонстрируют увеличение статической физической выносливости под воздействием изучаемой БАД.


       

      Таблица 4 . 5 . 1

      Физическая выносливость мышей в тесте статической силовой нагрузки собственным весом (M ± m)


       

      Группы животных

      Длительность висения, мин

      Контроль

      20.4 ± 0.4

      БАД «Активит Антиоксидант»

      27.9 ± 0.4*


       

      * — достоверные отличия от контроля при P < 0.05

    6. Эффективность БАД при экспериментальном атеросклерозе

      1. Модель гиперлипидемии

        Гиперлипидемия вызывалась введением тритона wR-1339 в дозе 250 мг/кг здоровым крысам самцам массой 220–240 г внутрибрюшинно однократно. БАД в дозе

        50 мг/кг и препарат сравнения ципрофибрат в дозе 100 мг/кг вводились внутрижелудочно через зонд в течение недели до введения тритона (последнее введение средств — одновременно с введением детергента).

        Кровь у животных получали путем декапитации через 12 часов после введения детергента. В этот период животные были лишены пищи.

        Все лабораторные тесты проводились по стандартным методикам [7]. Общие липиды (ОЛ) определяли унифицированным методом Зольнера, Кирша и Кнайта. Общий холестерин (Х) определяли ферментативным методом Илька, триглицериды (ТГ) — методом Ганделя и Зильверсмит.

        Результаты экспериментов представлены в таблице 4.6.1.1.


         

        Таблица 4 . 6 . 1 . 1

        Показатели липидного обмена у крыс при экспериментальной гиперлипидемии и назначении БАД «Активит-эколоджи» в сравнении с ципрофибратом, М  m


         

        Содержание в сыворотке крови


         

        Интактные

        Гиперлипидемия

        Контроль

        БАД

        Ципрофибрат

        Общие липиды, г/л

        3.4 ± 0.3

        12.5 ± 1.3

        4.9 ± 0.2*

        4.2 ± 0.4*

        Общий холестерин, ммоль/л

        1.4 ± 0.1

        5.7 ± 0.3

        2.6 ± 0.3*

        2.0 ± 0.3*

        Триглицериды, ммоль/л

        2.4 ± 0.09

        20.1 ± 2.4

        5.8 ± 0.3*

        5.5 ± 0.2*


         

        * — достоверное отличие от контроля


         

        Данные, представленные в таблице 4.6.1.1, свидетельствуют, что введение детергента вызывает многократное увеличение в крови общих липидов, холестерина и триглицеридов. Механизм гиперлипидемического действия тритона хорошо изучен и связан с его способностью связывать липиды плазмы крови, образуя мицеллы, изолированные от действия липазы. При этом нарушается обмен липидов между кровью и тканями — дефицит липидов, что по механизму обратной связи

        стимулирует синтез липидов в печени, что и приводит к выраженному увеличению их уровня в крови.

        БАД «Активит Антиоксидант» значительно снижает содержание ОЛ, Х и ТГ в крови, почти не уступая по эффективности ципрофибрату. Механизм снижения, вероятно, связан с торможением синтеза липидов и липопротеидов в печени.


         

      2. Эффективность БАД при экспериментальном атеросклерозе у крыс со специальной диетой

        В качестве модели индуцирования гиперлипидемии и атеросклероза у крыс использовали диету, перенасыщенную жирами [8]. Для этого экспериментальные животные потребляли гомогенный корм следующего состава:


         

        казеин — 5 %;

        подсолнечное масло в смеси со свиным жиром — 40%; глюкоза — 45%;

        агар — 2%;

        соли, витамины — 4%;

        холиевая кислота — 1%;

        тиоурацил — 1%;

        холестерин — 4%.


         

        Кроме этого, крысам дополнительно внутрижелудочно вводили 10% масляный раствор холестерина в дозе 100 мг/кг.

        БАД «Активит Антиоксидант» в дозе 50 мг/кг и ципрофибрат в дозе 100 мг/кг вводили внутрижелудочно за час до введения холестерина на протяжении 1.5 месяцев на фоне указанной выше диеты.

        Интактная группа крыс получала обычную виварную диету.

        Забор крови осуществляли в конце исследования, через 18 часов после последнего введения средств. При этом животные в этот период были лишены пищи.

