НАРУШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ (УРОЛОГИЯ)

  Главная      Учебники - Медицина     Урология

 поиск по сайту           правообладателям

 

 

 

 

 

 

 



 

 

содержание   ..  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  ..

 

 

Глава 44. Нарушения половой дифференцировки

 


44 Ф- Конте, М. Грумбах

 

НАРУШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ (УРОЛОГИЯ)

Благодаря успехам молекулярной генетики, экспери­ментальной эмбриологии, биохимии стероидных гор­монов, а также новым методам изучения гипотала-мо-гипофизарно-гонадной системы стали во многом понятны механизмы определения пола и половой диф-ференцировки. Нарушения половой дифференцировки могут возникать на любой стадии внутриутробного раз­вития и проявляться в разном возрасте — как сразу по­сле рождения, так и по окончании полового развития.

НОРМАЛЬНАЯ ПОЛОВАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА

Генетический пол

В норме соматические клетки человека содержат 22 пары аутосом и одну пару половых хромосом — XX или XYКа-риотип — это совокупность морфологических характе­ристик полного набора хромосом. Дифференциальное окрашивание позволяет по характерному набору полос идентифицировать каждую хромосому (рис. 44.1). При Q-окрашивании используют флюоресцентный краси­тель акрихин, при G-окрашивании — краситель Гимзы. С-окрашивание применяют для идентификации центро-мерных районов хромосом. Эти методы позволяют без труда выявить Y-хромосому по яркой флюоресценции как в метафазных, так и в интерфазных ядрах (рис. 44.2). Новый метод — флюоресцентная гибридизация in situ — особенно полезен для выявления так называемых мар­керных хромосом, особенно половых хромосом с деле­ниями, которые трудно обнаружить при стандартном окрашивании. В табл. 44.1 приведена номенклатура хро­мосом человека и их некоторых аномалий. Недавно был полностью картирован эухроматический районY-хро­мосомы, образованный примерно 35 млн нуклеотидов.

Как показали экспериментальные исследования и обследование больных с нарушениями половой диффе­ренцировки, половые хромосомы и аутосомы несут ге­ны, определяющие направление половой дифференци­ровки, то есть развитие из индифферентной половой железы яичка или яичника. Для развития яичников не­обходимы две нормальные Х-хромосомы и отсутствие Y-хромосомы (а также генов, определяющих развитие яичка). Для формирования яичек нужны Y-хромосома или район короткого плеча Y-хромосомы, кодирующий фактор развития яичка.

У человека Х- и Y-хромосомы значительно отличают­ся по размеру. Компенсация дозы генов при наличии двр и более Х-хромосом достигается частичной инак­тивацией всех Х-хромосом, кроме одной. Этот случай-

ный процесс наблюдается в каждой клетке на стадии поздней бластоцисты, когда происходит гетерохрома-тинизация материнской или отцовской Х-хромосомы. В результате образуется половой хроматин (тельца Бар­ра), который обнаруживают в интерфазных ядрах, несу­щих две и более Х-хромосомы (рис. 44.3). Ген XISTна­ходится в парацентромерном районе длинного плеча Х-хромосомы (Xql3.2), в предполагаемом центре инак­тивации Х-хромосомы. Предполагается, что с этого ге­на транскрибируется крупная РНК, которая каким-то образом связывается с Х-хромосомой и обеспечивает ее инактивацию.

Дистальный участок короткого плеча Х-хромосомы не инактивируется и включает короткий район (2,5 млн нук­леотидов), гомологичный району на дистальном участке короткого плеча Y-хромосомы. Этот район назван псев-доаутосомным. Именно псевдоаутосомные районы Х- и Y-хромосомы подвергаются конъюгации и кроссинго-веру во время мейоза, обеспечивая обмен генетическим материалом. В псевдоаутосомных районах Х- и Y-хро­мосомы обнаружено по крайней мере 7 генов. Среди них MIC2(кодирует антиген CD99, распознаваемый мо-

Рисунок 44.1. Нормальный кариотип 46,XY. После окрашива­ния красителем Гимзы видны G-полосы. Каждой хромосоме присущ характерныйнабор полос. Grumbach MMConte FA: Disorders of sex differentiationIn: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

 

 

 


 



 

 


 


Рисунок 44.2. Флюоресцентная микроскопия (
Q-окрашивание). Яркая флюоресценция позволяет обнаружить Y-хромосому как в метафазных, так и в интерфазных ядрах. АМетафазные хромосомыБИнтерфазные хромосомы. Grumbach MM, Conte FA: Disorders of sex differentiation. In: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

 

антителом 12Е7), ген гранулоцитар-но-макрофагального колониестимулирующего факто­ра, ген рецептора ИЛ-3 и ген низкорослости SHOXЭтот ген экспрессируется в костях. У гетерозигот его присут­ствие проявляется низкорослостью и дисхондростеозом. У гомозигот развивается мезомелическая дисплазия типа

Рисунок 44.3. Половой хроматин (тельце Барра) в ядре клетки слизистой щеки здоровой женщины (кариотип 46,ХХ). Gram-bach MM, Conte FA: Disorders of sex differentiation. In: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

Лангерадля которой характерна диспропорциональная карликовостьПсевдоаутосомными районами являются также дистальные участки длинного плеча Х- и Y-хромо-сомы. В них обнаружен только один ген (рис. 44.4 и 44.5). В соскобах со слизистой щеки у здоровых женщин (кариотип 46,ХХ) в 20—30% интерфазных ядер обнару­живают половой хроматин, который отсутствует у здо­ровых мужчин (кариотип 46,XY). При полисомии по Х-хромосоме число телец Барра в диплоидном ядре на единицу меньше числа Х-хромосом. Подсчет телец Бар­ра и Q-окрашивание хромосом используют для опреде­ления числа и типа половых хромосом (табл. 44.2).

Определение пола

За последние 20 лет изучено несколько белков, которые предполагались на роль фактора развития яичка, коди­руемого геном на Y-хромосоме. Экспериментальные исследования и клинические наблюдения не подтвер­дили, что этим фактором являются антиген H-Yи бе­лок, содержащий цинковые пальцы. При исследовании лиц с кариотипом 46,XX и мужским фенотипом и транс­локацией небольшого участка с Y- на Х-хромосому был обнаружен новый ген, расположенный тотчас прокси­мально от псевдоаутосомного района на коротком ме­че Y-хромосомы (рис. 44.5). Этот ген был клонировани назван геном SR У (sex determining region Y — ген опреде­ления пола). У мышей ген Sry (аналог гена £ЛУчелове-ка) экспрессируется в половых тяжах между 10-ми и 12-ми сутками эмбриогенеза, то есть непосредственно перед развитием и в начале развития яичка. Делеции и точечные мутации гена SRYобнаруживают у 15% лице кариотипом 46,XY и женским фенотипом при чистой дисгенезии гонад. В том, что именно ген 57?Укодирует фактор развития яичка, больше всего убеждает то, что встраивание в геном клеток мышиных эмбрионов с ка­риотипом 40 ,ХХ гена Sry приводит к рождению самцов,


 

 

Таблица 44.1. Номенклатура хромосом человека и их некоторых аномалий



 

Международная цитогенетическая номенклатура хромосом человека (ISCN, 1995)

Описание

Старая номенклатура

46,ХХ


 

Нормальный женский кариотип

XX

46.XY


 

Нормальный мужской кариотип

XY

47.XXY


 

Трисомия по половой хромосоме (47 хромосом, допол­нительная Х-хромосома)

XXY

45,Х


 

Моносомия по Х-хромосоме

хо

45,X/46,XY


 

Мозаицизм (клетки с кариотипами 45,Х и 46,XY)

X0/XY

Р


 

Короткое плечо хромосомы

Р

Ч l,X,del(X)(p21)


 

Длинное плечо хромосомы

Делеция короткого плеча Х-хромосомы дистально от по­лосы Хр21

q

ХХр-

46,X,del(X)(q21)


 

Делеция длинного плеча Х-хромосомы дистально от по­лосы Xq21

XXq-

|,X,i(XqlO)