        Все лабораторные тесты проводились по стандартным методикам [7, 9]. -

        липопротеиды (-ЛП) сыворотки крови определяли турбодиметрическим методом; свободные (неэтерифицированные) жирные кислоты (НЭЖК) — титрометрически, общий билирубин (ОБ) — спектрофотометрически; фосфолипиды (ФЛ) — по содержанию общего фосфора.

        Динамику веса крыс определяли на весах ВЛР-500.

        Забитые декапитацией животные подвергались патологоанатомическому вскрытию, а аорта — гистологическому исследованию.

        Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по Стьюденту- Фишеру.

        Результаты экспериментов представлены в таблице 4.6.2.1.


         


         

        Показатели липидного обмена у крыс

        Таблица 4 . 6 . 2 . 1


         

        при экспериментальном атеросклерозе и назначении БАД «Активит Антиоксидант» в сравнении с ципрофибратом, М  m


         


         

        Содержание в сыворотке крови


         

        Интактные

        Атеросклероз

        Контроль

        БАД

        Ципрофибра т

        Общие липиды, г/л

        3.2 ± 0.2

        5.4 ± 0.4*

        3.5 ± 0.3**

        3.4 ± 0.3**

        Общий холестерин, ммоль/л

        1.5 ± 0.09

        3.1 ± 0.3*

        1.6 ± 0.2**

        1.2 ± 0.1**

        Триглицериды, ммоль/л

        2.7 ± 0.09

        5.0 ± 0.3*

        2.8 ± 0.3**

        2.1 ± 0.2**

        -липопротеиды, г/л

        1.9 ± 0.09

        4.4 ± 0.4*

        1.6 ± 0.2**

        1.4 ± 0.09**

        Билирубин общий, ммоль/л

        3.1 ± 0.3

        5.1 ± 0.2*

        3.5 ± 0.4**

        3.3 ± 0.2**

        Фосфолипиды, ммоль/л

        2.9 ± 0.2

        2.0 ± 0.2*

        2.8 ± 0.1

        3.1 ± 0.2**

        Коэффициент атерогенности, Х/ФЛ

        0.55 ± 0.06

        1.54 ± 0.10*

        0.59 ± 0.05**

        0.41 ± 0.02**

        Масса тела, г

        215 ± 10

        310 ± 13*

        249 ± 13**

        252 ± 8**


         

        * — достоверное отличие от интактных, ** — достоверное отличие от контроля


         

        Полученные результаты подтвердили адекватность использованной модели атеросклероза: в контрольной группе (без лечения) значительно возросло содержание в крови общих липидов, липопротеидов низкой плотности, триглицеридов, холестерина, а содержание фосфолипидов в сыворотке, наоборот, снизилось; увеличился коэффициент атерогенности.

        Вскрытие экспериментальных животных, не получавших лечения, выявило жировые полоски и пятна бледно-желтого цвета на аортах. При этом гистологически определялись атеросклеротические бляшки с ксантомными клетками (рисунок 4.6.2.1).

        В группах животных, получавших сравниваемые средства, наблюдалась нормализация показателей липидного обмена. Они были более активными, без признаков ожирения. Морфологически аорта не отличалась от аорты интактных

        животных. При этом эффективность БАД «Активит Антиоксидант» лишь незначительно уступала эффективности ципрофибрата.

        Таким образом, БАД «Активит Антиоксидант» обладает не только гиполипидемическим действием, но и оказывает антиатеросклеротический эффект.


         


         

        image


         

        Рис. 4.6.2.1. Участок аорты крысы без лечения. Ксантомные клетки в атеросклеротической бляшке. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. 40х7


         

      3. Эффективность БАД «Активит Антиоксидант» при экспериментальном липолизе у крыс

Для стимуляции липолиза белым крысам-самцам массой 200 г внутрибрюшинно вводили адреналин в дозе 1.5 мг/кг.

БАД «Активит Антиоксидант» и ципрофибрат вводили профилактически внутрижелудочно на протяжении недели. Через 2 часа после последнего введения сравниваемых средств крысам был введен адреналин. Через 30 минут после инъекции

адреналина крыс декапитировали, забирали кровь и в сыворотке определяли уровень НЭЖК.