46,X,r(X)(p22q25)46,XY,der(7)t(Y;7)(ql1

;q!3)

Изохромосома по длинному плечу Х-хромосомы (qlO — центромерная полоса)

Кольцевая Х-хромосома с разрывами по Хр22 и Хр25Транслокация дистального флюоресцирующего участка Y-хромосомы на длинное плечо 7-й хромосомы

XXqi

XXr 46,XYt(Yq-7q+)

Grumbach MM, Conte FA: Disorders of sex differentiation. In: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

Фактор развития яичка — ДНК-связывающий белоксодержащий домен из 80 аминокислотсхожий с доме­нами HMG-белков (high mobility gel proteins — белкиобладающие высокой подвижностью при электрофоре­зе в геле). Этот домен связывается с участком ДНК с по­следовательностью А/ТАСААТ, изгибая молекулу ДНК и влияя на транскрипцию других генов. Почти все из­вестные на сегодняшний день мутации, обнаруженные улиц с кариотипом 46,XY и женским фенотипом при чистой дисгенезии гонад, затрагивают ген SRYna уча­стке, кодирующем ДНК-связывающий домен фактора развития яичка.

Число генов, участвующих в развитии яичка, точно не известно (рис. 44.6, А). Гетерозиготные мутации и де-леции гена WT(ген нефробластомы 1,11р13) приводят к порокам развития мочевых путей и половых органов и нефробластоме. У мышей выключение гена Wtl приво­дит к апоптозу клеток метанефрогенной ткани и, следо­вательно, отсутствию почек и половых желез. Таким об­разом, являясь регулятором транскрипции, ген WT1обеспечивает развитие мочевых путей и половых орга­нов, действуя на самых ранних его этапах.

Ген FTZFкодирует внутриклеточный рецептор NR5A1 (так называемый стероидогенный фактор 1) и также уча­ствует в регуляции транскрипции. Он экспрессируется в половых тяжах эмбрионов как мужского, так и женского пола, а также во всех тканях, где происходит синтез сте­роидных гормонов. Ген FTZFнеобходим для синтеза тестостерона, в клетках Сертоли регулирует экспрессию гена, кодирующего фактор регрессии мюллеровых про­токов. Выключение гена Ftrfl у мышей приводит к апо-

птозу клеток половых тяжей. В результате у животных обоего пола отсутствуют половые железы и надпочечни­ки. Таким образом, ген FTZFиграет ключевую роль в формировании всех стероидпродуцирующих желез — надпочечников, яичек и яичников.



 

Таблица 44.2. Определение числа и типа половых хро-

мосом по числу телец Барра и наличию Y-хромосом в

интерфазных

ядрах соматических клеток

Половыехромосомы

Число в диплоидной соматической клетке

Тельце Барра

Y-хромосома

45 ,Х

0

0

46,ХХ

1

0

46,XY

0

1

47,ХХХ

2

0

47,XXY

1

1

47,XYY

0

2

48,ХХХХ

3

0

48,XXXY

2

1

48,XXYY

1

2

49,ХХХХХ

4

0

49.XXXXY

3

1

49,XXXYY

2

2

а Число телец Барра в диплоидных соматических ядрах на едини­цу меньше числа Х-хромосом. Число флюоресцирующих Y-хро­мосом равно числу Y-хромосом в кариотипе. Grumbach MM, Conte FA: Disorders of sex differentiation. In: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

 

 


 



 

 


 


Рисунок 44.4. Схема расположения 
G-полос и некоторых генов на Х-хромосоме. ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальныи колониестимулирующий фактор. Grumbach MMConte FADisorders of sex differentiationIn: Wilson JD et al. (eds): Williams Text­book of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

 

У лиц с дупликацией района короткого плеча Х-хромо­сомы Хр21 наблюдается чистая дисгенезия гонад 46,XY (женский фенотип при мужском кариотипе). Ген, распо­ложенный в этом районе, был назван геном DAX(ген до-зозависимой смены пола). Этот ген кодирует внутрикле­точный рецептор NR0B1. Делеции или мутации этого гена приводят к врожденной гипоплазии надпочечников с первичным гипогонадизмом. При этом половые железы у лиц с кариотипом 46,XY дифференцированы по муж­скому типу. Между тем у мышей с кариотипом 40,XY дуп­ликация гена Ahch (гомолог ВАХТ) при наличии слабых аллелей гена Sty приводит к дифференцировке половых желез по женскому типу. Дупликация данного гена у осо­бей с кариотипом 40,XX не нарушает дифференцировку половых желез. Таким образом, именно дупликация гена

DAXобеспечивает дозозависимую смену пола у человека, Поскольку мутации гена Ahchприводящие к потере его функции, не влияют на развитие яичников и фертиль-ность у самок мышей, считается, что кодируемый им внутриклеточный рецептор скорее играет роль фактора, подавляющего развитие яичек, нежели фактора, опреде­ляющего развитие яичников (рис. 44.6, Б).

Кампомелическая дисплазия — это заболевание, при котором наблюдаются пороки развития скелета и чис­тая дисгенезия гонад 46,XY. Оно развивается при мута­циях гена SOX(17q24.3-q25.1). Этот ген кодирует один из HMG-белков, сходных с фактором развития яичка на 60% гомологичен гену SRYУлиц с кариотипом 46.XY и делециями короткого плеча 9-й и длинного плеча 10-й хромосом наблюдается дисгенезия гонад и мух-

 


 


Рисунок 44.5. Схема расположения 
G-полос и некоторых генов на Y-хромосоме. ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. Grumbach MMConte FADisorders of sex differentiationIn: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

 

псевдогермафродитизм, что указывает на участие расположенных здесь генов в половой дифференциров-ке(рис. 44.6, Б).

Дифференцировка половых желез

Половые железы остаются индифферентными до 42-х су­ток эмбриогенеза (длина эмбриона 12 мм). К этому време­ни из экстрагонадного источника — дорсальной энтодер­мы желточного мешка в них мигрируют 300—1300 пер­вичных половых клеток. Эти крупные клетки — пред­шественники оогониев и сперматогониев — абсолютно необходимы для развития яичника, но не яичка. Под влиянием гена 57? Ги других генов, определяющих поло­вую дифференцировку по мужскому типу (рис. 44.6, Б), на 43—50-е сутки эмбриогенеза формируется яичко. Клетки Лейдига появляются примерно к 60-м суткам, а мужские наружные половые органы становятся разли­чимы на 65—77-е сутки эмбриогенеза.

Яичники развиваются гораздо позже — на 77—84-е су­тки эмбриогенеза. В эти сроки, когда у мужских эмбрио­нов яички уже сформированы, большинство оогониев (образуются при митотическом делении первичных поло­вых клеток) вступают в профазу Iделения мейоза и пре­вращаются в ооциты I порядка. Так начинается развитие яичника. На 90-е сутки эмбриогенеза становятся разли­чимы примордиальные фолликулы — ооциты I порядка, окруженные одним слоем гранулезных клеток, лежащих на базальной мембране. В отличие от яичек яичники в эмбриогенезе не секретируют гормоны (рис. 44.7).

Дифференцировка половых протоков

Дифференцировка половых протоков схематично пред­ставлена на рис. 44.8. К 7-й неделе у эмбриона появля-

ются закладки мужских и женских половых протоков. Из мюллеровых протоков (если они не регрессируют) формируются маточные трубы, тело и шейка матки, а также большая часть влагалища. У мужского эмбриона вольфовы протоки дают начало придатку яичка, семя-выносящим и семявыбрасывающим протокам и семен­ным пузырькам. При наличии функционально активно­го яичка происходит регрессия мюллеровых протоков. Она обусловлена секрецией фактора регрессии мюлле­ровых протоков — димерного гликопротеида, который синтезируется клетками Сертоли. Этот фактор вызыва­ет регрессию мюллерова протока только на той же сто­роне, где он синтезируется. Дифференцировку вольфо-вых протоков регулирует тестостерон, секретируемый яичками. При наличии яичника или функционально неактивного яичка вольфовы протоки дегенерируют, а мюллеровы протоки развиваются. Для синтеза тесто­стерона необходим ген FTZF1, продукт которого связы­вается с промоторами генов, кодирующих 20,22-десмо-лазу и 17а-гидроксилазу.