Оказалось, что в механизме гиполипидемического действия БАД определенную роль играет угнетение липолиза.

Таблица 4 . 6 . 3 . 1

Содержание неэтерифицированных жирных кислот в сыворотке крови у крыс при экспериментальном липолизе и применении БАД «Активит Антиоксидант»в сравнении с ципрофибратом, М  m


 

Содержание в сыворотке крови


 

Интактные

Липолиз

Контроль

БАД

Ципрофибрат


 

НЭЖК, ммоль/л


 

0.51 ± 0.04


 

2.40 ± 0.30*


 

1.31 ± 0.12**


 

1.17 ± 0.09**


 

* — достоверное отличие от интактных, ** — достоверное отличие от контроля


 

Полученные результаты свидетельствуют о достаточно высокой эффективности БАД «Активит-эколоджи», практически не уступающей эффективности препарата ципрофибрат (клофибрат) при гиперлипидемии и атеросклерозе. Это позволяет рекомендовать БАД «Активит Антиоксидант» в качестве средства профилактики атеросклероза.


 

    1. Кардио- и нейропротективное действие БАД при алкогольной интоксикации

      1. Материалы и методы исследования

        Для моделирования токсического полиорганного поражения использовали этанол, который вводили в/ж крысам-самцам стандартной массы (160-170 г) через металлический атравматический зонд в дозе 4 г/кг (половина от ЛД50) 3 раза в день на протяжении 5 дней (этанол разводили в дистиллированной воде). БАД «Активит- эколоджи» и начинали вводить в/ж с 6 дня в дозе 50 мг/кг на протяжении 14 дней.


         

        Было сформировано 3 экспериментальные группы:

        1. Интактные животные.

        2. Животные с алкогольной интоксикацией без лечения.

        3. Животные с алкогольной интоксикацией и применением БАД «Активит Антиоксидант».

          Каждая экспериментальная группа включала по 10 животных.

          64

          Об эффективности судили по функциональному состоянию сердца и центральной нервной системы.

          ЭКГ регистрировали во II стандартном отведении на полиграфе RM-6000 (Япония).

          Состояние памяти экспериментальных животных проводили на установке для изучения формирования и регистрации условной реакции пассивного избегания (УРПИ) фирмы Ugo-Basile [10].

          Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по Стьюденту- Фишеру.


           

      2. Результаты исследования

Результаты экспериментов представлены в таблице 4.7.2.1.


 

Таблица 4.7.2.1

Функциональные показатели экспериментальных животных

при интоксикации этанолом и назначении БАД «Активит Антиоксидант», М

 m


 

Показатели и единицы их измерения

Экспериментальные группы

1

2

3

Относительная масса сердца,

мг/100 г массы тела


 

3.5 ±0.2


 

5.2± 0.2*


 

3.6 ± 0.09

ЭКГ, ЧСС, уд/мин

Р, мВ R, мВ S, мВ Т, мВ

PQ, мс QT, мс

529 ±9

553 ±14*

525 ±8

0.13 ±0.01

0.11 ±0.01

0.12 ±0.01

0.81±0.03

0.54 ±0.04*

0.75 ±0.06

0.12 ±0.04

0.06±0.02*

0.12 ±0.04

0.16 ±0.009

0.13±0.02*

0.16±0.01

44 ±0

47 ± 0*

43 ± 2

59±1

64±2

62±2

УРПИ через 2 часа после обучения Латентный период реакции перехода, сек

Время пребывания в светлой камере, сек Время пребывания в темной камере, сек Число обученных животных (% ко всей группе)


 

68±4


 

93±9*


 

75 ±5

78±5

53±5*

79±6

3.5±0.4

10.3±1.4*

3.9±0.4


 

6 (97)


 

2 (50)


 

6 (100)

*–– достоверные отличия от интактных животных при Р < 0,05


 

Клиническая картина в группе крыс, получавших алкоголь без лечения, характеризовалось гиподинамией, некоторой заторможенностью, взъерошенностью шерсти и неопрятностью животных. Они хуже набирали вес, чем остальные крысы.

Страдали функции центральной нервной системы, что проявлялось нарушениями процессов обучения и памяти; развивалась миокардиодистрофия, проявлявшаяся в тахикардии, снижении вольтажа зубцов ЭКГ и нарушении внутрисердечной проводимости.