Ген фактора регрессии мюллеровых протоков находит­ся на коротком плече 19-й хромосомы и кодирует белок, состоящий из 560 аминокислот. С-концевая последова­тельность этого белка гомологична последовательности трансформирующего фактора роста р и (3-субъединице ингибина и активина. Секреция фактора регрессии мюл­леровых протоков продолжается в клетках Сертоли до 8—10 лет, поэтому он может служить маркером наличия клеток Сертоли. Экспрессию гена фактора регрессии мюллеровых протоков регулирует внутриклеточный ре­цептор NR5A1 — продукт гена FTZF1. Ген, кодирующий рецептор фактора регрессии мюллеровых протоков, былклонирован (12ql3). Этот рецептор принадлежит к се­мейству рецепторов типа II трансформирующего факто­ра роста р и сходных с ним белков.

 

 

 


 


 

ются по женскому типу (рис. 44.10). Для развития муж­ских наружных половых органов необходимы тестосте­рон и особенно его производное дигидротестостерон, образующийся под действием 5а-редуктазы. У мужских эмбрионов источником тестостерона являются клети Лейдига. Сначала они, вероятно, секретируют тестосте­рон автономно, затем под влиянием ХГ, еще позже -под влиянием ЛГ, секретируемого гипофизом плода. Дифференцировка наружных половых органов и моче­полового синуса по мужскому типу происходит поддей-

 

 

Рисунок 44.6. Схема последовательного включения генов в развитии яичек и секреции гормонов при половой дифференцировв по мужскому типу. ФМРП — фактор регрессии мюллеровых протоков; DAX1 — ген, кодирующий внутриклеточный рецептор NR0B1, дупликация этого гена подавляет экспрессию SR Y и, следовательно, развитие яичек; FTZF1 — ген, кодирующий внутри­клеточный рецептор NR5A1 (так называемый стероидогенный фактор 1); SOX9 — ген семейства Sox, кодирующий один из HMG-белков, сходных с фактором развития яичка; WT— ген нефробластомы 1. Grumbach MM, Conte FA: Disorders of sex differentiation. In: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th edSaunders, 1998.

Дифференцировка наружных половых органов

Дифференцировка наружных половых органов схема­тично представлена на рис. 44.9. До 8-й недели эмбрио­генеза наружные половые органы у эмбрионов обоего пола имеют одинаковое строение. Развитие женских наружных половых органов не зависит от наличия яич­ников, поэтому при наличии тяжевидных гонад или аге-незии гонад наружные половые органы дифференциру-



 

 


 


Рисунок 44.7. Половая дифференцировка в эмбриогенезе. Обращает на себя внимание, что развитие яичка опережает дифферен-цировку всех остальных структур. 
Grumbach MM, Conte FA: Disorders of sex differentiation. In: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology,9thedSaunders, 1998.

 

ствием дигидротестостеронаДигидротестостеронкак и тестостеронсвязывается с внутриклеточным белко­вым рецептором клетки-мишениОбразовавшийся ком­плекс с высокой аффинностью связывается со специ­фическими участками ДНК, запуская транскрипцию. Витоге под влиянием андрогенов синтезируются белки, которые регулируют пролиферацию и дифференциров-ку клеток. Ген, кодирующий внутриклеточный андроге-новый рецептор, расположен в парацентромерном уча­стке длинного плеча Х-хромосомы (рис. 44.4). Таким образом, действие андрогенов зависит о генов, располо­женных на Х-хромосоме.