Применение БАД «Активит Антиоксидант» практически полностью и достоверно нормализовывало состояние и функции сердца и мозга, то есть оказывала кардио- и нейропротекторное действие.

5. Результаты применения БАД «АКТИВИТ АНТИОКСИДАНТ» добровольцами


 

Учитывая, что в состав БАД входят известные метаболиты, применение которых порознь или в комбинациях разрешено Фармакологическим комитетом МЗ РФ, были приготовлены капсулы, содержащие БАД в соответствие с рецептурой № 1 для приема добровольцами из числа разработчиков БАД на протяжении 28 суток.

Результаты применения БАД доказывают отсутствие у нее токсических свойств. БАД при приеме после еды хорошо переносится. Достаточно быстро развивается ее адаптогенный эффект, проявляющийся в улучшении концентрации внимания, снижении метеозависимости, улучшении работоспособности, что в целом способствует достижению поставленных целей и улучшению настроения. Это подтверждается результатами психометрического тестирования, показавшего положительный эффект «Активита-эколоджи» на испытуемых.

Применение БАД ускоряет детоксикацию алкоголя и снижает выраженность неблагоприятных эффектов его злоупотребления.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали безопасность биологически активной добавки к пище «Активит Антиоксидант» (изготовитель — ЗАО «Фармпроект», г. Санкт-Петербург). По результатам санитарно-гигиенических исследований она не содержит вредных и опасных для здоровья веществ, нетоксична (ЛД50 больше 5000 мг/кг), не обладает кумулятивным, раздражающим, кожно-резорбтивным и сенсибилизирующим действием.

В проведенных исследованиях выявлено, что БАД обладает антиоксидантным, антигипоксантным и адаптогенным эффектами, оказывает положительное действие при экспериментальном атеросклерозе, имеет кардио- и нейропротективные свойства. Полученные результаты позволяют рекомендовать БАД «Активит Антиоксидант» органам Госсанэпидемнадзора Минздрава РФ для регистрации в качестве безопасной и эффективной добавки к пище (нутрицевтика с

парафармацевтическими свойствами).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

    1. Руководство по физиологии. Экологическая физиология человека. Адаптация человека к экстремальным условиям среды. Под ред. О.Г.Газенко. М.,

      «Наука», 1979, с. 333–336.

    2. Руководство к практическим занятиям по патологической физиологи. Под ред. О.М. Павленко. М., «Медицина», 1974, с. 174–175.

    3. Tyson C.A., Luman K.D., Stephens R.J Age-related differences in G-SH-shuttle en- zymes in NO2- or O3-exposed rat lungs — Arch. O3. Env. Health, 1982, Vol. 37., No 3, p. 167–176.

    4. Методы исследований в профпатологии. Под ред. О.Г. Архиповой. М., 1988, с. 156–158.

    5. Современные методы в биохимии. Под ред. В.Н. Ореховича. М., «Медицина», 1977, с. 62–64.

    6. Рылова М.Л. Методы исследования хронического действия вредных факторов среды в эксперименте. М.: «Медицина», 1964, 228 с.

    7. Меньшиков В.В., Дилекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследований в клинике. Справочник. М., «Медицина», 1987, 368 с.

    8. Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевти- ческих исследований. Под. ред. Н.В. Лазарева. МедГИЗ, 1954, стр. 54–55, 221– 225.

    9. Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. Минск, «Беларусь», 1976, с. 150–171.

    10. Методические рекомендации. Экспериментальное изучение препаратов с ноотропным типом действия. Ведомости Фарм. Комитета, 1998, 2, с.25-31.

    11. Методы экспериментального исследования по установлению порога действия промышленных ядов на генеративную функцию. МЗ СССР. М., 1969, 25 с.

    12. Методы экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования. Методические рекомендации. МЗ СССР.№1744—, М., 1978, 35 с.

    13. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом. Методические рекомендации. МЗ СССР №28—/10. М., 1984, 21 с.

    14. Критерии оценки и методы прогнозирования отдаленных последствий действия на организм вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Информационное письмо. НИИ гиг.тр.и проф. забол. М., 1985, 15 с.

 

 

 

////////////////////////////