Как уже было сказано, для формирования мужских наружных половых органов необходима андрогенная стимуляция начиная с ранних стадий эмбриогенеза. Следует сказать, что дифференцировка наружных поло­вых органов по мужскому типу возможна только при на­личии дигидротестостерона и внутриклеточных андро­геновых рецепторов. Дигидротестостерон стимулирует рост полового бугорка, слияние мочеполовых складок и губно-мошоночных складок с формированием полово­го члена и мошонки. В то же время андрогены тормозят образование влагалища. Существует критический пери­од в реализации эффектов андрогенов. После 12-й не­дели эмбриогенеза губно-мошоночные складки уже не срастаются, несмотря на выраженную андрогенную стимуляцию. Рост полового члена при этом происходит. Причины нарушения дифференцировки наружных по­довых органов по мужскому типу: 1) нарушение синтеза

или секреции тестостерона или его превращения в ди­гидротестостерон, 2) дефицит или дефект андрогеновых рецепторов, 3) нарушение синтеза и действия фактора регрессии мюллеровых протоков. Вирилизация наруж­ных половых органов у плодов женского пола возможна при избытке эндогенных или экзогенных андрогенов, особенно до 12-й недели эмбриогенеза.

Психосексуальное развитие

Психосексуальное развитие означает формирование пси­хологического пола, который объединяет четыре поня­тия: 1) формирование половой идентичности, 2) поло-ролевое поведение, или модель социального поведения, отличающая женщину и мужчину в соответствии с уста­новленными в данном обществе традициями, 3) половую ориентацию, то есть выбор полового партнера, 4) осо­бенности мышления и восприятия.

В последние 30 лет господствовала теория, согласно которой половая идентичность формируется после ро­ждения в результате взаимоотношений с окружающим миром. Недавно эта точка зрения была оспорена. Со­гласно работам ряда авторов, действие андрогенов во внутриутробном периоде и экспрессия генов, располо­женных на Y-хромосоме, определяют половую иден­тичность у больных с наружными половыми органами промежуточного типа. Ранее предполагалось, что фор­мирование половой идентичности происходит к возрас­ту 18—30 мес. Сейчас считается, что эта возрастная гра-

 

ница сильно размыта. Это подтверждается следующим фактом. При наличии нарушений развития вторичных половых признаков, особенно при недостаточности 5а-редуктазы, смешанной дисгенезии гонад, недоста­точности 17р-гидроксистероиддегидрогеназы, больные даже в период полового развития могут захотеть сме­нить пол с женского на мужской. Чтобы дать более гиб­кие рекомендации по психосексуальному воспитанию


 

играют выбор пола, в котором будет воспитываться ре­бенок, психологическое и социальное подкрепление этого выбора в грудном и детском возрасте, а также его подкрепление эндогенными или экзогенными (замес­тительная терапия) стероидными гормонами во время полового развития. Огромную роль играют также дли­тельное наблюдение и психологическая поддержка боль­ных и их родственников.

Рисунок 44.8. Дифференцировка половых протоков. А. Индифферентная стадия. Б. Развитие женских половых протоков. Остатки первичной почки и вольфовых протоков образуют придаток яичника, околояичник и гартнеров канал. В. Развитие мужских половых протоков до опускания яичек в мошонку. Единственное произ­водное мюллерова протока — привесок яичка. Предстательная маточка формируется из мочеполового синуса. Conte FA, Grambach MM: Abnormalities of sexual

determination and differentiation. In: Greenspan FS, Strewler GJ (eds): Basic and Clinical Endocrinology, 5th ed. Appleton Lange, 1 997.

 

 


 



 

Рисунок 44.9. Дифференцировка наружных половых органов. Grambach MM, Conte FA; Disorders of sex differentiation. In: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

 




 



 


при нарушениях половой дифференцировки, необхо­димы дальнейшие исследования половой идентично­сти, полоролевого поведения и половой жизни больных с половыми органами промежуточного типа. До получе­ния этих данных следует сказать, что, согласно имеюще­муся опыту психосексуального воспитания большие наружными половыми органами промежуточного типа, основную роль в формировании половой идентичности

Рисунок 44.10. Схематическое изображение этапов половой дифференцировки у человека. Grambach MM, Conte FA: Disordersof sex differentiation. In: Wilson JD et al. (eds): Williams Textbook of Endocrinology, 9th ed. Saunders, 1998.

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  60  61  62  63  64  65  66  67  68  69  70  ..